3种形态全缘兔耳草不同药用部位中6种成分测定

高必兴， 何 芳， 齐景梁， 苟 琰， 耿 昭， 钟 恋， 蒋桂华， 蒋运斌

(1.成都中医药大学药学院，四川 成都 610072；2.四川省药品检验研究院/国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，四川 成都 611731；3.西南大学药学院中医药学院，重庆 400715)

全缘兔耳草LagotisintegraW. W. Smith收载于《卫生部颁药品标准藏药第一册》及《云南省药品标准》，分布于我国四川西南部、西藏东部及青海西南部，具有清热解毒、行血调经、活血续筋。用于疮疡、中毒、炭疽、月经不调等[1-2]，苯乙醇苷类、环烯醚萜苷类为该药材治疗热性肝病的主要活性成分[3-12]，但现有标准及文献均未收载其所含成分的含量测定[13]，仅测定其同属植物短筒兔耳草中松果菊苷(苯乙醇苷类成分)含量[14]。前期报道，全缘兔耳草含有大车前苷及鞭打绣球苷B这2种苯乙醇苷类成分，以及10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇[15]、梓醇、桃叶珊瑚苷[15-17]这4种环烯醚萜苷类成分。

全缘兔耳草有3种不同植物形态，第1类产于石渠、德格等地，花白色，花茎直立，基生叶叶柄稍长；第2类主产于西藏，花序紫色，基生叶叶柄短，花茎多匍匐；第3类主产于四川理塘、稻城、雅江等地，花黄白色，基生叶叶柄长，叶近披针形，花茎直立。《卫生部颁药品标准藏药第一册》收载全缘兔耳草的药用部位为全草[1]，但在青海、西藏主要使用其地上部分。由于全缘兔耳草主要为野生资源，生长海拔高，环境恶劣，导致其分布范围及产量逐年减小，而藏区人民采药时习惯将其连根挖出，更导致资源大规模破坏，无法再生。因此，本实验测定全缘兔耳草3种形态、药用部位(全草、地上部位、地下部位)中大车前苷、鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃叶珊瑚苷的含量，以期为其资源可持续发展研究提供依据。

1 材料

LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)；安捷伦1260高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)； BP211D电子天平(十万分之一，德国Sartorious公司)；Milli-Q超纯水机(美国密理博公司)。鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇对照品均为实验室分离纯化；大车前苷(批号111914-201604)、桃叶珊瑚苷(批号111761-200601)、梓醇(批号111808-202112)对照品均购自中国食品药品检定研究院。8批全缘兔耳草经四川省药品检验研究院黎跃成主任中药师研究鉴定为正品，并通过花的颜色和叶的形态将其分成3类，见表1。甲醇、乙腈为色谱纯；水为纯化水。

2 方法

2.1 鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇含量测定

2.1.1 色谱条件 沃特世X-bridge C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.4%甲酸(B)，梯度洗脱(0～20 min，14% A；20～35 min，14%～17%A；35～62 min，17%～20%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长325 nm；进样量10 μL。色谱图见图1。

1.大车前苷 2.鞭打绣球苷B 3.10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇 4.10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇1.plantagoside 2.hemiphroside B 3.10-O-trans-p-methoxycinnamoyl-catalpol 4.10-O-[(E)-3,4-dimethoxycinnamoyl]catalpol图1 各成分HPLC色谱图(Ⅰ)Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents(Ⅰ)

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取大车前苷、鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇及10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇对照品适量，加甲醇制成各成分质量浓度约为1 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 取样品粉末约0.1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，密塞，称定质量，回流提取30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，即得。

2.2 梓醇、桃叶珊瑚苷含量测定

2.2.1 色谱条件 沃特世Atlantis T3 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈-0.2%磷酸(2∶98)；体积流量1.0 mL/min；柱温25 ℃；检测波长210 nm；进样量10 μL。色谱图见图2。

2.2.2 对照品溶液制备 精密称取梓醇、桃叶珊瑚苷对照品适量，流动相制成各成分质量浓度约为0.8 mg/mL的溶液，即得。

1.梓醇 2.桃叶珊瑚苷1.catalpol 2.aucubin图2 各成分HPLC色谱图(Ⅱ)Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents (Ⅱ)

2.2.3 供试品溶液制备 精密量取“2.1.3”项下供试品溶液20 mL，浓缩至近干，流动相溶液溶解并转移至10 mL量瓶中，摇匀，滤过，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密量取“2.1.2”及“2.2.2”项下对照品溶液适量，分别在“2.1.1”及“2.2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品峰面积为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度试验 精密吸取对照品混合溶液10 μL，分别在“2.1.1”及“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得大车前苷、鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃叶珊瑚苷峰面积RSD分别为0.23%、0.27%、0.12%、0.32%、0.19%、0.13%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取药材粉末6份，按“2.1.3”及“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在“2.1.1”及“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得大车前苷、鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃叶珊瑚苷峰面积RSD分别为0.24%、0.92%、0.34%、0.57%、0.26%、0.11%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性试验 取“2.3.3”项下供试品溶液，于0、4、8、12、16、24 h分别在“2.1.1”及“2.2.1”项色谱条件下进样测定，测得大车前苷、鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃叶珊瑚苷峰面积RSD分别为0.21%、0.74%、0.65%、0.42%、0.31%、0.24%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.5 加样回收率试验 精密称取大车前苷、鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃叶珊瑚苷对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为1.112 3、0.357 8、0.541 2、0.246 5、0.177 5、0.165 8 mg/mL的溶液。取药材粉末6份，每份约0.05 g，精密称定，精密加入上述溶液适量，按“2.1.3”及“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在“2.1.1”及“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，大车前苷、鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇、梓醇、桃叶珊瑚苷平均加样回收率分别为95.5%、97.7%、99.6%、100.2%、101.9%、100.3%，RSD分别为1.80%、0.83%、1.94%、1.85%、0.95%、0.82%。

2.3.6 样品含量测定 精密称取药材粉末(过3号筛)0.1 g，平行2份，按“2.1.3”及“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在“2.1.1”及“2.2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表3。

2.3.7 聚类分析 采用SPSS 25.0软件进行聚类分析，选择组内联接聚类法，以欧式平方距离度量为标准，结果见图3。由此可知，当欧式平方距离为10时，第1类全部聚成一类；第二类分别聚类，未与第1类、第3类交叉；第3类也分别聚类，未与第1类、第2类交叉。

2.3.8 正交偏最小二乘法判别分析 采用SIMCA 14.1软件进行正交偏最小二乘法判别分析，结果见图4。由此可知，各批药材地上、地下部分中6种成分分别聚集，具有一定的差异性。

图4 正交偏最小二乘法判别分析得分图Fig.4 Score diagram for orthogonal partial least-squares discrimination analysis

3 讨论

由于梓醇、桃叶珊瑚苷色谱条件与鞭打绣球苷B、10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇色谱条件具有明显差异，故本实验分别建立其含量测定方法。聚类分析结果表明，3种形态全缘兔耳草不同药用部位中6种成分分布具有一定差异。表3显示，第1类药材中梓醇、桃叶珊瑚苷含量低于另外2类药材；第3类药材中鞭打绣球苷B，10-O-反式-对甲氧基肉桂酰基-梓醇、10-O-[(E)-3,4-二甲氧基肉桂酰基]-梓醇)含量低于第1、2类药材，但大车前苷含量更高；3类药材中苯乙醇苷类总含量接近，而环烯醚萜苷类总含量依次为第3类>第2类>第1类，这可能与其生长环境(如海拔、温度等)相关。

表3 各成分含量测定结果(mg/mL，n=2)

正交偏最小二乘法判别分析是一种用于判别分析的多变量统计分析方法，可用于观察不同产地样品之间的组内差异，进行有监督的判别分析[18]，并获得相应模型。本实验发现，3种形态全缘兔耳草的6种成分含量在地上、地下部分中具有差异，但同一药用部位不同批次药材的点较为分散；地上部分中苯乙醇苷类总含量均高于地下部分，而环烯醚萜苷类总含量恰好相反。