基于实时定量测序和分离培养技术分析不同绍兴黄酒酒药中的功能微生物

杨晨，刘双平,2,3，赵禹宗，朱莹，韩笑，毛健,2,3*

1(江南大学 食品学院 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，江苏 无锡，214122) 2(国家黄酒工程技术研究中心(浙江古越龙山绍兴酒股份有限公司),浙江 绍兴,312000) 3(江南大学(绍兴)产业技术研究院,浙江 绍兴,312000)

绍兴黄酒作为黄酒的代表，与葡萄酒和啤酒一样，是世界上最古老的饮料之一[1]。传统黄酒酿造利用酒药、麦曲等发酵剂中多种有益微生物参与糖化发酵，利用微生物提供的水解酶，如蛋白酶、淀粉酶等，分解大米和小麦中的大分子并产生相应的代谢物共同构成了黄酒独特的色、香、味和风格[2-3]。酒药，又名小曲、白药、酒饼，是以米粉为原料，辣蓼草为辅料，通过接种陈年酒药进行菌种传代制成的，是中国黄酒酿造中一种独特的糖化发酵剂，具有糖化发酵力强，用药量少，生产方法及设备简单等优点[4]。酒药作为传统黄酒的重要原料，是黄酒酿造过程中重要的动力源，赋予绍兴酒独特的品质，酒药微生物对黄酒的发酵过程具有至关重要的作用[5]。

传统发酵剂的生产通常是在开放且复杂的工作环境中手工制作而成，其局限性在于不同批次发酵剂的质量特征不稳定，进而影响酒的品质[6]。对于白酒大曲而言，地理因素和环境生长条件的差异形成了独特的小麦原料微生物区系，这些微生物为大曲微生物群落的演化带来更多的可能性，进而影响功能微生物的代谢以及白酒的品质[7]。CHEN等[8]从属水平对比了绍兴地区Dongfang、Tapai等6个酒厂酒药微生物的组成，其中片球菌(39.20%)、肠杆菌(16.06%)、魏斯氏菌(8.83%)、克雷伯氏菌(5.04%)、埃希氏杆菌(3.64%)、嗜碳芽孢杆菌(1.65%)、阪崎肠杆菌(1.53%)、苍白杆菌(1.35%)和青枯菌(1.04%)相对丰度均超过1%；真菌以根霉属(36.08%)和酵母菌属(34.08%)为优势微生物，不同微生物最终会影响酒的品质。毛青钟[9]发现，黄酒酒药中的微生物主要包括霉菌、酵母和细菌。霉菌主要有根霉、红曲霉、黄曲霉、黑曲霉、毛霉、犁头霉和青霉等；酵母菌有扣囊覆膜酵母属、酿酒酵母属、假丝酵母属、汉逊氏酵母属等；细菌主要包括乳酸菌(乳球菌、乳杆菌)、丁酸菌、醋酸菌、芽孢杆菌等。

当前与黄酒酒药相关的研究以及对酒药种水平微生物群落及菌种特性研究甚少，探究不同酒厂酒药核心微生物组成及特性，对于研究酒药对黄酒品质的作用具有重要意义。本研究采用理化指标测定、单分子实时定量测序技术及微生物功能分析，研究绍兴不同酒厂酒药样品的理化指标、微生物群落及特性差异，旨在阐明不同酒厂酒药核心微生物种水平群落结构及其菌种特性，为未来酒药机械化生产及保持传统绍兴酒品质的稳定提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

采用2020年传统绍兴酒生产使用的成品酒药，取自于绍兴地区4个大型代表性手工黄酒厂，编号SYH，TP，JH，CYY。理化指标测定样品密封并记录样品信息后保藏于-80 ℃冰箱，用于后续样品酶活力测定、测序相关研究；微生物筛选样品密封并记录样品信息后保藏于4 ℃冰箱，用于后续研究。

1.2 主要培养基

1.2.1 微生物筛选培养基

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH(7.0±0.1)，用去离子水定容至1 L。

YPD培养基(g/L)：胰蛋白胨10，葡萄糖20，酵母浸出粉5，pH 6.8，用去离子水定容至1 L。

MRS培养基(g/L)：蛋白胨10，牛肉浸粉5，酵母浸粉4，葡萄糖20，K2HPO42，柠檬酸三铵2，醋酸钠5，MgSO40.2，MnSO40.05，吐温80 1，pH(6.2±0.2)，用去离子水定容至1 L。

高氏一号培养基(g/L)：可溶性淀粉20，KNO31，NaCl 0.5，K2HPO40.5，MgSO40.5，FeSO40.01，琼脂15，pH(7.3±0.1)，用去离子水定容至1 L。

1.2.2 指示微生物培养基

产蛋白酶培养基(g/L)：鱼粉蛋白胨10，酵母浸出粉10，葡萄糖20，脱脂乳粉20，NaCl 1，琼脂18，pH 6.6，用去离子水定容至1 L。

产淀粉酶培养基[10](g/L)：鱼粉蛋白胨10，酵母浸出粉10，可溶性淀粉20，琼脂18，pH 6.8，用去离子水定容至1 L。

产酸-LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，溴碘酚紫0.05，pH(7.0±0.1)，用去离子水定容至1 L。

产酸-YPD培养基(g/L)：胰蛋白胨10，葡萄糖20，酵母浸出粉5，溴碘酚紫0.05，pH(6.8±0.1)，用去离子水定容至1 L。

1.3 仪器与设备

SW-CJ-1 CCV超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；DF-101 KS恒温加热磁力搅拌器，郑州恒岩仪器有限公司；FE 20 pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；KC/HWS-250 PY恒温恒湿培养箱，上海凯测实验设备有限公司；GZX—9146 MBE电热鼓风干燥箱，上海博迅实业有限公司；HYL-C 3组合式摇床，苏州太仓市强乐实验设备有限公司；SynergyH 1全功能酶标仪，美国Bio-RAD公司；ABI GeneAmp®9700型PCR仪，赛默飞世尔科技公司；QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统，Promega公司。

1.4 实验方法

1.4.1 理化指标测定

水分含量采用烘干法测定，参照GB 5009.3—2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；酸度测定参照GB 12456—2021《食品安全国家标准 食品中总酸的测定》；液化力测定参考文献[11]，糖化力及酸性蛋白酶活力测定参考《工业酶制剂通用实验方法》。

1.4.2 高通量测序

1.4.2.1 DNA提取、扩增与检测

采用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒方法对酒药样本的基因组进行提取，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA。利用带有barcode的特异性引物对总DNA进行扩增，其中，PCR聚合酶采用：TransGen AP221-02的TransStart FastPfu DNA Polymerase；使用AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，利用Tris-HCl洗脱DNA，再利用2%琼脂糖电泳进行检测。最后，PCR产物用QuantiFluorTM-ST进行检测定量，按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。

1.4.2.2 文库构建与上机测序

将DNA用Megaruptor打断，使用Bluepinpin筛选10 kb以上的片段，经末端修复和加A尾后，加barcode，检测片段长度，随后把带有不同barcode的样本按照等摩尔数混合，加接头、模板纯化、使用Qubit进行浓度检测，完成DNA文库的制备。在 PacBio Sequel II上使用Grandomics中的Sequencing Primer V4和Sequel II Binding Kit 2.1进行测序。如果扩增片段≥3 kb，则试剂盒为2.0版本。测序得到的原始数据，存在一定比例的干扰数据，为了使信息分析的结果更加准确、可靠，首先对原始数据进行质控，得到有效数据。基于有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类和物种分类分析。根据97%一致性阈值进行OTUs聚类，对OTUs进行丰度及多样性分析。

1.4.3 酒药微生物的筛选、鉴定及特性分析

取若干个250 mL锥形瓶，装入50 mL生理盐水和若干个玻璃珠，121 ℃灭菌20 min后待用。在超净工作台中，称取5 g酒药粉末加入锥形瓶中，充分振荡摇匀作为原液，并对原液进行10-1～10-7不同梯度稀释。吸取10-3～10-5稀释液100 μL涂布于筛选平板，细菌于恒温恒湿培养箱37 ℃培养48 h，真菌于28 ℃培养48 h。待长出菌落后，进行分离纯化，获得单一菌株。

DNA的提取使用SDS-CTAB法[12]。细菌采用16S rDNA鉴定，使用通用引物27-F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492-R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′；真菌采用ITS鉴定，引物为ITS1-F:5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′和ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。扩增后于上海生工送样测序，结果见表2和3。

为研究不同微生物产酸、淀粉酶和酸性蛋白酶活力差异，将菌株分别涂布于相应的培养基，细菌于恒温恒湿培养箱37 ℃培养48 h，真菌于28 ℃培养48 h。观察平板上菌落的生长情况以及菌落周围的透明圈大小，酶活力指数(enzymatic activity index，EI)为水解圈直径与菌落直径的比值[13]。

1.5 数据分析

采用Origin 2018和SPSS 21软件进行数据处理和分析。采用ANOVA方差分析与差异显著性检验，采用Origin软件进行图像处理。所有实验均重复3次，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 不同酒厂酒药的微生物群落结构分析

利用SMRT-seq技术对不同酒厂成品酒药进行微生物群落结构分析，从种水平进行微生物组成分析，共鉴定出231种细菌和110种真菌，其中种水平相对丰度在1%以上的优势细菌共有21种，优势真菌共有9种。

SYH酒厂酒药细菌共有3个属相对含量大于1%，主要为片球菌属(Pediococcus，51.53%)、魏斯氏菌属(Weissella，9.56%)；种水平如图1-a显示，以戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，44.66%)、食窦魏斯氏菌(Weissellacibaria，7.20%)、片球菌属其他(Pediococcusother，5.20%)等为主。TP酒厂酒药细菌共有5个属相对含量大于1%，主要为片球菌属(Pediococcus，42.24%)、肠杆菌属(Enterobacter，14.10%)；种水平如图1-a显示以戊糖片球菌(P.pentosaceus，36.27%)、肠杆菌属其他(Enterococcusother，12.75%)、片球菌属其他(Pediococcusother，4.35%)等为主。JH酒厂酒药细菌共有6个属相对含量大于1%，主要为魏斯氏菌属(Weissella，52.41%)、片球菌属(Pediococcus，12.85%)、乳球菌属(Lactococcus，4.61%)；种水平细菌以食窦魏斯氏菌(W.cibaria，43.98%)、戊糖片球菌(P.pentosaceus，11.67%)、乳球菌属其他(LactococcusOther，4.48%)为主。CYY酒厂酒药细菌共有7个属相对含量大于1%，主要为魏斯氏菌属(Weissella，26.63%)、伴突菌属(Sodalis，6.50%)、片球菌属(Pediococcus，3.87%)；CYY酒厂酒药种水平则以食窦魏斯氏菌(W.cibaria，17.92%)、伴突属其他(SodalisOther，6.50%)，融合魏斯氏菌(W.confusa，5.90%)等为主。可以发现4个酒厂主要细菌中均含有片球菌属(Pediococcus)及魏斯氏菌属(Weissella)，但相对含量有一定差异。不同酒厂酒药的细菌群落结构有明显差异，TP酒厂酒药肠杆菌属(Enterobacter)细菌含量相对于其他酒厂较高，JH酒厂酒药中乳球菌属(Lactococcus)细菌含量较高，CYY酒厂酒药伴突菌属(Sodalis)细菌含量较高。不同的微生物具有不同的功能特性及代谢产物，因此会对酒药的理化指标产生一定影响。

相比于细菌群落结构，真菌的种水平结果如图1-b显示，SYH酒厂酒药以扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera，73.53%)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，7.08%)、异常威克汉姆酵母(Wickerhamomycesanomalus，5.01%)等为主；TP酒厂酒药以扣囊复膜酵母(S.fibuligera，64.74%)，少根根霉(Rhizopusarrhizus，15.58%)，小孢根霉(Rhizopusmicrosporus，9.55%)等为主；JH酒厂酒药以扣囊复膜酵母(S.fibuligera，63.38%)、少根根霉(R.arrhizus，9.83%)、东方伊萨酵母(Issatchenkiaorientalis，8.96%)等为主；CYY酒厂酒药则以扣囊复膜酵母(S.fibuligera，76.67%)、光滑假丝酵母(Candidaglabrata，7.93%)、酿酒酵母(S.cerevisiae，5.11%)等为主，可以看出真菌群落结构较为稳定，扣囊复膜酵母(S.fibuligera)在4个厂区中均是相对丰度最高的真菌。不同厂区酒药微生物群落结构的差异，可能是由于通常生产中曲的制作方式是生料制曲、开放式发酵，在制作过程中会受到生产环境、环境微生物以及人为因素等的影响，推测不同的发酵环境对细菌影响较大，对真菌影响较小，这些条件共同影响曲的质量及微生物种群结构，进而影响到酒产品的品质[14]。

a-细菌；b-真菌图1 不同酒厂酒药微生物群落结构Fig.1 Microbial community structure of Jiuyao in different wineries

2.2 不同酒厂酒药的理化指标分析

不同的微生物群落结构会对理化指标产生一定影响，而理化指标的改变也会进一步影响微生物的群落结构，微生物群落和理化指标的相互作用，形成了稳定的发酵系统，因此探究不同酒厂酒药的理化指标(表1)具有重要意义。

表1 酒药理化指标Table 1 Physicochemical indicators in Jiuyao

4个酒厂成品酒药含水量在11%～15%，其中JH酒药水分含量显著高于其他酒厂(P<0.05)，酒药水分含量一般控制在11%左右，不同酒厂酒药水分含量存在差异可能是由于不同酒厂酒药制作工艺及干燥时间略有差异，水分含量的差异可能会导致最终成品酒药中的微生物组成存在差异[15]；微生物生长过程中会代谢产生酸性物质使酒药表现为酸性，如乳杆菌属(Lactobacillus)、肠杆菌属(Enterobacter)等[16]。酒药酸度在13～35 g/kg，TP和JH的酸度较高(P<0.05)，SYH的酸度较低(P<0.05)，这可能是因为不同酒厂的酒药中的微生物群落差异导致的(图1-a)，SYH酒厂片球菌属丰度为51.53%，丰度远高于其他酒厂，但酸度较低，可能是片球菌属的产酸能力较低；而TP酒厂酒药中的肠杆菌属(Enterobacter)和JH酒药中的乳球菌属(Lactococcus)相对含量较高，可能是这2个属的细菌具有较高的产酸能力。酒药液化酶活力在0.4～1.4 U/g，TP和JH酒厂的液化酶活力较高(P<0.05)，SYH和CYY的液化酶活力较低；糖化酶活力约在100～200 U/g，各酒厂糖化酶活力没有显著差异；酒药酸性蛋白酶活力在80～200 U/g，其中以SYH的酸性蛋白酶活力最高，为(190.08±26.74) U/g(P<0.05)，TP最低为(86.43±10.03) U/g，这可能和真菌微生物的组成差异相关(图1-b)，SYH和CYY酒厂酒药除了扣囊复膜酵母(S.fibuligera)外，酿酒酵母(S.cerevisiae，5.11%)含量相比于其他酒厂酒药较高，因此推测酿酒酵母对酒药酸性蛋白酶活力具有一定贡献。

曲粉中的微生物可以通过自身菌体或分泌的酶将糊化原料分解产生小分子糖如麦芽糖和葡萄糖，不仅可以为后续微生物生长提供营养物质，也供发酵阶段产生乙醇和香味物质[17]。在生产中，较高的酶活力表明起罐和发酵效率较高，可以促进发酵的进行[18]。因此，微生物具有的功能特性，对黄酒品质具有重要影响。

2.3 酒药微生物筛选及功能分析

分析不同酒厂酒药的微生物群落结构差异，结合酒药的酶活力相关指标可以确定酒药中的戊糖片球菌(Pediococcus)、肠杆菌属(Enterobacter)、乳球菌属(Lactococcus)等细菌，扣囊复膜酵母(S.fibuligera)、酿酒酵母(S.cerevisiae)等真菌可能为促进酒药品质提升的功能微生物，分离得到相关微生物能够强化提升酒药品质。通过传统的筛选方法，从酒药中分离出71株微生物，包括44株真菌，27株细菌(表2和表3)。这些微生物约占细菌微生物群的27%～60%，真菌微生物群的60%～90%。其中异常威克汉姆酵母(W.anomalus)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、扣囊复膜酵母(S.fibuligera)和戊糖片球菌(P.pentosaceus)的分离比例最高，其他微生物如融合魏斯氏菌(Weissellaconfusa)的分离比例较小。除此之外，SMRT-seq分析中未检出的异常毕赤酵母(Pichiaanomala)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)等也在传统筛选中被鉴定出来。这些菌株可能只在酒药微生物中占很小比例，在基因组提取或PCR扩增过程中丢失了序列信息[19]。

表2酒药真菌功能分析Table 2 Analysis of the function of Jiuyao fungi

当微生物的酶活指数(EI)≥2.0时，该微生物被认为是潜在的产酶菌株[20]，微生物特性分析结果表明，4株扣囊复膜酵母(S.fibuligera)的EI值可达到2.4～2.7，可能在酒药中的扣囊复膜酵母首先分解米粉中的淀粉，为酒药中微生物生长提供营养，促进酿酒酵母等其他酵母的生长；酸性蛋白酶活性中酿酒酵母(S.cerevisiae)Y30菌株EI值为2.09，扣囊复膜酵母(S.fibuligera)Y35的EI值为2.00，酸性蛋白酶可以溶解颗粒状原料并从颗粒上释放被吸附的α-淀粉酶，也可以分解原料、死菌菌体蛋白生成的氨基酸，为酵母菌的生长提供能量[21]；此外，研究表明霉菌也是影响发酵剂淀粉酶和蛋白酶活性的主要因素[19]。因此，占微生物群比例最高的扣囊复膜酵母对酒药的淀粉酶和蛋白酶活性贡献最大；酿酒酵母对酸性蛋白酶活性有一定贡献，验证了SYH和CYY酒厂酒药酸性蛋白酶活性相对于其他酒厂酒药较高的原因。本次筛选出较多异常威克汉姆酵母，结果显示大多数异常威克汉姆酵母都具有较高的产酸能力。研究表明异常威克汉姆酵母在培养过程中可产酯类、醇类和有机酸类等风味物质，对香气的形成起着重要作用，常常作为白酒酿造、发酵食品的重要功能微生物[22]，可在后续对异常威克汉姆酵母对黄酒风味的影响进行下一步研究。酿酒酵母也具有一定的产酸能力，不同的酿酒酵母因其独特的代谢方式可以直接影响发酵过程中有机酸的分泌，有机酸作为发酵食品中酸味的重要组成部分，与发酵食品的质量评价和品质管理有着密切的关系[23-24]。

如表3所示，细菌中，共筛选出11株戊糖片球菌，研究表明戊糖片球菌可以抑制许多食源性病原体在食物中的繁殖，如李斯特氏菌等[25]。仅有1株戊糖片球菌产酸，验证了SYH酒厂片球菌属丰度较高，但酸度较低的原因；大部分乳杆菌具有产酸能力，但细菌均不具有淀粉酶和蛋白酶活性。推测酒药中的产酸微生物在酒药制作过程中具有一定抑菌作用，可以抑制有害微生物生长。综上所述，酒药中不同微生物共同作用，形成一个稳定的环境，不仅保证了其中核心微生物的生长，也保证了酒药的功能特性。

表3酒药细菌功能验证Table 3 Analysis of the function of Jiuyao bacteria

3 结论与讨论

本文对不同酒厂酒药进行微生物群落结构、理化因子分析并筛选主要功能微生物。结果表明，不同酒厂酒药在细菌群落结构有一定差异，但真菌群落结构较为稳定，以扣囊复膜酵母(Saccharomycopsisfibuligera)为优势微生物(相对丰度大于63%)。在理化指标方面存在一定差异，其中JH酒药水分含量明显高于其他酒厂(P<0.05)，TP和JH酒厂酒药的酸度和液化酶活力较高(P<0.05)，各酒厂糖化力没有显著差异，SYH酒厂酒药的酸性蛋白酶活力最高(P<0.05)。从酒药中筛选鉴定出71株微生物，包括44株真菌，27株细菌。对微生物进行功能性分析发现大多数微生物都具有产酸能力，推测这些微生物可以为酒药发酵提供一个酸性环境，抑制有害微生物的生长；扣囊复膜酵母具有较强的淀粉酶和蛋白酶活性，能够分解酒药中的营养物质，为微生物的生长提供能量。因此，占微生物群比例最高的扣囊复膜酵母是酒药酵母中淀粉酶和蛋白酶的主要贡献者。总的来说，本研究解析了不同酒厂酒药核心微生物种水平群落结构及其菌种特性，阐明扣囊复膜酵母在酒药中的关键作用，对保持传统绍兴酒品质稳定及实现酒药机械化生产具有重要意义。