九龙虫对不同生长期自然衰老小鼠睾丸凋亡因子及血清相关激素的影响

潘朝旺 王伟 谢耀峰 江铃兴 金法明 秦玲丽 杨家林 周先云

(1湖北省鄂州职业大学医学院，湖北 鄂州 436000；2鄂州市中心医院；3武汉市第二卫生学校；4 武汉市中西医结合医院)

衰老指机体对环境的生理和心理适应能力进行性降低、逐渐趋向死亡的现象，作为生命活动的基本现象，在衰老过程中，始终伴随着机体器官功能的退化，实验表明，衰老动物也伴随着生殖系统功能的减退〔1,2〕，因而寻找和开发具有抗衰老功能的中药也成为现代医学的热点之一。前期研究提示九龙虫具有抗衰老作用〔3,4〕，本实验旨在研究九龙虫对不同时期自然衰老小鼠血清黄体生成素(LH)、睾酮(T)及睾丸凋亡因子半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9的影响，探讨其对抗衰老机制。

1 材料与方法

1.1药物 九龙虫散，本院自制，按比例加入动物饲料中；维生素E软胶丸(20180618，青岛双鲸药业有限公司。

1.2动物 清洁级KM小鼠，雄性，3月龄30只，9月龄150只，动物合格证号：42000600015619，许可证号:SCXK(鄂)2015-0018，湖北省实验动物研究中心提供。

1.3试剂 LH、T酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(购自南京卡米洛生物工程有限公司)、Caspase-3、9 ELISA试剂盒(购自凯基生物科技公司)。

1.4仪器 9602A酶标仪(南京普朗医用设备有限公司)、台式冷冻离心机(上海安亭科学仪器公司)、UV754紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)。

1.5动物分组给药 取9月龄KM小鼠150只，随机分为5组，即九龙虫低、中、高剂量组、模型组、维生素E组，每组30只。适应性喂养1个月后，给予含药饲料喂养，饲料用量为每天7 g/只，含药饲料是在普通饲料里加入药物，其中九龙虫低、中、高剂量组分别含九龙虫散0.004 8%、0.009 6%、0.019 2%，模型组为不含药的普通饲料，维生素E组含0.010 3%维生素E，分别在小鼠月龄为14、18、22月后，取血清和睾丸，每批每组10只，共3批，检测相关指标。另相应分批取3月龄KM小鼠30只，作为青年组，每批10只，同以上3批小鼠一起取血清和睾丸，检测相关指标。

1.6一般状态观察 观察大鼠毛色、活动等一般情况，分3批断头取血，再取睾丸，称重，计算睾丸脏器系数(脏器系数=睾丸重量/小鼠体重×100%)。

1.7ELISA检测血清LH、T 取上述血清，严格按LH、T试剂盒说明进行LH、T含量的测定。

1.8ELISA检测睾丸Caspase-3、Caspase-9 取睾丸，用生理盐水1∶20匀浆，按试剂盒说明书操作:加样→洗涤→加入抗体工作液→洗涤→加酶标抗体工作液→洗涤→加入底物工作液→加终止液→用酶标仪在450 nm处测吸光值,Caspase活性计算方法：Caspase活性(%)=(实验组OD值/青年组OD平均值)×100%。

1.9统计学处理 采用SPSS20.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1一般状态观察及对睾丸脏器系数的影响 随着饲养时间延长，各组小鼠一般情况逐渐变差，毛色光泽逐渐减弱，活动逐渐减少，但各给药组精神状态较模型组明显要好。14月龄时，与青年组和模型组比较，各组小鼠睾丸脏器系数差异无统计学意义(P>0.05)；18月龄时，与模型组比较，青年组和九龙虫高剂量组睾丸脏器系数明显增大(P<0.05)，其他各组睾丸脏器系数也有所增大，但差异无统计学意义(P>0.05)；22月龄时，与模型组比较，青年组、维生素E组和九龙虫中、高剂量组睾丸脏器系数明显增大(P<0.05，P<0.01)，九龙虫低剂量组睾丸脏器系数也有所增大，但差异无统计学意义(P>0.05)；22月龄时，与青年组比较，维生素E组和九龙虫中、低剂量组睾丸脏器系数明显减小(P<0.05，P<0.01)，九龙虫高剂量组睾丸脏器系数也有所减小，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2各组血清LH、T比较 14月龄时，与模型组比较，各组小鼠血清LH降低、血清T升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；18月龄时，与模型组比较，各组血清LH降低、血清T升高，其中青年组和九龙虫高剂量血清LH、T差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，其他各组差异无统计学意义(P>0.05)；与青年组比较，九龙虫低剂量组血清LH明显升高；22月龄时，与模型组比较，各组血清LH降低、血清T升高，除九龙虫低剂量血清T差异无统计学意义(P>0.05)外，其他各组差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；22月龄时，与青年组比较，维生素E组和九龙虫中、低剂量组血清LH明显升高、血清T明显降低(P<0.05，P<0.01)，九龙虫高剂量组血清LH升高、血清T降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；见表2。

2.3各组对睾丸Caspase-3、Caspase-9比较 14月龄时，与青年组比较，模型组睾丸Caspase-3、Caspase-9升高，与模型组比较，各组小鼠睾丸Caspase-3、Caspase-9降低，但差异均无统计学意义(P>0.05)；18月龄时，与模型组比较，各组睾丸Caspase-3、Caspase-9降低，其中青年组和九龙虫高剂量差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，其他各组差异无统计学意义(P>0.05)；22月龄时，与模型组比较，各组睾丸Caspase-3、Caspase-9降低，除九龙虫低剂量差异无统计学意义(P>0.05)外，其他各组差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；22月龄时，与青年组比较，维生素E组和九龙虫各剂量组睾丸Caspase-3、Caspase-9明显升高(P<0.05，P<0.01)。见表3。

3 讨 论

衰老是机体正常的生理现象，随着年龄增长，睾丸呈现退行性变。下丘脑-垂体-性腺轴对睾丸的生殖功能具有调节作用，下丘脑分泌的促性腺激素释放激素(GnRH) 调控着垂体LH 的分泌，而LH可促进Leydig 细胞合成和分泌雄性激素T〔5,6〕，激发生精过程，同时促进精子成熟，对生精过程具有调节作用。T是启动和维持精子发生的重要激素，临床上常用T水平判断睾丸的生精功能；T可促进生精细胞的发生和发育，抑制生精细胞凋亡〔7〕。

细胞凋亡因子与衰老也有着密切的关系〔8,9〕，细胞凋亡是细胞自主有序死亡过程,Caspase是一组半胱氨酸蛋白酶家族，有几种在调节细胞凋亡时发挥重要作用，其中Caspase-9参与了细胞凋亡的起始,Caspase-3则参与了细胞凋亡的执行。活化的Caspase-9可作为上游凋亡始动因子，激活下游的凋亡效应因子Caspase-3，导致细胞凋亡；Caspase-3 同时可进一步促进上游Caspase-9活化，加速细胞凋亡〔10，11〕。Caspase-3被激活，凋亡就进入不可逆的过程，一般认为Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，在细胞凋亡中起着不可替代的作用，Caspase-3最主要的底物是腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)，该酶与DNA修复、基因完整性监护有关。在细胞凋亡启动时，116 kD 的PARP被Caspase-3剪切成31 kD和85 kD两个片段，使PARP中与DNA结合的两个锌指结构与羧基端的催化区域分离，不能发挥正常功能，结果使受PARP负调控影响的Ca2+/Mg2+依赖性核酸内切酶的活性增高，裂解核小体间的DNA，引起细胞凋亡。

综上，九龙虫可通过降低血清LH和睾丸组织Caspase-3、Caspase-9水平，升高血清T水平，延缓小鼠睾丸衰老进程。