嗜酸性粒细胞凋亡在变应性鼻炎发病机制中的作用研究*

鲍有为 朱新华

1 变应性鼻炎

变应性鼻炎是变应原激发特应性个体产生IgE，并由IgE 介导肥大细胞脱颗粒释放组胺等炎性介质，多种细胞（肥大细胞、淋巴细胞、中性粒细胞）参与的鼻部I 型变态反应性疾病。其表现症状为：阵发性喷嚏、清水样涕、鼻痒和鼻塞，可伴有眼部症状，包括眼痒、流泪、眼红和灼热感等，多见于花粉过敏患者[1，2]。

变应性鼻炎患者的病理特征是组胺等介质释放，以EOS 为主的多种免疫细胞[3，4]浸润，导致鼻黏膜阻力血管收缩，容量血管扩张,毛细血管通透性增高，副交感神经活性增强，腺体增生，分泌旺盛，感觉神经敏感性增强。EOS 的凋亡的延迟导致大量EOS 浸润在外周血、痰、支气管肺泡灌洗液以及肺组织中。激活后，EOS 的脱颗粒导致这些细胞毒性蛋白的释放，以及大量促炎细胞因子如IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8 和IL-13 的释放，脂质介质包括前列腺素和白三烯[5]，以及活性氧[6]的释放。这种释放会导致局部组织损伤和炎症，以及进一步的炎症细胞聚集（IL-5 的聚集作用）[7]。因此，EOS 目前被认为是过敏性疾病和哮喘的治疗靶点。有选择地针对嗜酸性粒细胞在组织中的积累和存活的药物是迫切需要的[8]。目前EOS 在变应性鼻炎发病机制研究主要问题有二：①EOS 凋亡是如何加速变应性鼻炎进程结束的机制？②如何调控EOS 凋亡以缩短变应性鼻炎的进程？本文在查阅文献的基础上对EOS凋亡在变应性鼻炎的机制进行论述，并对这两个问题进行解答，以期进一步明确EOS 凋亡对变应性鼻炎的作用及临床应用价值[9，10]。

2 嗜酸性粒细胞（EOS）凋亡

2.1 EOS 凋亡的生物学特征

细胞凋亡是一种高度调节的生理机制，可被看作是对于各种生物过程至关重要的细胞程序性死亡，具有重要的生物学意义。凋亡的细胞呈现出染色质浓缩，细胞质皱缩，细胞膜起泡以及含有完整细胞质、细胞器和核碎片的凋亡小体。这些凋亡小体被驻留的吞噬细胞和相邻细胞迅速消除，阻止细胞成分释放到细胞外空间，避免发生炎症和免疫反应。除了形态变化之外，凋亡细胞经历多种不同的生物化学事件，涉及线粒体膜电位的丧失，DNA 片段化和蛋白质裂解。凋亡过程可能通过几种分子途径发生，这其中最显著突出的是涉及线粒体功能畸变引起的内始式途径，以及由细胞膜上死亡受体激活的外始式途径，除此之外还有为数较少的内质网途径。虽然表面上独立，但是这两条凋亡途径中，通过涉及两个途径共有的关键蛋白的精细协调相互作用。

2.2 EOS 凋亡的精准调控

EOS 浸润是变应性鼻炎发病的重要炎症机制，活化的、长期存活的EOS 聚集，释放因子，损伤周围细胞，诱发一系列的症状出现，而EOS 凋亡的延迟进一步维持、加重了这种炎症状态。在机体复杂的内环境中，组织局部EOS 凋亡并非由单一因素所决定，而是受到众多基因和细胞因子等所组成的复杂网络系统的调控。EOS 可能同时受凋亡信号与抗凋亡信号的调控，通过促凋亡因素与抗凋亡因素之间保持相对动态的平衡，完成对EOS 凋亡的调控。

2.2.1 EOS 凋亡机制

EOS 的凋亡主要有两种途径。其内在途径的特征是促凋亡Bcl-2 蛋白家族成员的构象改变，导致外线粒体膜孔的形成。随后细胞色素c 的释放导致与凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）形成复合物，然后激活下游的caspases，促进细胞凋亡（图1）。

外在途径是细胞表面死亡受体三聚导致Fas 介导的蛋白的激活与死亡域（FADD）和TNF-受体1介导的死亡蛋白质（TRADD），负责催化活化的发起者和效应还导致同步分子改变和形态变化与细胞凋亡有关。因此，这两种不同途径的结果是细胞内caspases（半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶家族）的激活，这代表了细胞凋亡的一个标志性事件[11]（图1）。

内质网途径不是EOS 凋亡的主要途径，但是也是行使作用。具体过程有三种方式：①内质网内蛋白成熟和折叠方式异常，导致内质网直接被破坏。②内质网内凋亡蛋白酶Caspases 激活，导致内质网被破坏。③内质网Ca2+信号异常导致内质网破坏（图1）。

图1 嗜酸性粒细胞凋亡机制图。①其内在途径：Bcl-2 蛋白导致细胞色素c 的释放导致与凋亡蛋白酶激活因子-1（APAF-1）形成复合物，激活caspases 促进细胞凋亡。②外在途和戏：死亡受体三聚致Fas 蛋白激活与死亡域（FADD）和TNF- 受体1 介导的死亡蛋白质（TRADD）结合。激活caspases促进细胞凋亡。③内质网途径。

在TGF-β，Fas 抗原系统，siglecl-8 等细胞因子和信号通路调EOS 凋亡，调控的结果是导致EOS进一步存活还是走向凋亡。导致EOS 凋亡的具体进程如下：

①TGF-β：是一种抗炎介质，可拮抗IL-5 和GM-CSF 信号，加速EOS 细胞死亡[6，12]。TGF-β 通过抑制Akt 磷酸化导致calpain 活化，拮抗IL-5 促生存信号。calpain 是高度保守的非溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在钙通量的反应中被选择性激活。Calpain 的激活促进细胞凋亡，故TGF-β 促进EOS 凋亡[12]。在Calpain 激活之前，其内源性抑制剂calpastatin 的丢失。钙蛋白酶抑制剂减少自发和Fas 受体介导的中性粒细胞死亡，而calpastatin 加速中性粒细胞凋亡[13]。因此，calpastatin-calpain 系统是炎症消退过程中Eos 凋亡决定的控制点之一[11，13，14]。

②Fas 抗原系统：Fas 抗原又叫凋亡抗原-1（APO-1）或CD15,是一种45KD 蛋白。属于跨膜蛋白肿瘤坏死因子（TNF）和神经生长因子（NGF）受体家族,它由富含半胱氨酸的胞外区、跨膜区和胞浆内位点组成[15]。胞浆内位点缺乏PTK(酪氨酸激酶)和磷酸酶的共同位点。自然表达或转染表达Fas 抗原的细胞和经抗Fas 抗体交联的细胞均走向凋亡。静止状态下的Eos 同时表达Fas 受体（CD95，APO-1）和Fas 配体。Fas 介导细胞凋亡至少存在两种途径：①Fas 信号通过第二信使神经酰胺传递凋亡信息, 引起抗凋亡基因表达失衡。②配体结合后，Fas 分子形成三聚体，激发胞浆内潜在凋亡效应分子的释放，促进细胞凋亡[12，16]。

③siglec-8：唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素8的激活可诱导细胞凋亡[17]。siglec-8 是一种高水平存在于人和小鼠Eos、嗜碱性粒细胞和肥大细胞表面的单通道跨膜抑制受体。Siglec-8 与糖蛋白和糖脂中的唾液酸结合。配体在肺上皮中表达，并在过敏性炎症和细胞因子如IL-13 中增强。在IL-5 和GM-CSF 存在的情况下，血液Eos 上的siglec-8 抗体的结合或交联会导致线粒体的凋亡以及caspase-8 和3 的激活。这一过程的分子机制有待进一步阐明[13]。不过可以推测siglec-8 导致的EOS 凋亡是通过线粒体途径发生凋亡作用[18]。

2.2.2 其他导致EOS 凋亡的物质

①Pin1：是神经元、肿瘤和免疫细胞凋亡的重要调节因子[19]。Pin1 是一种肽基-丙基异构酶（PPIase），与亲环素（cyclophilin）和FKBP 家族相关。Pin1 参与调控促生存信号和促死亡信号，使其成为一个有吸引力的治疗靶点。OhJ, MalterJS 证实Pin1与活化的Eos 中的Bax、FADD、Pim1、caspase-8 和cIAP2 相互作用[19]：Pin1 与促凋亡和抗凋亡的关键蛋白相互作用；Pin1 是GM-CSF 和IL-5 受体信号转导所必需的，并可阻止Bax 的激活；Pin1 通过FADD 介导外部死亡途径；对于GM-CSF 表达，Pin1 是必需的[20-22]。以上作用位点是通过拮抗EOS 的激活途径，并且发生外界凋亡路径来促进EOS 尽早凋亡。

②糖皮质激素（GC）：在体内主要与糖皮质激素受体（GR）结合后才能发挥作用[23]。GC 以被动扩散方式通过细胞膜入细胞浆，与细胞浆内GR 的DNA结合区结合，形成GR-GC 复合物, 同时其上的hsp90 亚单位分离，GR 的DNA 结合区暴露，GR 蛋白发生一定的构象变化，GC-GR 形成一个同分二聚体的复合物以主动转运方式入细胞核，与染色体内相应的GC 反应成分（GRE）结合，从而启动和调控某些具有一定生物学效应的细胞因子、酶等基因的转录，从而发挥其作用[24]。一般认为GC 可激活一种内源性限制性核酸内切酶，并可下调IL-3、IL-5、GM-CSF 的表达[25]。糖皮质激素除了能促进粒细胞凋亡外，还能增强巨噬细胞的吞噬功能，这可能是一种清除炎症部位凋亡细胞的方法[11]。糖皮质激素治疗的巨噬细胞表现出细胞骨架调控改变，细胞活力增强，并表达高水平的活性Rac，这是参与细胞活力、有丝分裂、伤口愈合和吞噬的关键蛋白[11]。

③影响EOS 的生理过程来促使EOS 凋亡。例如通过作用于细胞周期蛋白MCL-1[26，27]；shRNA 和慢病毒传递方法构建小鼠CCR3-shRNA 表达慢病毒载体。沉默CCR3 基因可以减少EOS 的增殖，促进EOS 凋亡[28]。虽然shRNA 干扰机制目前没有明确，但是可以确定是ShRNA 干扰DNA→RNA→蛋白质转录翻译过程来实现促使EOS 凋亡[29]。丁酸盐下调IL-5RA mRNA 的表达，降低EOS 细胞表面IL-5RA 受体数量，从而降低内皮细胞粘附、转运和存活[8]。

④胞吞作用：最近研究发现，大量的气道局部吞噬细胞来清除凋亡碎片，一些“非专业”吞噬细胞[31]。包括乳腺上皮细胞和微血管内皮细胞也能够吞噬凋亡细胞，并且证明促进EOS 凋亡吞噬可以缓解AR 的症状[32]。虽然上皮细胞和成纤维细胞也可以进行胞吐，但胞吞细胞主要是树突细胞和组织常驻巨噬细胞的特殊亚群，如库普弗细胞和小胶质细胞[33]。巨噬细胞等吞噬细胞是利用胞外代谢物促进抗炎细胞的激活，最终导致组织修复[34]。这提示气道上皮细胞在哮喘EOS 炎症的解决中发挥非被动作用。尽管潜力为炎症性疾病的治疗提供新的治疗方法，在目前的炎症性气道疾病模型中，对这些细胞吞噬能力的操纵的研究工作很少[18，30，31]。

2.3 EOS 激活机制及细胞因子的作用

嗜酸性粒细胞激活机制较复杂，本文主要分析嗜酸性粒细胞激活IL-5、IL-13 和GM-CSF 在细胞激活后表达这些细胞因子，虽然数量很低，但足以诱导生存。GN-CSF 或IL-5 信号通路通过抑制Bax促凋亡功能上调Bcl-xL 的表达并抑制caspase 的激活。其他支持Eos 生存的细胞因子包括Leptin、TNF-a、IL-33 和IFN-c 调控PI3K/AKT、PI3K/PKC和Erk 的功能从而抑制bax 基因或激活NF-KB 基因（图2、图3）。

图2 嗜酸性粒细胞激活途径：IL-3、IL-5、IL-13 和GM-CSF 在细胞激活后表达这些细胞因子，虽然数量很低，但足以诱导生存。GM-CSF 或IL-5 信号通路通过抑制Bax 促凋亡功能上调Bcl-xL 的表达并抑制caspase 的激活。其他支持Eos 生存的细胞因子包括Leptin、TNF-a、IL-33 和IFN-c 调控PI3K/AKT、PI3K/PKC 和Erk 的功能从而抑制bax 基因或激活NF-KB 基因。

图3 各种细胞因子详情表

3 EOS 凋亡在变应性鼻炎中的作用

细胞凋亡(Apoptosis)是一种主动的、由基因调控的、不同于坏死的细胞死亡形式，是细胞衰老、死亡过程的主要形式。正常时EOS 主要通过凋亡的方式从组织中清除。近几年，很多科研人员发现，可以通过控制EOS 凋亡来调控变应性炎症[10，43]。

哮喘[44]和变应性鼻炎两者常同时存在，且常常互为因果。哮喘在EOS 的研究较多。针对EOS 炎症最成功和研究的治疗是针对白介素-5 途径的治疗，因此针对哮喘使用糖皮质激素和抗IL-5 受体药物是近几年的研究热点[45，46]。朱新华等[28]通过慢病毒shRNA 敲除CCR3 能有效抑制EOS 增殖，促进嗜酸性细胞凋亡。虽然这些效应背后的机制未被完全阐明，但可以发现：促使EOS 凋亡可以明显缩短变应性鼻炎的发病进程。最近的研究表明[30]，在小鼠体内，黄酮胡黄素可抑制EOS 凋亡，这提示调节EOS凋亡是治疗变态反应性疾病的一个真正的靶点。Theiler A 等[8]的实验研究表明：SCFA 可以通过丁酸酯通过限制EOS 的运输和存活来改善过敏性气道炎症。短链脂肪酸中，特别是丁酸对人EOS 有直接影响，通过浓度依赖性地降低IL-5RA mRNA 的表达，降低EOS 细胞表面IL-5RA 受体数量，从而降低内皮细胞粘附、转运和存活的ERMS。而Miriam Peinhaupt等[47]研究发现DP1 受体通过SRE 诱导和促炎基因的诱导促进细胞存活。因此，靶向DP1 受体，同时靶向DP2，可能有助于嗜酸性疾病的抗炎治疗。Felton 等[30]的研究证实了巨噬细胞介导的凋亡细胞清除有助于过敏性气道炎症的缓解，提示增加凋亡细胞清除率是治疗过敏性气道炎症的一种潜在治疗策略。而Felton JM 等[27]也发现EOS 细胞表面Mcl-1（一种抗凋亡蛋白）保护EOS 的凋亡从而加重过敏性气道炎症。值得注意的是，这与糖皮质激素诱导的EOS 凋亡相反，后者可被IL-5 等细胞因子的存在所消除。

EOS 在哮喘和其他变态反应性疾病的发病过程中是重要的效应细胞。在过敏性炎症过程中，IL-5、IL-3 和GM-CSF 等生存促进因子敏感性地提高了EOS 的存活，从而促进了气道中EOS 的积累。活化的EOS 胞是细胞因子、生长因子和细胞毒颗粒蛋白(如嗜酸性神经毒素和主要碱性蛋白) 的主要来源，这些蛋白的释放可导致组织损伤和气道重塑。因此，EOS 目前被认为是过敏性疾病和哮喘的主要治疗靶点。目前迫切需要有选择性地针对EOS 在组织中的积累和存活的药物[1，2，8]。

4 小结

嗜酸性粒细胞在呼吸道过敏性疾病发病过程中是重要的效应细胞。在过敏性炎症过程中，对EOS 细胞的凋亡和胞吞作用的的研究为炎症性气道疾病的治疗提供了新的见解，尤其是以嗜酸性粒细胞为主的气道炎症。这两种方法可用于治疗干预，允许成功操纵炎症解决，并减少与现有治疗相关的不良反应。因此，通过控制嗜酸性粒细胞凋亡来调控变应性炎症，目前并且未来可能是过敏性疾病的主要治疗关注点。