MITF新突变致Waardenburg综合征以及相关致病机制探讨

倪晓琛 李佳楠 郭维维 陈伟 杨仕明

1解放军总医院第六医学中心耳鼻咽喉头颈外科医学部(北京 100853)

2国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心(北京 100853)

3聋病教育部重点实验室(北京 100853)

4聋病防治北京市重点实验室(北京 100853)

Waardenburg综合征（waardenburg syndrome，WS）是一种以听力-色素异常为特征的综合征性疾病，遗传方式以显性遗传为主，临床特征具有明显异质性。其中以虹膜异色、前额白发、感音神经性聋、以及内眦异位为主要临床特征。WS患者可以出现不同程度的感音神经性聋，约占WS患者的90.2%[1]。同时约占遗传性聋病人的2-5%，发病率为1/42000。WS还可以表现出不同程度不同部位的色素异常，包括虹膜颜色，头发，面部以及全身皮肤。依据患者不同的临床表现。进一步将WS分为4型，具体见表1。1型WS以内眦异位为主要临床特征，而2型WS不伴有内眦异位。3型WS在1型的临床特征基础上，还伴有上肢骨骼异常，而4型则在2型的基础上伴有先天性巨结肠[2]。WS2具有极为复杂的致病基因基础，目前仍有部分WS2患者尚未明确致病基因。同样，WS2中感音神经性聋的发生率高达91.6%，其中以MITF为致病基因的患者发生率为89.6%[1]。同时目前已经报道的相关MITF致病性突变位点已经超过50个(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar?term=156845[MIM])，并且多以无义突变为主。

表1 表型特征Table 1 Characteristic of phenotype

1 方法

本研究中纳入的家系WS20211025，共计四代19人。

1.1 临床评估

对于家系中成员进行临床评估，完整收集相关临床表型。重点关注全身皮肤色素改变情况、双眼虹膜颜色，头发颜色改变等相关色素异常的临床特征。同时进行眼科相关评估、消化系统相关评估以及体格检查、骨骼系统相关评估以及检查，对于可以配合进行纯音测听的成员进行纯音测听检查，对于无法配合的成员行客观听力检查，包括听性脑干反应阈值，听性脑干反应潜伏期，40Hz听觉相关电位，畸变耳声发射检查。相关听力学检查均于中国人民解放军总医院第一医学中心进行。依据WHO的听力下降分级标准进行分级：正常听力水平＜20dB；轻度听力损失：≥20 dB且＜35dB；中度听力损失：≥35 dB且＜50dB；中重度听力损失：≥50dB且＜65dB；重度听力损失：≥65dB且＜80dB；极重度听力损失：≥80dB且＜95dB ；完全听力损失/全聋≥ 95dB[3]。

1.2 血样收集以及DNA提取

家系中仅有4人，包括先证者、先证者妹妹、先证者母亲以及先证者父亲提供外周静脉血血样进行DNA提取。经签署知情同意书后，抽取4名家系成员外周静脉血5ml以进行进一步的DNA提取，并进行全外显子测序并进行Sanger验证。

2 结果

2.1 家系图绘制

收集家系成员相关临床表型后，绘制家系图WS20211025，见图1。

图1 家系图Fig.1 Pedigree of family WS20211025

（其中红色表示为听力下降，蓝色表示为蓝色虹膜，绿色表示为白斑，黄色表示为面部雀斑）

2.2 临床特征

先证者Ⅳ-1幼时表现为双眼蓝色虹膜，后虹膜色素逐渐增加，目前已为正常棕色虹膜。双手背侧可见散在脱色素白斑，全身其他部位未见色素异常改变。骨骼四肢未见畸形，消化系统相关检查未见明显异常。Ⅳ-2为为先证者妹妹，其双眼虹膜呈现不对称性改变，右眼虹膜部分色素缺失，左眼虹膜为正常棕色。全身皮肤未见色素异常改变。骨骼四肢未见畸形，同时消化系统相关检查均未见明显异常。Ⅲ-2为先证者母亲，体格检查中双眼呈现亮蓝色虹膜，颜面部可见雀斑，双手背面皮肤可见大量散在脱色素白斑，余部位皮肤未见明显色素改变。Ⅱ-4为先证者外祖母，因病逝世。据家属描述为存在听力下降，并且双眼为蓝色虹膜，双手背面皮肤同样存在脱色素白斑。I-1为先证者曾外祖母，为聋哑人，详细临床表型无法收集。

图2 家系成员临床表型Fig.2 Clinical features of family

2.3 听力学特征

先证者Ⅳ-1：出生后未行常规听力筛查，2岁时由于父母发现患儿对声音反应较差，言语发育迟缓，就诊于当地医院行相关听力检查，结果提示双侧极重度感音神经性聋（图3）。DPOAE检查左耳各频率未引出有意义的DPOAE，右耳于1kHz引出反应、ABR反应潜伏期Click下双耳100dB nHL均未引出反应，听性脑干反应阈值Click下双耳96dB nHL均未引出反应，40Hz听觉相关电位左耳120dB HlL未引出反应，右耳阈值110dB nHL。行颞骨CT检查，内耳结构以及形态未见异常，双侧内听道对称，无扩大。后于4岁行左侧人工耳蜗植入术，术后规律佩戴人工耳蜗并行于当地康复中心行为期5年的康复训练。现患者已进入正常小学进行学习，但目前学习水平较同龄儿童差。Ⅳ-2出生后听力筛查未通过。声导抗为双耳As曲线。ABR反应潜伏期Click下双耳100dB nHL均未引出反应，听性脑干反应阈值Click下双耳100dB nHL均未引出反应MRI检查内听道水成像未见明显异常。40Hz听觉相关电位双耳阈值均为100dB HL。双侧颞骨CT平扫未见明显异常。Ⅲ-2自觉听力呈现波动性改变，于我院行相关听力学检测，结果提示双耳对称性低频听力下降（图4）。Ⅱ-4以及I-1经由家中成员描述，均存在听力下降，同时I-1为聋哑人，侧面提示其可能存在重度甚至极重度听力损失。

图3 Ⅳ-1听力学特征Fig.3 Audiogram ofⅣ-1

图4 Ⅲ-2听力学特征Fig.4 Audiogram ofⅢ-2

2.4 基因检测结果

经过全外显子测序以及Sanger验证：该家系中致病基因以及突变位点为MITFc.544A＞T（NM_000248.4），突变位点位于MITF-M的exon 5，产生了单碱基突变，最终导致出现了仅可编码182个氨基酸的截短蛋白。进一步依据ACMG指南分类，对突变基因进行解读，并进行致病性分析。该突变位点符合以下特征：1）PVS1：该突变位点出现单碱基替代后，出现了终止密码子提前，导致编码出截短蛋白，丢失了重要的功能结构阈，符合无功能突变；2）PS4：经过基因数据库检索以及正常人群数据库检索，对比MITF在该位点的突变，发现并未收录，进一步于疾病基因数据中进行检索，发现该突变位点为新发现的突变位点，尚未收录至疾病的基因数据库中；3）PP1:在家系中，WS患者均携带了该突变，而表型正常成员未携带该突变位点，符合共分离现象；4）PP2：在建立的MITF突变数据库中，大多均以无义突变为主，并已明确为致病突变。在本家系中，突变同样属于无义突变。依据以上证据，明确WS20211025家系中，MITF（c.544A＞T）为其致病性突变，并未收录至疾病突变数据库中。同时利用MutationTaster[4]进行突变位点分析，具体分析见表2。

表2 致病性分析Table 2 Pathogenicity analysis

3 讨论

在本家系中五名成员符合WS疾病诊断标准，五名患者均表现出听力下降，但听力下降程度并不相同。同时，五名患者中四名患者可以获得完整表型信息。四名患者中均表现出虹膜异色，同时三名患者表现出面部雀斑以及手背部皮肤脱色素白斑。并且其中3名成员经基因检测突变基因为MITFc.544A＞T（NM_000248.4）。其编码的截短蛋白仅包含182个氨基酸。依据ACMG指南[5]，明确MITFc.544A＞T为家系致病基因。

MITF（microphthalmia-associated transcription factor）作为一种基础螺旋-环-螺旋-亮氨酸拉链结构（basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLHZip)家族中的转录因子，其特征性结构阈bHLHZip在MITF发挥作用的过程中具有十分重要的作用。bHLH-Zip主要参与蛋白质的二聚化，包括同源以及异源二聚化。只有在形成二聚体后才可以与DNA结合，发挥功能[6]。在本家系中，突变位于第5号外显子，编码产生的截短蛋白失去了其重要的结构以及功能阈，所以最终出现了单倍体剂量不足[7]，导致疾病的出现。

MITF具有多种亚型，其中以MITF-M高表达于黑色素细胞中。黑色素细胞来源于神经嵴细胞的黑色素细胞系。神经嵴细胞发育以及分化的过程中，在转录因子PAX3、SOX10以及MITF的调控下进一步分化为黑色素细胞。依据黑色素细胞对KIT基因的敏感性，可以将其分为两类[8]，一类为KIT敏感的黑色素细胞，主要分布于皮肤以及虹膜等；另一类为KIT不敏感的黑色素细胞，主要分布于内耳的血管纹中，称之为中间细胞，参与内耳血管纹对耳蜗内电位的调节。当MITF突变后，相关临床表型的出现则主要与这两类细胞的功能改变相关。

黑色素细胞在分化过程中迁移至内耳血管纹中，形成中间细胞，与边缘细胞以及基底细胞等其他细胞，共同组成血管纹，维持耳蜗内电位的稳定。目前研究表明影响血管纹中这三种主要细胞的突变基因可能通过影响耳蜗内电位，使得耳蜗内电位失衡，进而导致毛细胞凋亡，最终出现听力损失。尤其中间细胞中的内向回收钾离子通道Kir4.1在耳蜗内电位的维持中有着必要的作用。当其编码基因kcnj10突变时，耳蜗内电位消失，进一步验证了中间细胞的重要作用[9]。在建立的白化荣昌猪（mitf-m突变）模型中进一步证实了mitf在黑色素细胞迁移至血管纹的过程中的作用。研究发现E75时，突变型与野生型在耳蜗血管纹的差异开始显现，并且在P1时，可以观察到白化型中，血管纹明显变薄。在进一步的耳蜗电镜扫描中可以观察到耳蜗内毛细胞出现融合，并且于底回以及中回较为明显[10]。进一步的转录组分析中，发现突变型猪模型中，K+通道相关基因表达明显下调[11]。在小鼠血管纹的单细胞测序中则发现，MITF不仅高表达于中间细胞，同样高表达于边缘细胞[12]。在血管纹中，是否只有中间细胞是神经嵴细胞来源的，仍需进一步研究[13]。尽管目前研究已经证实MITF突变导致的听力下降可能与中间细胞功能相关，但是对于同一突变而言，可以呈现出不同程度的听力下降。正如本家系中，3名经基因检测证实存在MITF突变的患者，均表现为听力下降，但是却呈现不同程度的听力下降，尤其先证者母亲呈现为双耳对称性轻度听力损失。携带相同的基因突变，但是却呈现出不同程度的听力损失，这个问题至今仍在探索以及研究中。MITF突变后，在对神经嵴细胞分化过程的调节中，是否仍有其他重要的调控机制，或者MITF基因在表达过程中是否可以经由其他正向调节机制弥补突变带来的单倍体剂量不足？尽管已有研究证实在WNT/β-catenin可以一定程度弥补剂量不足带来的影响[14]。但是背后更多的机制仍需进一步探索。

在本家系中，先证者已行单侧人工耳蜗植入，在经过了为期5年的康复训练后，目前CAP以及SIR分别为7、4。同时学习水平稍差于同龄儿童，并且对英语的接受以及理解能力较差。而先证者妹妹在经过为期1年的康复训练后，目前依旧无法表达完整语句，仅仅可表达较为简单的词语，目前CAP以及SIR分别为4、2。尽管先证者行人工耳蜗植入年龄为4岁，错过最佳植入年龄，但经过长达5年的康复训练，并规律佩戴人工耳蜗后依旧不能获得令人满意的康复效果，这不由得令人深思。影响人工耳蜗植入术后效果的因素较多，但其中以突变基因种类[15,16]以及螺旋神经节细胞的数量[17]较为重要。当突变基因表达局限于内耳时，术后康复效果较好，而当基因影响螺旋神经节细胞时，则无法取得较好的效果[18]。那么MITF对听觉系统的影响是否仅仅局限于血管纹中？在Chen等人的研究中则证实了MITF突变的荣昌猪中出现了螺旋神经节细胞的衰退[19]。为我们探索MITF突变对听力的影响提供的新的方向。同时家系中先证者母亲的低中频听力下降是否与螺旋神经节细胞衰退相关，仍需要长时间的随访以及观察。

家系中成员的皮肤色素异常的改变，尤其面部雀斑这一临床特征，与目前相关研究相符合。在Wang等人一项包含90例中国WS患者的研究中发现，WS2型患者中，以MITF突变的患者多表现为面部雀斑，而SOX10突变的患者则未呈现出这一临床特征[20]。MITF-M在黑色素的合成的过程中有着重要的作用，可以通过调节下游基因黑色素生成的相关基因酪氨酸酶（tyrosinase，TYR),酪氨酸酶相关蛋白1（tyrosinase-related protein-1 ，TYRP1)，酪氨酸酶相关蛋白2（tyrosinase-related protein-2 ，TYRP2)对黑色素的生成进行调节[21]。由于黑色素生成过程中，涉及基因复杂，同时皮肤黑色素细胞合成黑色素受到多种因素的影响，包括种族以及紫外线等，故而皮肤色素异常异质性的研究更为复杂。

目前有关WS临床异质性原因的研究多局限为PAX以及SOX10[22]。研究表明PAX以及SOX10临床表型异质性以及临床表现外显率不同的原因为无义介导的mRNA降解途径（nonsense-mediated mRNA decay，NMD）对截短蛋白进行的调控。无义介导的mRNA降解途径是一种高度保守的mRNA质量以及数量监控机制[23]，在解释单基因遗传性疾病的表型调控以及生物化学途径、致病机制的研究中具有重要作用。在SOX10突变导致的疾病中，NMD途径则有着重要的调控作用。当截短蛋白逃逸NMD途径识别时，截短蛋白则以负性效应为主，导致疾病表型作为严重的PCWH综合征（peripheral demyelinating neuropathy,central dysmyelination,Waardenburg syndrome,and Hirschsprung disease，PCWH）[24]。当无义突变出现在基因开放阅读框编码区的早期时，则可以降低突变基因的负性效应并且降低表型的外显率，尤其以单倍体剂量不足为致病机制的基因中，NMD的调控作用可以部分解释临床表型的异质性。而但目前有关MITF的相关研究尚未进行明确报道。MITF是否也受到NMD机制的调控，从而影响疾病的表型，仍需更多的研究。