氟比洛芬酯预处理对大鼠窒息性心搏骤停后脑损伤和生存率的影响

董天鑫 张云鹏 曹雪峰 刘秀兰 郭淑娟 李艳

(1承德医学院附属医院麻醉科，河北 承德 067000；2承德市双滦区妇幼保健院麻醉科)

心搏骤停过了黄金5 min后，大脑就会因为再灌注导致的继发性多器官紊乱而出现不可逆损伤〔1,2〕，这是因为脑神经元在缺氧后丧失了恢复正常功能的能力。神经元的信号传导建立在脑神经元胞外和胞内间隙之间的Ca2+、Na+和K+交换的基础上，因此消耗大量以三磷酸腺苷(ATP)为形式的能量。在心搏骤停后无氧代谢为主要形式，ATP产量非常低，乳酸和H+水平升高，细胞内Ca2+和Na+过度累积。长时间的细胞内Ca2+超载导致线粒体通透性增加，导致细胞色素C从线粒体释放，进而激活caspase-3，参与细胞凋亡，最终细胞出现不可逆死亡〔3,4〕。以上就是心搏骤停之后的脑细胞死亡过程。

目前对于心搏骤停之后脑细胞的保护，有一定的研究进展。其中比较成熟的是低温保存，其原理在于保护离子泵的功能，降低神经毒性〔5,6〕。此外，阿片肽类药物也是常用的缺氧性脑损伤的保护药物，其原理在于阿片类药物可降低环磷酸腺苷(CAMP)水平，从而阻断Na+通道能力〔7,8〕。临床研究也证实，阿片类药物预处理在急性缺氧后可以保护许多器官和组织的细胞完整性，包括：肠〔9〕、心肌〔10〕和脑〔11〕等，因此用于器官移植前的预处理。此外，心搏骤停诱导的脑缺血会造成脑组织的炎症反应，而脑缺血再灌注后白细胞和血管内皮细胞黏附分子的表达会导致中性粒细胞向内皮细胞迁移和黏附，造成脑组织损伤和神经功能缺损〔12〕。既往研究表明，氟比洛芬酯的使用可减轻大鼠短暂性脑缺血再灌注导致的损伤，其原理可能与氟比洛芬酯对于环氧化酶(COX)-2通路的抗感染作用影响及对于线粒体相关蛋白合成增加有关〔13〕。本研究通过窒息性心搏骤停大鼠模型观察吗啡或氟比洛芬酯预处理对大鼠血流动力学、酸碱状态、脑损伤和早期存活的影响。

1 资料与方法

1.1实验动物 本研究共使用成年雄性SD大鼠45只，体重350～400 g，由承德医学院实验动物中心提供，实验均在该实验动物中心进行。大鼠饲养在常规条件下〔温度(25±2)℃；相对湿度(50±10)%；12 h明暗周期〕，在实验前适应1 w，并在手术前禁食过夜。本研究得到承德医学院附属医院委员会批准。

1.2实验设计和操作方法 在硫喷妥钠60 mg/kg腹腔麻醉下，切开大鼠气管并连接小动物TOPO双模式呼吸机(Kent，美国)，室内空气条件下进行潮气量为8 ml/kg的机械通气。从右股静脉置入24 G中心静脉导管(BD，瑞典)用于给药和采血，同时将22 G导管(BD，瑞典)插入右侧股动脉，连接Dash5000压力传感器(GE，美国)进行连续血压监测。器械的平均时间约为10 min。结束后静脉注射2 mg/kg维库溴铵(辉瑞，美国)。10 min后，将大鼠随机分为3组各15只：(1)吗啡组，在诱导窒息性心搏骤停前10 min静脉注射5 mg/kg吗啡；(2)氟比洛芬酯组，在窒息性心搏骤停前10 min静脉注射5 mg/kg氟比洛芬酯；(3)对照组，在窒息性心搏骤停前10 min注射等量生理盐水。

1.3窒息性心搏骤停诱导及数据记录 窒息性心搏骤停诱导方法为：塞住气管导管8 min，直至平均动脉压(MAP)<20 mmHg。心肺复苏方法为：静脉注射肾上腺素(0.02 mg/kg)，然后进行机械通气(80次/min)和手动胸外按压(180次/min)，自主循环恢复(ROSC)为MAP>60 mmHg，通气则一直维持到大鼠开始出现自主呼吸。使用加热垫将直肠体温保持在36.5～37.5℃。

术前和心肺复苏开始后10 min采动脉血，MAP记录的时间为基线，静脉注射药物或生理盐水后，窒息性心搏骤停诱导后的1、2、3、4、5 min及复苏后第1、5、10、15、20 min，同时记录大鼠死亡的数量和时间。所有存活大鼠实验结束后注射180 mg/kg硫喷妥钠处死。

1.4神经元免疫组化和生化标志物测定 大鼠死后立即取脑组织，用4%甲醛在0.1 mol/L磷酸盐缓冲液中即刻固定。将石蜡包埋的脑组织切成5 μm切片进行免疫组化染色，从每个脑组织样本中随机选取海马心搏骤停1区和皮质区4个视野(放大40倍)进行神经细胞计数。另一部分组织在-70℃下快速冷冻储存。测定的血清脑神经标志物包括神经元特异性烯醇化酶(NSE)和S100钙结合蛋白(S100)B，测定组织标志物caspase-3水平，并归一化为脑组织样本中的蛋白浓度。所有标志物使用酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(MyBioSource，美国)进行测定。

1.5实时荧光定量(RT)-聚合酶链反应(PCR)和Western印迹分析 根据说明书，使用Trizol溶液(Invitgen，美国)从海马和大脑皮层提取总RNA。用不含核糖核酸酶的DNase Ⅰ去除DNA污染，使用Prime Script RT Master Mix(TaKaRa，中国)进行逆转录，然后使用SYBR PreMix Ex Taq Mix(中国，TaKaRa)通过实时PCR(Bio-Rad，美国)进行cDNA扩增。过氧化物酶增殖激活受体-γ共激活子(PGC)-1α、转录因子(NRF)-1、NRF-2、线粒体转录因子A(TFAM)和肌动蛋白(内对照)的特异性引物为：PGC-1α正向:5′-AATGCAGCGGTCTTAGCACT-3′；反向：5′-TTTCTGTGGGTTTGTGTGA-3′;NRF-1正向:5′-TGGTCCAGAGAGTGCTTGTG-3′；反向：5′-TGGT-CCAGAGA GTGCTTGTG-3′;NRF-2正向:5′-CTCGC-TGGAAAAAGAAGTGG-3′；反向：5′-CCGTCCAGGA-GTTCAGAGAG-3′;肌动蛋白正向:5′-AACTCCATCATGAAGTGTGACG-3′；反向：5′-GATCCACATCTGCT-GGAAGG-3′。RT-PCR反应在95℃中保温2 min，然后在95℃保温3 s和60℃保温30 s的条件下进行40个循环，采用归一化为肌动蛋白基因表达水平的2-ΔΔCt方法测定目的基因的相对表达量。

脑组织匀浆在放射免疫沉淀分析缓冲液中，裂解产物在4℃下离心(14 000 r/min)30 min。蛋白质样品(每个约40 μg)在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳上分离，分离后的蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上。用5%脱脂牛奶封闭非特异性结合位点60 min后，用PGC-1α(Cell Signaling Technology，1∶1 000稀释度)、NRF2(Santa Cruz，1∶1 000稀释度)和α-tubulin (Cell Signaling Technology，1∶5 000稀释度)的单克隆抗体在4℃孵育过夜。然后，用TBST洗涤3次15 min，然后用辣根过氧化物酶耦联二抗(1∶2 000稀释)在室温下孵育45 min。用TBST再洗膜3次，并用增强化学发光系统(Cell Signaling Technology)显影。

1.6统计学分析 采用SPSS23.0软件进行方差分析、t检验、配对t检验、Kaplan-Meier检验。

2 结 果

2.1各组实验过程中MAP变化对比 在窒息的前3 min，各组MAP都持续下降，导致窒息性心搏骤停，但氟比洛芬组下降更迅速，在前2 min内，氟比洛芬组MAP值显著低于另外两组(P<0.05)。在心肺复苏开始后5 min内，各组均出现ROSC，各组间MAP无显著差异(P>0.05)。在复苏5 min后各组MAP值均开始出现下降，但15 min后氟比洛芬酯组MAP明显高于其他两组(P<0.05)。见表1。

2.2各组血液血气指标、酸碱指标和死亡率对比 基线时，3组之间血气变量〔动脉血氧饱和度(SaO2)、动脉血氧分压(PaO2)、动脉血二氧化碳分压(PaCO2)〕和酸碱状态变量(HCO3、pH和乳酸)没有明显差异(P>0.05)，但组内与基线水平相比，各组复苏后10 min以上各指标均有显著变化(P<0.05)。对于组间的对比，大多数指标在3组之间均无显著差异(P>0.05)，但复苏后氟比洛芬酯组PaCO2水平较对照组和吗啡组水平显著降低(P<0.05)，pH值水平较对照组和吗啡组显著升高(P<0.05)。见表2。在整个复苏过程中，所有大鼠只接受室内空气通气。氟比洛芬酯组生存率〔93.3%(14/15)〕显著高于对照组〔46.7%(91/15)〕和吗啡组〔60.0%(9/15)；P=0.042〕。

2.3各组脑神经元损伤情况 免疫组化检测心肺复苏后大鼠海马体和皮质区神经元损伤情况。结果显示，皮质区和海马体区氟比洛芬酯组活神经元数量〔(17.5±4.9)个/视野、(23.4±5.2)个/视野〕明显多于吗啡组〔(9.7±1.8)个/视野、(18.2±4.7)个/视野〕及对照组〔(4.8±2.1)个/视野、(8.7±4.3)个/视野；P<0.05〕。见图1。

图1 各组海马体和皮质神经元的变化(IHC染色，×400)

2.4各组大脑损伤标志物对比 与基线比较，各组NSE水平在复苏后显著升高(P<0.05)，但组间没有统计学差异(P>0.05)；S100B水平在复苏后和组间都没有显著差异(P>0.05)，caspase-3水平在组间也没有显著差异(P>0.05)。见表3。

表3 各组基线和复苏后20min血清NSE和S100B及脑组织caspase-3水平比较

2.5各组线粒体相关转录因子表达 RT-PCR分析显示，与对照组比较，氟比洛芬酯组海马体和皮质PGC-1α、NRF-1、NRF-2、TFAM mRNA表达水平显著升高(P<0.05)。见表4。Western印迹结果显示，与对照组比较，氟比洛芬酯组显著增加了心肺复苏后海马体和皮质PGC-1α和NRF-2的蛋白表达水平，见图2、表5。表明氟比洛芬酯处理通过调节线粒体生物发生因子mRNA和蛋白的表达水平来促进线粒体的生物发生。

图2 各组心肺复苏后脑组织线粒体相关蛋白表达

表5 各组脑组织线粒体相关蛋白表达

3 讨 论

既往窒息性心搏骤停大鼠模型的麻醉方式主要是吸入氟烷和氧化亚氮，但本研究使用的是硫喷妥钠麻醉，其主要特点在于硫喷妥钠可以更加显著地抑制心脏和呼吸功能，使大鼠心肺复苏更加困难〔14〕，而硫喷妥钠带来的高死亡率与临床情况更为接近，达50%〔15〕。但尽管如此，本研究发现吗啡和氟比洛芬酯的预处理可以提高大鼠的早期存活率。对于阿片类药物的保护作用，之前的研究证实阿片类药物的预处理可以显著提高麻醉大鼠心搏骤停后心功能的恢复〔16〕；此外与未使用吗啡预处理的患者相比，心肺复苏之前或期间接受阿片类药物治疗的患者存活率和神经学结果都有显著提高〔17〕。本研究也进一步证实了这一点，其背后的机制，可能与阿片类药物提高大鼠对低氧的耐受有关。不同的是，之前的研究中吗啡预处理会显著降低MAP，而本研究吗啡的预处理并未导致MAP显著下降。吗啡的另一个显著效应是镇痛作用，而在心肺复苏中，剧烈的胸腔压迫加上可能的肋骨损伤会导致存活的患者出现剧烈的疼痛和应激反应。这可能也是使用吗啡后的大鼠在心肺复苏后存活率高的原因之一。

本研究的新发现为，经氟比洛芬酯预处理的大鼠心肺复苏后的血流稳定性和存活率更加提高。显示出比另外两组更好的血流动力学稳定性。这与之前一项研究一致〔18〕。该拮抗剂除了稳定血流动力学外，还可以显著减轻大鼠脑水肿现象，而氟比洛芬酯作为一种非甾体抗炎药物，既往的研究也发现其可以显著抑制脑细胞炎症，降低脑水肿的发生〔19〕。因此，氟比洛芬酯的抗炎效应和血流动力学的改善可能是本研究中大鼠早期存活率显著提高的主要原因。

本研究还分析了心肺复苏后大鼠脑神经的损伤，主要通过血浆NSE、S100B水平和脑组织caspase-3蛋白来体现。NSE和S100B在大脑中的分布不同，但都与缺氧性脑损伤显著相关〔20〕。S100B蛋白是一种胞内钙结合二聚体，分子量低容易穿过血脑屏障进入体循环；NSE广泛参与神经元的葡萄糖代谢，只在神经元和神经内分泌组织中存在，因此血液中NSE的浓度与神经元的破坏相关〔21〕。本研究中的大鼠在窒息性心搏骤停后20 min没有发生细胞凋亡的迹象，这与预处理与否无关。先前对大鼠大脑神经元的研究也发现，在发生窒息性心搏骤停的前6 h内，大鼠的大脑神经元超微结构并没有出现自溶，而9 h后，神经元才出现caspase-3的激活〔22〕。因此，本研究中短暂的窒息性心搏骤停没有对神经元造成广泛损伤。

线粒体稳态是维持神经元功能所必需的，因为神经元对能量的需求很高，而线粒体功能紊乱与神经元的失活相关。轻度的线粒体损伤会导致细胞程序性死亡，而更广泛的损伤则导致神经元坏死。因此，线粒体已成为神经保护干预的重要靶点。心搏骤停和复苏后的脑损伤是死亡的常见原因，复苏后全身低灌注会引起的全脑缺血，进而引起线粒体功能障碍，如氧化磷酸化的抑制、钙稳态的破坏、自由基的形成和细胞死亡信号通路的激活〔23〕。本研究表明，氟比洛芬可以通过调节线粒体生物发生因子的表达来促进心肺复苏后脑线粒体的生物发生，激活促生存激酶蛋白激酶B(AKT/PKB)信号通路〔24〕。随后AKT磷酸化NRF-1，促进其核定位，并使糖原合成酶激酶(GSK)-3β失活，从而改善NRF-2的核转位，起到保护神经元作用。

本研究还存在一些不足。首先，心输出量是心肺复苏过程中的重要参数，但限于仪器和实验条件，本研究未进行监测，因此无法了解复苏之后氟比洛芬酯对心脏有无抑制作用。此外，本研究没有测量大鼠的大脑需氧量，因此氟比洛芬酯对耗氧量的影响无法得知。同时，缺氧时细胞内Na+和Ca2+的快速积累可能会导致脑水肿的发生，因此氟比洛芬酯对脑水肿的影响有待进一步研究。

综上，使用氟比洛芬酯预处理可显著提高大鼠窒息性心搏骤停后的早期存活率，并且对大鼠脑损伤无明显影响，血流动力学也更稳定，是潜在的心搏骤停预处理药物，但需要进一步的实验研究来阐明氟比洛芬酯对复苏后的长期生存和神经预后的影响。