美极梅奇酵母冷冻干燥复合保护剂的优化研究

孙康，李军，张鸣宇，朱凤妹，葛超，阎贺静

(河北科技师范学院 食品科技学院，河北 秦皇岛 066600)

冷冻干燥菌剂具有活性高、稳定性强以及能有效预防变质和污染细菌等优点[1-2]。为提高冷冻干燥过程中细胞的存活率，通常加入保护剂以提高细胞对外界压力的抵抗力[3]。海藻糖、脱脂牛奶、蔗糖、乳糖、葡聚糖、麦芽糖、甘露醇、麦芽糊精、阿拉伯胶和淀粉等糖和碳水化合物以及蛋白质被广泛应用于细胞的冻干过程[4]。但单一保护剂对细胞的保护作用非常有限，需要其他保护剂的协同作用来提高细胞的存活率[5]。因此，在细胞冻干过程中通常添加复合保护剂，以达到冷冻过程中对细胞更好的保护作用[6-7]。POLOMSKA等[8]研究发现，冻干假丝酵母时，采用脱脂奶粉、海藻糖和谷氨酸钠作保护剂比仅使用脱脂奶粉作为保护剂酵母存活率提高了60%。

美极梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima，Mp)是一种常见的非酿酒酵母，普遍存在于成熟葡萄浆果表面和葡萄酒发酵初级阶段[9]。Mp与酿酒酵母混菌发酵，具有降低葡萄酒酒精含量、增加甘油含量[10]、改善葡萄酒的风味和品质[11-12]、促进红葡萄酒色泽稳定性[13]等良好酿造特性[14-15]。因此，其在果酒酿造中具有非常广泛的应用前景。我国酿造菌剂的研发远落后于国外相关研究，且国内果酒酿造菌剂主要依赖进口。所以，专一性菌剂的缺乏，是导致国内葡萄酒同质化问题严重、口感寡淡缺乏特色的关键。因此，开发高效菌剂是提升果酒风味和品质的关键，也是提升果蔬精加工产品附加值的重要手段。为了促进Mp发酵剂的商业化及推广其广泛应用，有必要开展高稳定性及高存活率Mp菌剂的制备方法和技术等相关研究。目前虽已有文献报道了异常汉逊酵母(Hansenulaanormala)和马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)等少数非酿酒酵母冷冻干燥保护剂的研究[6,16]，并对保护剂的保护机理进行了初步探讨，为非酿酒酵母冷冻干燥菌剂的开发提供了参考。但研究发现，不同物种甚至同一物种的不同菌株在真空冷冻干燥及其储存期间表现出不同的行为[17]。因此，目前有关非酿酒酵母冷冻干燥菌剂及其保护剂的开发还需要开展广泛的研究。同时，有关Mp菌剂的开发及其冷冻复合保护剂的研究还鲜见报道。

本研究采用Plackett-Burman试验设计法筛选出对Mp冷冻干燥具有显著保护作用的保护剂，结合最陡爬坡试验和响应面分析法(response surface method,RSM)进一步优化保护剂复合配方，以期最大限度提高该酵母在冷冻干燥过程中的存活率，为未来实现Mp发酵剂工业化的制备和应用提供参考，也为其他酵母冷冻干燥保护剂的研究和开发提供一定的研究基础和参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美极梅奇酵母(Mp 01)，由河北科技师范学院酿酒工程实验室保藏。

YPD液体培养基(g/L)：酵母浸粉 10、蛋白胨 20、葡萄糖 20，121 ℃灭菌20 min。

YEPD固体培养基(g/L)：酵母浸粉 10、蛋白胨 20、葡萄糖 20、琼脂 20，121 ℃灭菌20 min。

2．客户平台。在面向未来时，我们首先需要预知可能的威胁，也就是我们最大的竞争对手是谁？我们真正的竞争对手不是所谓的面授班，真正的竞争对手到现在真的是变成了抖音、快手，客户每天花多长时间在快手、抖音上面？又会有多长时间花在“管院在线”上？面临这种现状，我们的在线学习平台该怎么搞？在市场竞争中，超越对手的是质量服务。我们要继续坚持产品定位的高端路线，坚持课件系统化、专业化，坚持精益管理、服务至上等理念，以一流的产品、服务引领市场，超越对手。

实验根据Box-Benhnken模型的中心组合原理，主要采用Design-Expert 8.0.6中Plackett-Burman、RSM进行试验设计、数据分析及模型的建立，差异显著性水平为0.01和0.05。

1.2 仪器与设备

FDU-1 200 EYELA真空冷冻干燥机，北京五洲东方科技发展有限公司；低温离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SW-CJ 系列洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；数显立式压力蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BS-2F数显恒温振荡培养箱，金坛区水北科普实验仪器厂。

课件显示：通过抽签选斜板，丁丁的波波球直接从接近直角的斜板上滚下来；当当的波波球在呈45度角的斜板上滚下来；铃铃的波波球在呈15度角的斜板上滚下来。结果出来后引起一番争执。

1.3 实验方法

1.3.1 美极梅奇酵母生长曲线及菌体收集时间的确定

菌种的活化：适量挑取斜面菌种接种于100 mL YPD液体培养基中，28 ℃、150 r/min振荡培养24 h，得活化种子液，并用血球计数板计数。

将活化的酵母种子液以1.0×106CFU/mL 的接种量接入150 mL YPD培养基中，28 ℃、150 r/min振荡培养，每隔3 h取样，测定其OD600值。以未接种的培养基为空白对照，以培养时间为横坐标，OD600值为纵坐标绘制Mp 01生长曲线，每个样品设置3个重复。

1.3.2 美极梅奇酵母菌液离心条件的确定

根据1.3.1确定的Mp 01生长曲线，在酵母减速生长末期及平衡期初期收集酵母菌体，通过考察不同离心力(2 184、2 852、3 610、4 457×g)及不同离心时间(3、5、10、15、20 min)对酵母收集率的影响，确定适宜离心转速和离心时间。

1.3.3 酵母活菌计数方法

离心后收集菌泥，加入与离心菌液等体积的生理盐水对菌体进行复溶。取离心前菌液及离心后菌泥用生理盐水复溶后的菌液[17]，采用稀释涂布法确定活菌数，存活率计算如公式(1)所示：

中国出口贸易的爆炸性增长，不仅与我国改革开放政策的制定有关，更与国际分工的演化有关，但不管哪个原因，最终都导致我国贸易顺差额的逐年扩大。需要注意的是，尽管我国通过加工贸易获得了大量的贸易顺差，但该顺差的大部分却来自于从事加工贸易的外资企业，该顺差中真正能够为中国所用的部分甚至连一半都不到。因此，现行的贸易统计制度在测算一国贸易利益时，存在着一定的缺陷，一些学者也不断尝试改革现行的贸易统计制度，以更好地测算各国贸易利益分配的问题。

(1)

根据1.3.6的方法，进行Plackett-Burman(PB)试验因素与水平设计[19,22]，考查以上6种冷冻保护剂成分(脱脂乳粉、谷氨酸钠、海藻糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖)中，对Mp 01冷冻干燥过程中的存活率具有显著影响作用的因素，PB设计结果见表2，试验结果见表3，各因素效应分析见表4。

在建筑的建造过程中，十分重视对建筑朝向的选择，注重建筑物的采光情况，建筑物的不同朝向获得的太阳辐射差异不同，需要利用BIM技术分析建筑物的朝向。例如，利用BIM能耗分析技术可以对比不同朝向方案的能耗情况，帮助建筑设计人员确定建筑的朝向情况，然后建立模型进行分析，将建筑模型转化为建筑能量模型。

贵阳市南明区花果园片区，位于贵阳市中心区域，人流量大，车况复杂，为有效解决行人过街问题，需修建大量人行天桥，其中遵义中路与延安南路交叉口的B联，由于上跨延安南路（宽45m）且道路两侧情况复杂，导致桥梁设计跨度为62.68mm，桥下净空高6m，桥面长度和宽度分别为63.68m和6.0m，另外，在该天桥两端，还需要设置两道人行扶梯。该人行天桥结构安全等级为一级，地震设防烈度为Ⅵ度，设计荷载如下：桥面活荷载为3.5kN/m2，二期恒载均为3.2kN/m2；桥顶雨棚活载和恒载分别为0.5kN/m2、1.7kN/m2；风压标准值为 0.4kN/m2。

1.3.4 冷冻干燥方法

将离心后的菌泥放入无菌冻存管中，菌泥与保护剂按1∶2的体积比混合，放入-80 ℃冰箱预冻4 h。提前开启冻干机，待冷阱温度达到-40 ℃时，将处理好的MP 01立即放入冻干机，真空冻干24 h。采用稀释涂布法计算冷冻干燥前后的活菌数[18]，如公式(2)所示：

为保证SBS改性沥青混合料拌和稳定性，本项目选用间歇式拌和机进行沥青混合料的拌和，由于SBS改性沥青黏度较普通基质沥青高，因此在拌和SBS改性沥青混合料时，一般会增加5～10s的拌和时间，以确保SBS改性沥青能够均匀裹覆在集料上。另一方面，由于SBS改性沥青所需的拌和温度较高，因此在实际施工过程中应严格控制沥青混合料的拌和温度，既要避免温度过低影响路面铺筑质量，另一方面还要防止温度过高引起沥青混合料老化。

(2)

式中：N3，冻干粉复溶后的活菌数；N4，初始活菌数。

1.3.5 不同保护剂对酵母存活率的影响

单因素试验：选取海藻糖、蔗糖、乳糖、维生素C、谷氨酸钠、甘氨酸、麦芽糖、脱脂乳粉、吐温-80作为单一冷冻干燥保护剂，以上保护剂的浓度参照文献报道[3,5,7-8]，分别设定质量分数为3%、5%、7%、9%、11%，以存活率作为检测指标初步筛选冻干存活率积极影响作用比较显著的因素和水平，进行Plackett-Burman(PB)试验设计。试验设计及结果见表1。

精密称取同一批六棱菊药材粉末1.0 g，精密称定，共 6 份，按“1.3.5”项下的方法制备成供试品溶液，按“2.2”项的条件测定，计算六棱菊橙皮苷平均含量为 0.782 3 mg／g，其 RSD 为 2.86%，小于 3%，表明该方法重复性良好。

1.3.6 Plackett-Burman试验

根据1.3.5的试验结果，确定保护剂种类，每个因素设置高、低2个水平，使用Design-Expert 8.0.6设计n=12的PB测试[19]，筛选对Mp 01存活率有显著影响作用的保护剂成分。

2.6.1 复合保护剂响应面试验结果

根据DU等[20]的方法，对Plackett-Burman试验结果确定的显著影响因素进行最陡爬坡试验，分析对Mp 01冻干存活率具有显著影响作用的因素，并进一步确定显著影响因素的最佳水平范围。

（2）健壮性。健壮性又称鲁棒性，是指软件对于规范要求以外的输入能够判断出这个输入不符合规范要求，并能有合理的处理方式。软件健壮性是一个比较模糊的概念，却是非常重要的软件外部量度标准。

危重患者营养支持治疗中药学监护模式的探索与实践…………………………………………………… 周 欣等（19）：2684

根据1.3.6的实验结果，采用Design-Expert 8.0.6进行Box-Behnken Design(BBD)响应面分析，确定Mp 01最优冻干保护剂的配比[21]。

1.3.9 数据处理与统计分析

桑塔亚那有言：“生和死是无法挽回的，唯有享受其间的一段时光。死亡的黑暗背景对托出生命的光彩。”临终关怀事业作为崇高的“晚霞工程”，不仅在一定程度上减轻病人和家属的负担，更重要的是，它体现了对人的尊严的维护，是社会发展的必然需要，而我们相信，中小城市的临终关怀事业即使正在遭受重重阻碍，仍具有光明的发展前景，必定会在逐步的探索中取得长足进步。

葡萄糖、蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限公司；脱脂乳粉，山东亿宝莱生物科技有限公司；谷氨酸钠和海藻糖，河南万邦实业有限公司；麦芽糖，成都市科龙化工试剂厂；蔗糖，天津市风船化学试剂科技有限公司；乳糖、甘氨酸、维生素C，上海源叶生物科技生物有限公司；吐温-80，阿拉丁。

2 结果与分析

2.1 美极梅奇酵母生长曲线

由Mp 01的生长曲线可知(图1)，在接入菌种后的0～6 h为酵母生长的迟滞期，9～18 h为酵母的对数生长期，21 h左右进入稳定期(平衡期)，菌体量逐渐达到最大值，综合考虑菌龄和菌体量，本试验在发酵的第24 h进行菌体收集。

图1 美极梅奇酵母生长曲线Fig.1 Growth curve of M. pulcherrima

2.2 离心条件对美极梅奇酵母收集率的影响

将收集的Mp 01菌体在不同条件下进行离心，并计算Mp 01的收集率，结果如图2所示。离心转速和时间对菌体收集率有明显影响，随着转速和时间的延长，离心收集率先增大再减小，在15 min时，收集率最高；20 min时降低，随着时间的延长，离心力对酵母细胞的破坏影响增大，细胞死亡率增大，导致收集率下降。最终确定，2 852×g离心15 min，Mp 01的收集率最高为93.55%，为本试验最佳离心条件。

图2 美极梅奇酵母在不同离心力及 时间下的离心存活率Fig.2 Survival rate of M. pulcherrima under different centrifugal force and time

2.3 单一保护剂对美极梅奇酵母冻干存活率的影响

综合文献报道结果，优选9种物质(表1)作为Mp 01冷冻干燥过程中的单一保护剂。由表1数据可知，9种单一保护剂对Mp 01具有不同保护作用。其中脱脂乳粉、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠和乳糖等6种物质作为单一保护剂时，Mp 01的存活率相对较高，存活率最高分别能达到64.9%，76.88%，77.3%，80.7%，70.92%，70.8%。因此，选择以上6种保护剂进行显著影响因素分析。

表1 不同保护剂种类及浓度对美极梅奇酵母冻干存活率的影响 单位：%

2.4 Plackett-Burman试验设计及显著影响因素

式中：N1，沉淀复溶液中的活菌数；N2，初始活菌数。

对试验结果进行效应分析(表4)，发现本次PB试验模型的P值为0.044 0，说明此模型在0.05水平上足以拟合试验数据。表4中麦芽糖、蔗糖和海藻糖的效应值均为正，说明对Mp 01存活率有显著正作用，

表2 Plackett-Burman设计因素与水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman design

表3 Plackett-Burman试验设计及结果 单位：%

表4 Plackett-Burman试验设计各因素效应分析Table 4 Effect analysis of Plackett-Burman experiments design

而其余因素作用效果不显著(P>0.05)。因此，麦芽糖、蔗糖和海藻糖是对Mp 01冷冻过程中具有显著保护作用的保护剂，需进一步确定这3种显著因素的最佳添加水平和配比。

2.5 最陡爬坡试验设计与结果

将表7中数据进行二次多元回归拟合分析，获得Mp 01的菌体存活率对麦芽糖、蔗糖和海藻糖的二元多项式回归方程：

表5 最陡爬坡试验设计及结果 单位：%

实验结果表明，麦芽糖、蔗糖和海藻糖分别以13%、10%和14%(表5，试验号5)进行配比时，对Mp 01的保护效果最好。因此，进一步将表5中的第5组试验中的3因素及其水平确定为响应面优化研究的试验中心组合。

2.6 响应面法优化美极梅奇酵母冻干复合保护剂配比

1.3.7 最陡爬坡试验

根据最陡爬坡试验结果(表5)，使用Design-Expert 8.0.6对麦芽糖、蔗糖和海藻糖进行三因素三水平响应面优化设计。响应面具体设计方案和试验结果如表6所示，方差分析如表7所示。

本试验利用最陡爬坡试验，对显著影响因素麦芽糖、蔗糖和海藻糖的浓度范围和配比进行优化，以对Mp 01冻干过程达到最好的保护作用。最陡爬坡试验设计中，3个因素的变化方向的效应均为正效应(表4)，因此最陡爬坡试验设计中以上3因素的水平均为正向变化，从低值往上增加。具体结果见表5。

Y/%=93.35+3.71A+2.69B+2.00C-1.16AB-3.50AC-3.07BC-4.27A2-5.38B2-5.17C2

1.3.8 美极梅奇酵母冻干保护剂复合配方的优化试验及验证

以某种口径火炮为研究对象，考虑到膛内时期身管后坐对发射过程的影响较小，为此简化数值计算模型，不考虑身管后坐的影响，建立其弹炮耦合有限元模型有限元模型中。其中，弹带与弹体之间采用面面绑定约束，装药与弹体，弹带、弹丸定心部与身管接触设置。弹带挤进过程中会自身接触，因此，弹带采用自接触设置，动摩擦系数为0.1。图1为正常未磨损的身管内膛结构，图2为试验测得的身管内膛磨损曲线，图3为根据图2的磨损量建立的身管内膛磨损的有限元网格模型，图4为弹带有限元网格模型，图5为弹炮耦合有限元网格模型。

由表7可知，P<0.000 1，说明此模型在α=0.01的水平上回归显著；失拟项P值为0.058 9>0.05，

表6 美极梅奇酵母菌存活条件优化Box-Benhnken 设计方案及结果 单位：%

表7 响应面试验回归方程方差分析Table 7 Analysis of variance of regression equation

2.6.2 冷冻保护剂最优组合配方及验证实验

依据响应面优化设计，通过对回归模型进行数学分析，得到的Mp 01最优冻干保护剂配方：麦芽糖130 g/L、蔗糖100 g/L和海藻糖140 g/L，在此条件下Mp 01存活率预测值为93.34%。将所得最优保护剂配方应用于Mp 01的冷冻干燥，重复3次，Mp 01的平均存活率为92.78%，与预测值相差0.56%。以上结果说明，由响应面试验设计得到的数学模型准确可靠，得到的最佳冻干保护剂组合方案可行，在实际操作中具有指导意义。

洞庭湖所面临的发展挑战很大，对策和机制的设定需要落实，只有首先统一好一系列制度，才能联动湿地旅游业的建设开发，才能具体落实行动。统一好管理与服务人员对生态经济区湿地旅游业的管理服务能力，才能打造一个良好的景区的招牌。只有集结众人力量去落实湖区环境的保护，才有湿地旅游业的发展。当洞庭湖区人民的生活不断改善，问题都得到有效解决，人民才既能坐拥金山银山、又能共享绿水青山，那时洞庭湖生态经济区必然已是秀美富饶的新经济增长状态。

对企业基层党建政工工作的人员，要严格选择。首先要注重工作人员的综合能力，需要党建政工工作人员的政治思想觉悟高，同时自身的道德素养也要十分优秀，同时思想政治教育的能力也要强。通过对现有基层党建工作人员进行有效培养，每年分层分批对党务政工干部进行轮训，增强他们的工作能力，锻炼他们的专业素质，提升他们的工作热情，使他们积极参与到基层党建工作中。加强党务政工干部与经营管理干部轮岗，注重从党务政工干部中选拔培养经营管理干部，畅通党务政工干部成长通道。

2.6.3 美极梅奇酵母发酵剂贮藏条件及稳定性测定

对Mp 01冻干菌剂贮藏条件进行研究，实验结果见表8，确定贮藏条件后，对其稳定性进行持续观察，结果见表9。

表8 美极梅奇酵母贮藏条件结果 单位：%

表9 美极梅奇酵母发酵剂贮藏稳定性检验结果Table 9 Result of M. pulcherrima starter storage stability test

通过对美极梅奇酵母菌剂贮藏条件的研究发现，冻干菌剂在-20 ℃条件下贮藏，其存活率远高于室温和4 ℃条件，对贮藏稳定性的研究发现，在-20 ℃条件下保存4个月仍具有较高的存活率(89.85%)，说明在此条件下贮藏冻干菌剂具有较好的稳定性。

3 结论与讨论

酵母的代谢和生理特征存在种间和种内差异，现阶段并没有普遍而有效的方法用于酵母冻干过程的保护。因此，对于不同的酵母，有必要开展针对性的冻干工艺，并优化最佳保护剂的配方，以促进其商业生产和广泛应用。本研究前期筛选出的美极梅奇酵母Mp 01具有纤维素酶、果胶酶和β-葡萄糖苷酶等多种水解酶活性，有利于提高水果果皮花色素苷及果皮中品种香气成分的释放，对果酒酿造过程中果酒的澄清及增香具有非常重要的影响作用。因此本研究开展了Mp 01冷冻干燥保护剂的优化研究，以期为该酵母的广泛应用及Mp商业菌剂的制备提供研究基础和方法学参考。首先通过评估9种单一保护剂对Mp 01冷冻干燥过程的保护作用，发现脱脂乳粉、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、谷氨酸钠和乳糖等6种保护剂对Mp 01具有较好保护作用，进一步通过Plackett-Burman试验法，发现麦芽糖、蔗糖和海藻糖对Mp 01的保护作用最为显著，最后通过最陡爬坡试验和响应面法，确定了Mp 01冷冻干燥复合保护剂配方(麦芽糖130 g/L、蔗糖100 g/L和海藻糖140 g/L)，结果表明，Mp 01冷冻干燥后的平均存活率达到92.78%，比单一保护剂最高存活率提高了16%左右。

已有研究发现，糖醇类物质是酵母冷冻干燥过程中的有效保护剂[4]，本研究也验证了这一结论。在本研究中，对Mp 01具有显著保护作用的保护剂均为糖醇类。对二糖、多元醇、单糖、脱脂乳和其他有机分子提高微生物的稳定性的研究发现，干燥过程中碳水化合物通过形成玻璃态来提高细胞的稳定性[23]。例如：海藻糖由于玻璃态的形成，可以置换水与脂质和蛋白质形成的氢键，从而稳定了微生物的细胞膜，减轻冷冻干燥对细胞的损伤[3]。同时，本研究发现蔗糖是影响Mp 01冻干过程存活率的显著影响因素之一，这与CARVALHO等[24]的研究结果一致，他们发现不能代谢的糖比代谢的糖更有效。N’GUESSAN等[25]也有类似的研究结果，在生产用于啤酒酿造的酵母发酵剂时发现，蔗糖是冻干过程中最好的保护剂。因此，结合本研究结果以及以上分析表明，海藻糖和蔗糖很有可能是非酿酒酵母尤其是Mp通用的效果良好的冷冻保护剂，后续需要开展更广泛和深入的研究，已验证以上推测。

一般来说，单一保护剂的作用是有限的，存在各自的缺点，但这些缺点可通过其他保护剂来弥补[5]，因此，复合保护剂的研究和开发，对于提高酵母冻干菌剂的稳定性和活性尤为重要。由于菌种之间存在种间和种内的差异性，同时不同类型的保护剂对不同种类细胞的存活率的影响不同，所以冷冻干燥中保护剂及其配方需要根据菌种进行特定筛选、优化和改善。目前，有关Mp 01贮存期间的存活率以及该菌株的存活动力学及其在果酒酿造中的应用评价试验正在进行中，使用优化后的复合保护剂冻干的Mp 01，-20 ℃保藏30 d后，存活率为91.85%，保留了原存活率的99.51%，贮藏4个月后，仍具有较高的存活率(89.85%)，表现出较好的贮藏稳定性，说明此复合保护剂对Mp 01的低温贮藏具有很好的保护作用。此外，该复合保护剂是否适用于其他Mp、酿酒酵母、其他非酿酒酵母及酿酒酵母和Mp混菌发酵菌的开发，需要进一步的研究和验证。