潜在生物标记物NRG2在前列腺癌中的诊断和预后的作用

柳兴源，魏国华，李菁媛

(1.锦州医科大学基础医学院，2.锦州医科大学附属第一医院药学部，辽宁 锦州 121000)

前列腺癌(prostate adenocarcinoma，PRAD)作为美国和欧洲男性癌症死亡的第二大原因，影响着全世界数以百万计的男性，全球每年有超过110万例新诊断病例和30万例死亡，近年来我国前列腺癌的发病率和死亡率都在迅速上升，它的风险因素包含家族病史、种族、年龄、遗传因素及饮食因素等[1]，被诊断为转移性前列腺癌的患者的存活率仅为29.8%[2]。根据多个临床病理特征，如年龄、肿瘤大小、肿瘤侵犯的范围(分期)、癌细胞恶性程度(依据Gleason score评分法)、血中PSA浓度、微血管侵犯、血栓形成和微卫星区域的存在，研究者已经尝试了多种方法推断前列腺癌的发生和转归[3]。然而，具有相同临床病理特征的前列腺癌患者往往表现出不同的预后[4]，提示可能有多个复杂的分子和细胞事件参与了前列腺癌的发生和侵袭性进展。由于缺乏早期诊断特异性生物标志物，确诊的患者大多处于晚期，生存率较低。但随着高通量技术的迅猛发展，当前研究者可以获得人类癌症基因组学相关的丰富信息。利用公开的转录组数据的微阵列集通过生物信息学综合分析揭示肿瘤的特定生物标记物和治疗靶点特异性标志物和预测生化复发的独立危险因素、阐明肿瘤进展的分子机制、识别区分前列腺癌发展的不同阶段的关键标志物，对于改进治疗策略至关重要[5]。

本研究从现有的肿瘤数据集合中收集基于临床特征的差异表达或遗传变异的重要基因和蛋白，进行生存分析的验证和基因表达趋势稳定性验证得到候选基因，构建了相关基因蛋白质-蛋白质相互作用网络并进行了富集注释，而后qRT-PCR实验在前列腺癌患者和正常男性志愿者血浆中进行候选肿瘤标志物的mRNA的差异表达特异性和诊断敏感性验证，以筛选前列腺癌中的可用于诊断和预后的潜在生物标记物。

1 资料与方法

1.1 一般资料

1.1.1 表达谱的获取和差异表达基因的筛选

选择存储在GEO中的数据集GSE74685前列腺癌基因表达谱，包含来自63个患者的176个原发、转移前列腺癌样本以及逐个个体的匹配的良性组织样本[6]。通过R软件limma包，截断值设置为P<0.05和[log(foldchange)]>1.5，使用差异标准化读取计数和无监督的分层聚类选择了100个差异表达最高的基因作为候选基因，并对其进行进一步的研究。

1.1.2 候选基因的生存分析和表达稳定性验证

GEPIA是一种包含32种癌症类型、9736个肿瘤样本的数据的用于分析核酸测序表达数据的工具。基于TCGA提供的总体生存数据，与患者生存率显著相关的基因通过LogRankP值被计算出来并显示生存曲线。同时验证已筛选出的候选基因在前列腺癌和正常组织中的表达状况，结果以柱状图的形式展示。

1.1.3 PPI网络构建和富集分析

将确定的候选基因导入STRING数据库，获得PPI网络并进行可视化。使用Gene Ontology数据库对相关蛋白进行GO分析和通路富集分析，使用Fisher’s精确检验，将判定条件设置为错误发现率(false discovery rate，FDR)P<0.05。

1.1.4 患者和样本

选取2019年1月至2020年8月期间，在锦州医科大学附属第一医院间接受手术的214个前列腺癌患者，手术前患者未接受过放疗或化疗。由锦州医科大学附属第一医院两名以上经验丰富诊断医生根据泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学(WHO肿瘤分类2016)进行系统准确诊断和分级分期。214例前列腺癌患者术前取外周血3 mL，分离血浆。按照年龄和性别匹配的标准从161名健康男性志愿者身上采集了新鲜的正常血浆样本。所有外周血样均采用乙二胺四乙酸(EDTA)作为抗凝剂。招募前获得每个患者的书面知情同意，所有涉及人类受试者的研究进过锦州医科大学伦理审查委员会批准。

1.2 qRT-PCR检测

用TRIzol试剂从血浆中提取总RNA，进行RNA提取、逆转录和实时荧光定量PCR。所有的cDNA都是按照制造商的说明用SuperScript III First-strand Synthesis System(Invitrogen，18080-051)进行反转录成cDNA，并使用Power SYBR Green PCR Master Mix进行扩增和检测。NRG2引物序列为：正向：5’-tttccagatgtccataggttac-3’，反向：5’-ttttggctgagctcactcacat-3’；使用GAPDH作为对照，引物序列为5’-tcgacagtcagccgcatcttcttt-3’和5’-accaaatccgttgactccgacctt-3’。按照厂商说明在OpenArray®(Life Technologies)平台上采用定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)测量了mRNA的表达水平，分析相关表达数据，并且归一化。

1.3 统计学方法

qRT-PCR检测mRNA表达数据的统计分析比较采用t检验。建立受试者工作特征(ROC)曲线评价其诊断价值。使用Graphpad Prism 8.0.2软件进行所有统计分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 前列腺癌候选生物标记物的筛选

本研究分析来自NCBI GEO服务器中的GSE74685前列腺癌基因表达谱，确定了100个差异表达最大的候选基因(50个上调的候选基因和50个下调的候选基因)，结果以热图的形式显示，红色表示上调，蓝色表示下调，见图1。

2.2 候选基因表达验证和生存分析

对来自TCGA前列腺癌数据基因表达谱差异表达TOP100候选基因进行生存分析验证后发现，在前列腺癌患者(n=502)中PLK1、PAQR6和NRG2这3个候选基因与总生存期相关。以中位数为截断标准，生存曲线显示，PLK1和PAQR6高表达的前列腺癌患者与低表达前列腺癌患者相比，总生存期缩短；NRG2高表达的前列腺癌患者与低表达前列腺癌患者相比，总生存期延长(LogRankP<0.05，差异有统计学意义)。PLK1，PAQR6和NRG2在前列腺癌不同数据集合的表达稳定程度，见图2，使用GEPIA验证得到箱式图显示，NRG2在前列腺癌组织中稳定低表达(与对照组相比，*P<0.05)。

2.3 PPI网络构建和富集分析

利用STRING数据库，为NRG2相关基因模块中的构建了蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络，图3。NRG2相关基因模块在生物进程与调节表皮生长因子激活的受体活性(GO：0045741)，跨膜受体蛋白酪氨酸激酶活性的激活(GO：0007171)，正向调节表皮生长因子激活的受体活性(GO：0007176)等过程有关；在细胞组分富集在ERBB3：ERBB2复合物(GO：0038143)，凝结素包裹的内细胞囊泡膜(GO：0030669)，凝结素包裹的内细胞囊泡(GO：0045334)部位；在分子功能主要参与ERBB-3类受体结合(GO：0043125)，跨膜受体蛋白酪氨酸激酶激活剂活性(GO：0030297)，表皮生长因子受体结合(GO：0005154)等功能。通路分析显示EGF受体信号通路(P00018)，钙粘蛋白信号通路(P00012)等相关，见表1。

图1 前列腺癌数据集合GSE74685得到差异表达基因

A，D：PLK1；B，E：PAQR6；C，F：NRG2

图3 STRING数据库构建NRG2相关基因PPI网络

2.4 qRT-PCR检测

qRT-PCR检测发现NRG2的mRNA在前列腺癌患者血浆中表达低于正常男性志愿者血浆的表达(与对照组相比，***P<0.001)。采用ROC曲线评价NRG2的潜在诊断价值，ROC曲线下面积(AUC)值为0.9657，P<0.001，见图4。

表1 NRG2相关基因模块富集分析

图4 qRT-PCR定量检测前列腺癌患者与健康男性血浆中NRG2的mRNA的相对表达量和NRG2在前列腺癌中受试者工作特征(ROC)曲线诊断效能分析

3 讨 论

早期发现和疾病进展检测仍然是治疗前列腺癌的有效方法。由于现有的生物标记物如血清新喋呤和Ki67等缺乏足够的特异性，目前还没有一种准确预测前列腺癌预后的方法，因此迫切需要新的前列腺癌的诊断和预后预测的标记物[7]。在我们的研究中，对公开基因芯片数据进行筛选得到候选基因，其中PLK1、PAQR6和NRG2等3个候选基因与总生存期相关，只有NRG2与之前研究一致且具稳定，NRG2蛋白相互作用模块的网络构建对理解相互作用和后续研究提供了线索和方向。

NRG2作为ErbB蛋白家族中的成员，在各种成人组织中均有表达，包括脑、前列腺、肾脏等，被认为在涉及神经发生和调节的多种人类疾病中起重要的作用[8]。NRG2蛋白水解后释放胞外结构域通过与ERBB受体家族的相互作用，诱导上皮细胞、神经元细胞和其他类型细胞的生长和分化，作用于组织中的不同位点并在细胞中引发不同的生物反应来介导不同的生物学过程。通路富集分析显示NRG2相关基因模块与EGF受体信号通路，钙粘蛋白信号通路等相关。在前列腺癌患者群中，检测EGFR表达可能对确定预后有理论意义[9]，通过靶向EGFR途径阻断癌症转移的新的治疗潜力，联合使用EGFR可能提高当前诊断和预后准确性和疗效，从而控制肿瘤发展到致命的状态[10]。钙黏蛋白在前列腺癌发展中发挥关键作用，E-cadherin有望成为侵袭性前列腺癌的预后因子[11]，并且与根治术后生化复发存在密切联系[12]。这些都与本研究的结果一致。

qRT-PCR检测说明NRG2具有成为前列腺癌早期诊断和预后预测的稳定生物标记物的潜力；ROC曲线AUC值越大，说明用于诊断潜在价值越高。发现在血浆中有研究筛选了6个对前列腺癌术后的生化复发具有较强预测作用的标记基因，其中包括NRG2，与本研究具有一致性[13]。Wouter R. Karthaus等利用单细胞RNA测序在mRNA水平上检测到配体表达的最大变化是NRG2，论证出在器官和小鼠中雄激素驱动生长因子NRG2表达后，通过间充质细胞以旁分泌方式作用于腔细胞而驱动前列腺再生的结论[14]，这也支持了我们的研究。在肿瘤研究领域，NRG2的差异甲基化CpG岛与石棉接触者肺癌组织致癌作用存在显著相关性[15]。不仅如此NRG2因其在精神障碍相关行为的神经发生和调节的作用而受到越来越多的关注。

本研究存在几个限制因素：首先，所有临床研究病例均来自一家医院并且样本数量较小，因此需要以后进行长时程、多中心、大样本量的研究验证。其次，本研究从大数据分析和临床血浆样本中得出的结论，NRG2调节前列腺癌增殖、侵袭和转移的详细分子机制还有待进一步动物和细胞实验研究和验证。

本研究发现了NRG2在前列腺癌中表达下调，并可能作为一种新的前列腺癌诊断和预后的生物标记物，并且参与调节前列腺癌的发生和发展。这对肿瘤作用机制深入的理解、基因数据精准挖掘、新抗原预测优化算法以及前列腺癌精准免疫治疗的应用起到积极的作用。