利用生物信息技术及基础实验检验食管鳞癌中白细胞介素－17及相关细胞因子表达情况

姚迪，常红岩，王琳

（郑州大学第一附属医院 信息处，河南 郑州 450052）

医学的进步是医学研究者不懈努力所获得的结果，但是从基础实验到临床应用是一个漫长的过程，期间根据某种现象到提出假说，再通过一系列摸索得出适应人体水平的结果，往往带有极大风险及花费。所以找到一种方法能够简化其中步骤是有必要的。进入新世纪，生物信息学从提出到实践逐渐成熟，它将信息技术与生命科学相结合，成为研究方法的一种热点。利用计算机技术及生物信息技术，对于目前研究发现结果进行分析，进而对实验假想进行探索及验证，是可以利用的方法［1］。食管癌是最常见的癌症之一，在全世界所有癌症中病死率排名第六［2］。食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）为主要组织学类型，在中国非常普遍［3］。由于晚期发病所致和转移倾向，尽管最近在诊断和治疗后ESCC的预后仍不满意，年生存率仅为15% ～25%［4］。白细胞介素－17（interleukinIL－17，IL－17）是一种主要由Th17辅助细胞分泌的炎症细胞因子，并且一些研究显示IL－17在多种肿瘤中发挥了重要作用［5］，但关于IL－17在ESCC内对肿瘤作用的研究较少，并且仍有争议［6－7］。目前基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus database，GEO）是当今最大、最全面的公共基因表达数据资源，包含了43个肿瘤项目及68种肿瘤类型，其中含有大量的微阵列芯片和测序数据［8］。本研究基于数据库研究IL－17在食管鳞癌的表达及其相关通路蛋白的表达情况，并基于现实世界中食管鳞癌相关细胞因子的表达情况。

1 材料与方法

1.1 文献检索策略检索PubMed数据库获取食管癌相关文献，检索起止日期为2000年1月1日至2021年11月21日。检索策略主要是Esophageal squamous cell carcinoma和IL－17，采用Excel 2016软件进行数据录入，统计研究数据，包括发表时间和研究细胞因子，获得目前关于研究情况，获取热点研究因子，为下一步统计分析做指导。

1.2 数据收集和预处理本研究样本选取标准为于2021年1月从GEO数据库（https：／／www.ncbi.nlm.nih.gov／geo／）中下载食管鳞癌组织样本数据集GSE26886（包含69例食管组织）的芯片原始数据。分析其中相关细胞因子表达情况。在RStudio 4.0中用Affy包读取原始文件，使用RMA算法预处理得到标准化的基因表达谱数据，再对两个数据集进行注释，log2转化，R包SVA校正批次效应并合并。

1.3 食管组织病理学检查

1.3.1 免疫组化检测IL－17表达 将组织玻片依次放入二甲苯，体积分数为100%的乙醇，1×PBS洗3次，每次5 min。提前将抗原修复液在微波炉中煮沸，煮沸后将载玻片放入抗原修复液中，使抗原充分暴露。自然冷却至室温。1×PBS中洗3次，每次5 min。取20 mL体积分数为30%的过氧化氢、180 mL甲醇混匀，将载玻片放入体积分数为3%的过氧化氢－甲醇溶液中，浸泡20 min。1×PBS洗3次，每次5 min。用1×PBS配置体积分数为5%的山羊血清，用免疫组化笔将组织圈起来，将配好的山羊血清直接加到组织上，以刚好在圈内覆盖组织为宜，孵育10～30 min。用1∶50的一抗加到组织芯片上覆盖住组织，孵育过夜。1×PBS中洗3次，每次5 min。按体积比为1∶100的比例用1×PBS配置二抗，将二抗加到组织芯片上覆盖住组织。孵育5 h。向组织芯片上加DAB，进行染色，将组织芯片放入苏木素中染色。将组织芯片放平，在组织上滴加中性树胶，尽可能覆盖组织，盖上盖玻片，注封片。

1.3.2 蛋白质免疫印迹（western blot，WB）检测细胞因子表达 裂解组织，提取蛋白；应用BCA法测定蛋白含量；根据蛋白大小配制浓缩胶和合适浓度的分离胶及浓缩胶，毎孔加30μg已变性的蛋白样品，80 V电泳至分离胶后改为120 V电泳，约50 min终止电泳，按白扳、海绵、滤纸、PVDF膜、PAGE胶片、滤纸、海绵、黑板顺序放置，放置时保证去除气泡使PVDF膜与电泳凝胶充分贴合，蛋白转膜；随后将NC膜放入50 g·L－1脱脂奶粉封闭液中封闭2 h，然后进行一抗及二抗孵育，随后进行ECL显色。

2 结果

2.1 文献检索结果通过文献检索共获得56篇文献，经反复阅读文献内容，排除重复研究、会议摘要、编者按、勘误、信件等40篇，排除相关文献中不包含缺失研究因子，或者研究通路不明确的文献，最终纳入15篇进行分析。其中2000—2010之间有1篇文献发表，2010—2021年有14篇文献发表。统计其中研究的细胞因子包括白细胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、S100钙结合蛋白A8（recombinant S100 calcium binding protein A8，S100A8）、S100钙结合蛋白A9（recombinant S100 calcium binding protein A9，S100A9）、基质金属蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP－9）、基质金属蛋白酶13（matrix metallopeptidase 13，MMP－13）等各细胞因子研究热度，以及各细胞因子在肿瘤组织中相比正常组织中的对比值，并定义其为表达量，结果显示：其中IL－6、S100A9及MMP－9研究热度较高；MMP－9在肿瘤组织中表达量高；而S100A9在肿瘤组织中表达量低。见图1。

图1 各细胞因子研究热度

2.2 从GEO数据库中下载食管鳞癌组织样本数据集GSE26886GSE数据集中包含28例食管标本，其中10例食管鳞癌及18例正常标本基因集，食管鳞癌与正常组织标本非成对标本，仅仅提供肿瘤组织临床数据。其中男女分别为8例及2例；中位年龄为58.2岁；分化程度为中分化5例，高分化5例；其中T1病变为1例，T3病变为9例；出现淋巴结转移为7例，未转移为3例。选取其中鳞癌样本进行分析，结果显示肿瘤组织中IL－17、IL－6、MMP－9、MMP－13的基因表达量均高于正常组织，S100A8在正常与肿瘤组织中表达差异不明显，但是肿瘤组织中S100A9表达量低于正常组织。见图2。

图2 食管鳞癌数据集GSE26886中显示肿瘤组织中IL－17、IL－6、S100A8、S100A9、MMP－9、MMP－13表达情况

2.3 蛋白检测

2.3.1 食管鳞癌组织免疫组化 利用12例T3N0M0食管鳞癌标本行免疫组化检测。其中男6例，女6例；中位年龄为54岁；高分化5例，中分化7例；所有患者肿瘤病变为T3；淋巴结均未转移。结果显示肿瘤组织中IL－17表达量（66.30±17.14）较正常组织（22.53±5.13）表达量增加（P＜0.05）；在高分化肿瘤中表达量（60.53±3.96）高于正常组织中（23.5±3.28）表达量（P＜0.05）；中分化肿瘤中表达量（76.17±4.73）高于正常组织中（76.17±4.73）表达量（P＜0.05）。

2.3.2 WB 根据发表的相关文献统计的关于IL－17的研究结果，选取研究热度较高的细胞因子进行组织蛋白检测；选取IL－17上游细胞因子IL－6及下游细胞因子MMP－9、S100A9行WB检测，蛋白结果显示MMP－9。IL－6在肿瘤组织标本中表达量高于正常组织，S100A9肿瘤组织中表达量低于正常组织，与基因芯片中获得的数据结果类似。见图3。

图3 组织中各因子WB表达情况

3 讨论

上世纪80年代美国科学家在科学杂志上首次提出检测人类基因组［9］，因为数据庞大，为解决这个问题，逐渐兴起了一门新兴的科学即生物信息学，它的出现，不仅使人们对生物体和生物信息的起源有了新的认识，而且也为人类疾病的诊治开辟了全新的途径。所以这门学科能够使信息工作者和临床科技人员紧密联系起来。目前有很多的大型生物学数据库都是公开的，包含了众多的生物学资源，可以使人们更方便地获取想要的资料，例如TCGA、GEO等数据库。一些研究结果显示可以利用相关数据库获得一些结果［10－11］。但是这些结果只是筛选可能有用基因，并未在组织标本中验证。本研究是与临床医生合作，利用计算机技术及生物信息技术验证理论猜想。

河南省林州为食管癌高发区，虽然经过半个世纪的努力，但是目前食管癌患者治疗后的生存情况仍不够理想［4，12］。为了改善患者预后，探索新的治疗模式。而目前IL－17在许多研究中显示其对肿瘤的发生发展起到一定作用［13］，遂以此为方向，研究IL－17在食管鳞癌中的作用。首先建立理论依据，根据发表的文献，获得研究方向；查阅大量文献，目前使用最多的就是美国的国家生物技术信息中心包含的PubMed功能，在上面可查询成千上万篇的文献和文摘，并且可以得到近500种期刊发表的文章全文［14］。本研究首先以esophageal squamous cell carcinoma和IL－17为关键词，在PubMed上进行检索，排除不符合标准文献。在对符合标准的文献进行仔细阅读分析后，发现IL－17在食管癌组织中是有可能升高的，而其相关的一些细胞因子在肿瘤组织中表达各有不同。

获得需要研究的相关细胞因子后，在GEO中检索出GSE26886提供的临床资料及基因数据类型符合研究所需。GEO是一个巨大的基因数据库，包含了100多种生物体的超过10亿个单独的基因数据［15］。虽然GEO可以提供简单的数据分析，但是却不能进行复杂的分析。检索的基因数据表达谱采用的是Affy芯片，使用RStudio提取基因数据，获取基因探针，对比正常组织及肿瘤组织中相关细胞因子表达量，获得了与文献类似的结果。一些研究结果显示可以利用GEO获取相关细胞因子［11，16］。

本研究进一步提供证据表明，食管癌患者中IL－17在肿瘤分泌量较正常组织高，而且研究结果显示随着肿瘤发展，IL－17在肿瘤组织中的表达量较正常组织高，这与以前的一篇研究结果［17］类似，可以提示IL－17可能促进肿瘤生长。一些研究表明某些上游细胞因子（IL－6）参与了Th17细胞的分化和发育，进而影响IL－17分泌及相关通路的表达［18－21］。IL－6对IL－17的影响主要体现在其可以调节产生IL－17的Th17细胞，IL－6诱导幼稚T细胞与TGF－β共同刺激Th17细胞的发育［22－23］。本研究中也发现IL－6在肿瘤组织中有所升高，显示其间可能有相关性。S100A8／A9是由S100A8与S100A9蛋白结合形成的异二聚体，通过与不同的金属离子及细胞作用调节炎症状态，抑制细菌增殖，促使细胞骨架重排。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）是一类广泛存在于血管壁细胞外基质的锌离子依赖性水解酶，与细胞外基质破坏和重建以及动脉粥样硬化、脑梗死、脑出血、肿瘤等疾病密切相关。一些研究显示S100A8、MMP－9及MMP－13在食管癌组织中表达量增高且可能与IL－17相关［24－26］，在本研究中获得类似结果。本研究显示肿瘤组织中S100A9的表达量低于正常组织，显示S100A9可能与IL－17的分泌成负相关，与以前的研究结果［27］相似。

综上所述，本研究通过对GEO食管癌芯片数据进行生物信息学分析，显示IL－17在食管癌肿瘤组织中表达量高于正常组织，而与其分泌相关的IL－6在肿瘤组织中表达量高于正常组织，而IL－17影响的MMP－9等因子在肿瘤组织中也高于正常组织，且在组织标本中已经进行相关验证。这显示了生物信息学分析工具在挖掘肿瘤发生机制、疗效评价及预后预测方面的巨大应用价值，相信结合后续分子生物学领域的研究，可以为其他疾病的诊断与治疗提供新的思路。