新疆某规模化羊场羊支原体肺炎的分子流行病学调查

王紫阳，努尔比亚·艾克木，屈勇刚*，党瑞莹，赵 玉，常军帅，李 岩

（1. 石河子大学动物科技学院，新疆石河子832003；2. 新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站，新疆乌鲁木齐830063）

羊支原体性肺炎（Mycoplasmal pneumoniaof sheep and goats）是由绵羊肺炎支原体（Mycoplasmaovipneumoniae，Mo）、丝状支原体山羊亚种（M. mycoidessubsp.capricolum，Mmc）、丝 状 支原体 丝 状亚种（M.mycoidessubsp.mycoides，Mmm）以及山羊支原体山羊肺炎亚种（M.capricolumsubsp.capripneumoniae，Mccp）等支原体引起的接触性传染病，能够在绵羊和山羊间广泛流行，且危害较大。因上述4种常见病原间缺乏交叉免疫保护[1]，故在实施免疫防控策略时必须明确当地主要流行菌株的种型。此外，精氨酸支原体（M.ariginini，Ma）作为条件性致病菌，当动物机体的免疫力下降时可从呼吸道侵入肺部引起肺部病变，也应予以关注。Al-Aubaidi 等[2]于1972 年首次在患有呼吸道疾病的羊中检出Ma，此后在马来西亚、尼日利亚、西班牙[3-4]等地均有相关报道。1991 年，王栋等[5]首次从羊病料中分离到Ma，之后该病原在内蒙古、福建、四川等地相继被检出[6-8]。

新疆是中国养羊规模最大、出栏量最多的省份之一[9]，养羊业作为新疆的支柱产业获得了长足的发展。为满足产业发展需求，近年来不同品种的羊流动频繁，导致羊支原体性肺炎在一定区域呈流行趋势。目前，该病已成为影响新疆养羊产业化及可持续化发展的关键因素。本研究针对新疆某规模化羊场开展了羊支原体感染的分子流行病学调查，以期为该羊场支原体性肺炎的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品采集

随机采集该场内羊鼻拭子，记录样品编号、样品性质、采样时间等；对病死羊进行现场剖检，无菌采取病变组织，记录编号；对出现胸腔积液的患病羊，采用无菌注射器吸取胸腔积液，装入无菌EP 管。所有样品低温运送至实验室，-80 ℃保存。

1.2 试剂与仪器

主要试剂：DNA 快速提取试剂盒（博迈德生物科技有限公司）；2×EsTaq Master Mix、DNA Marker 700（北京全式金生物技术股份有限公司）。

主要仪器：PCR 仪（Bibby 科技有限公司）、电泳仪（上海沪粤明科学仪器有限公司）、UVP 全自动凝胶成像系统（BIO-RAD公司）。

1.3 流行病学调查

选择新疆某规模化羊场，对该羊场的饲养数量、品种、免疫情况以及呼吸道疾病的发生情况和发病的季节、症状表现、用药治疗、临床效果等进行调查。

1.4 样本的处理及DNA的提取

肺脏组织的处理：-80 ℃冰箱取出病变的肺组织样品，无菌操作台中使用灭菌的外科剪在病健交界处剪一“+”切口，从切口内取0.5 g组织块，转移至1.5 mL离心管；研磨处理后，使用DNA提取试剂盒提取DNA。

鼻拭子样品接种至KM2液体培养基中，37 ℃培养24 h，12 000 r/min 离心20 min，弃去上清，保留沉淀，PBS缓冲液洗涤两次后再次收集沉淀，提取基因组；胸腔积液直接采用DNA提取试剂盒提取基因组[10]。

1.5 PCR检测及测序

参照文献[11]和[12]，利用根据GenBank上公布的16S rRNA 基因的保守片段序列，分别合成Mo、Mmc、Mmm、Mccp、Ma的特异性引物。引物信息见表1，相关引物由睿博兴科有限公司合成。

PCR 反应体系（20 μL）：2×PCR Mix10 μL、灭菌水7 μL、DNA模板2 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL。

PCR 反应条件：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，退火40 s（退火温度见表1），72 ℃延伸35 s，40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

0.5×TBE 电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶，取10 μL PCR 扩增的反应产物，加入点样孔中进行电泳。将有代表性的阳性样品，切胶回收后测序。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.6 核酸序列分析及进化树构建

选取部分经PCR扩增为阳性的样品，对其进行切胶回收送公司测序。测序结果在GenBank 进行核苷酸序列的多重比对，下载相近的序列，使用MEGA7将测序菌株的核苷酸序列与Mo 标准株Y98（Mo Y98）、分离株MoGH3-3株、MYCO22、FJ-SM、Dovre、hyopneumoniae J、PG34、ZaZaFa-1；Ma分离株G230、NBRC、PG6、CBER2012BHK、XJ-KCLLB等进行同源性比较，同时构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 现场流行病学调查结果（见图1、图2）

该场饲养羊数量约3 500 只，主要以湖羊、杜泊羊、多浪羊以及杂交羊为主。

由图1可知，羊群整体处于亚健康的状态，常年均有咳嗽等临床表现，发病月份多集中于12 月至第二年3 月；随着气温突变，发病率和病死率呈明显上升。

该羊场免疫的疫苗主要有羊痘、口蹄疫、三联四防疫苗等，未免疫过支原体相关疫苗。针对呼吸道疾病常用的药物包括氟苯尼考、泰妙菌素、庆大霉素、卡那霉素等，但治疗效果不佳，仅在用药期间发病羊群的症状有所缓解，但在停药一段时间后症状反复出现。羊群整体表现为间歇性咳嗽，夜间加重，流浆液性鼻涕，患病羊消瘦。

由图2可知，现场剖检可见，病理变化多集中于胸腔，常见一侧或两侧肺脏呈纤维素性肺炎，肺脏肿大、呈灰红相间、质地坚硬且缺乏弹性，切面呈大理石状，胸腔与肺脏存在严重粘连，胸腔有纤维性渗出液。

2.2 PCR检测结果（见图3～图5）

本试验共采集样品103份（湖羊35份、多浪羊12份、杜泊羊20份、杂交羊36份）。

由图3、图4 可知，Mo 样品1～10 经PCR 扩增、凝胶电泳后，可在凝胶成像系统下出现一条约为433 bp的目的条带；Ma 样品1～6 经PCR 扩增、凝胶电泳后，可在凝胶成像系统下出现一条约为545 bp的目的条带。

由图5 可知，该规模化羊场Mo 的整体阳性率为43.69%（45/103），其中湖羊、多浪羊、杜泊羊、杂交羊Mo的阳性率分别为54.28%（19/35）、0（0/12）、50.00%（10/20）、41.67%（15/36）。

Ma 的总体阳性率为6.80%，其中湖羊检出率为8.57%（3/35），杜泊羊检出率为10.00%（2/20），杂交羊检出率为5.56%（2/36），多浪羊的检出率为0（0/12）。

在各品种羊群中均未检出Mmc、Mmm、Mccp。

2.3 核酸序列分析及进化树的构建

2.3.1 Mo样品核酸序列比对结果及进化树（见图6、图7）

由图6、图7 可知，经比对Mo 样品Mo.10 与福建农业科学院从山羊体内的分离株FJ-SM 亲缘性最高，样品Mo.9与中国农业科学院兰州兽医研究所分离株MoGH3-3株的亲缘性最近，其他测序株单独成为1个分支。

2.3.2 Ma样品核酸序列比对结果及进化树（见图8、图9）

由图8、图9 可知，Ma 样品Ma.6 经比对与分离株CBER2012BHK的亲缘性最近，与分离株G230也具有一定亲缘性，其他测序株单独成为1个分支。

3 讨论

本研究结果表明，该场引起羊传染性胸膜肺炎的病原主要为Mo 及Ma。储岳峰等[13]研究报道，Ma 是绵羊和山羊呼吸道疾病常见的病原菌；动物机体免疫力低下或存在其他病原感染时，均可导致肺炎的发生。1992 年，Yechouron 等[14]研究指出，Ma 属于条件性致病菌，可对免疫力低下的人群造成不同程度的感染，严重时可导致死亡；该病原体一般可由动物咬伤或食用动物源性食品而感染，也可经由呼吸道分泌物感染人。南疆地区是肉羊养殖的集中地区，饲养人员与羊群密切接触，该菌能否通过病畜或间接通过动物产品传染给人仍有待进一步研究。

PCR 检测方法是支原体肺炎检测最为常见的一种方法，其中16S rRNA具有高度的保守性和特异性，目前已成为病原菌检测一种强力的手段。本试验对部分PCR 扩增阳性样品进行测序并构建其亲缘进化树，发现Mo 的感染率高达43.69%，而Ma 的检出率仅为6.80%。与2019 年杜奕州等[9]、2020 年王雅雯等[15]对南疆部分地区绵羊支原体感染的流行病学调查相比，本调查的结果出现较大的增幅，流行株比对的结果也存在一定的差异。

该羊场支原体的流行情况较为复杂，经在GenBank进行的核苷酸序列比对，样品Mo.10与福建农业科学院从山羊体内的分离株FJ-SM（Mycoplasma ovipneumoniaestrain FJ-SM.KU870650.1）亲缘性最高；样品Mo.9 与中国农业科学院兰州兽医研究所分离株MoGH3-3 株的亲缘性最近，其他测序株单独成为1个分支。样品Ma.6经比对与南非杜泊绵羊阴道拭子分离株（Mycoplasma argininistrain C1.HQ661823.1）和Ma 分离株（Mycoplasma argininistrain CBER2012BHK clone 4.JQ903581.1）的亲缘性最近，与分离株G230（Mycoplasma argininistrain G230.NR_041743.1）也具有一定亲缘性。

本调查并未检出Mmc、Mmm 及Mccp 等病原，表明该场的主要致病菌以Mo为主。在对不同品种进行检测分析时发现湖羊的感染率最高，而新疆本地品种“多浪羊”并未检出相关支原体病原，表明该品种羊只对Mo 存在一定抗病性，而湖羊作为从内地引进的品种对Mo 的抗病性方面相对较弱。

4 结论

羊支原体肺炎是能够在绵羊和山羊间广泛流行且危害较大的接触性传染病。主要以呼吸道传播为主，危害性大，一旦羊群感染则难以清除，药物防治效果不佳且极易产生耐药。该病一旦传入某个区域，若不采取有效的防控措施，该病将迅速蔓延，防治的方法应采取疫苗免疫、药物治疗、饲养管理等综合防控措施。