葛根提取物对产气荚膜梭菌感染肉鸡生长性能和肠道屏障功能的影响

刘 阳，张 钊，郭双双，李 冰，滕 奕，邓翠芳，丁斌鹰，易 丹

（武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023）

产气荚膜梭菌（，CP）为芽孢杆菌科梭状芽孢杆菌属，属于革兰氏阳性菌，是一种厌氧病原微生物，最常见类型为由毒素致病的A型，可引起禽坏死性肠炎（Necrotic Enteritis，NE）和其他动物肠道疾病。1961 年，NE 首次被发现，该病主要防治的方法是在畜禽饲粮中添加抗生素，但抗生素的长期使用会导致产气荚膜梭菌抗药性和传播性大大增加，威胁环境和食品安全。随着饲料禁抗、养殖减抗的深入实施，NE 已成为家禽业的最大挑战。因此，寻找出绿色安全、有效缓解畜禽肠道疾病负面影响的饲料添加剂尤为重要。

葛根提取物（Pueraria Extract，PE）中含有葛根素、大豆苷元、葛根皂苷、葛香豆雌酚以及甘露醇、5-甲基海因等活性成分。研究表明，PE 具有-肾上腺素受体阻断、调节血管舒张收缩、缓解风寒感冒症状及解酒护肝等药理作用，还具有一定抗氧化、清除自由基能力，小剂量PE 能促进小鼠脾淋巴细胞增殖，抑制瘤细胞DNA 表达。Wu 等研究表明，葛根素可改善感染PEDV 仔猪的肠道功能；Li 等研究证实，葛根素可减轻黏膜屏障功能障碍，增加黏蛋白（MUCIN-2 和MUCIN-4）水平和杯状细胞数。当前，PE 在大鼠、猪、奶牛上的研究较多，但在家禽中的研究较少。为此，本研究利用Du 等构建的CP 感染肉鸡模型，研究PE 对CP 感染肉鸡生长性能、肠道组织形态和屏障功能相关基因表达的影响，探明PE 改善肉鸡生长性能和肠道健康的作用效果，为PE 在畜禽生产中的应用提供理论依据和参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与基础日粮 A 型产气荚膜梭菌CVCC2030购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。试验所用葛根提取物购于上海阿拉丁生化科技有限公司。基础饲粮为玉米-豆粕型，参照《鸡饲养标准》（2004）配制，其组成和营养成分见表1。

表1 基础饲粮组成和营养成分（风干基础）

1.2 试验设计 选取264 只1 日龄健康的科宝肉鸡母雏，采用2×2 双因素设计，随机分为对照组、CP 组、PE 组、PE+CP 组4 个处理，每个处理6 个重复（笼），每个重复11 羽，试验期为30 d。试验全期，对照组和CP组饲喂基础饲粮，PE 组和PE+CP 组在基础饲粮的基础上添加400 mg/kg PE。CP 组和PE+CP 组肉鸡在18～23日龄连续灌服的A 型CP 新鲜菌液（1×10CFU/mL），每只鸡每天灌服1 mL。同时对照组和PE 组肉鸡灌服不含产气荚膜梭菌的灭菌肉汤培养基1 mL。

1.3 饲养管理 肉鸡网上平养，试验前对鸡舍和试验所用设备进行彻底消毒灭菌，鸡舍熏蒸处理。肉鸡进行常规疫苗接种，自由采食和饮水，定期打扫鸡舍并消毒。试验温度控制：第1 周32～34℃，温度每周降低2～3℃，直到降至22℃，维持至试验结束。鸡舍湿度控制在50%～60%。

1.4 测定指标与方法

1.4.1 生长性能 分别于试验第1、17、23、30 天以重复（笼）为单位对试验鸡进行空腹称重（称重前8 h 断料不断水），并计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和耗料增重比（FCR）。每天记录各组肉鸡的健康情况。

1.4.2 样品采集 在试验第23 天，每个重复随机抽取2只鸡，使用抗凝真空采血管进行翅下静脉采血，然后采用颈动脉放血法致死。血样静置30 min，在4℃条件下使用低温高速离心机3 500 r/min 离心10 min，取上清分装于干净的EP 管中，-80℃冷冻保存。无菌条件下打开腹腔，取十二指肠、空肠、回肠中段各1 cm 于预冷的4%多聚甲醛中固定。另取十二指肠、空肠、回肠中间部分（长约10 cm），剖开肠段后用预冷的无RNA酶水冲洗肠道内容物，刮取肠黏膜，置于无RNA 酶离心管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱中保存待测。

1.4.3 肠道形态测定 肠道组织固定样送往武汉博士德公司生物工程有限公司进行石蜡包埋，制作HE 染色切片。每张切片选择10 个走向平直且相对完整的绒毛，在OLYMPSBX-41TF 型光学显微镜下对肠道形态结构进行观察，测量所选绒毛的绒毛高度（VH）及其对应的隐窝深度（CD），并计算绒毛高度与隐窝深度的比值（VH/CD），取10 根绒毛数据的平均值作为此切片的最终测量值。

1.4.4 血清二胺氧化酶（DAO）活力检测 取分装好的血清，按照检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）操作说明书检测血清DAO 活力。

1.4.5 肠黏膜屏障基因mRNA 相对表达量的检测 将十二指肠、空肠和回肠黏膜样品于液氮中研磨，采用RNAiso Plus 试剂（TaKaRa，大连）提取各样本的总RNA，并使用Nanodrop 测定所提取的RNA 浓度和纯度。采 用PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa，大连）进行反转录合成cDNA。采用SYBRPremix Ex Taq试剂盒（TaKaRa，大连）在实时荧光定量PCR 仪（ABI 7 500，ThermoFisher Scientific，美国）上进行基因表达测定。检测的屏障功能相关基因为闭合蛋白（）、紧密连接蛋白-2（）、黏蛋白-2（）、黏蛋白-5ac（）和钙粘附蛋白-E（）。以-为内参基因，以对照组为参照，采用2-ΔΔCt 法计算各基因的相对表达量。基因的引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，基因引物序列见表2。

表2 基因的引物序列

1.4.6 血清IgA 及肠道分泌型IgA（sIgA）含量测定采用ELISA 方法检测血清中IgA 和肠道sIgA 含量。试验前使用ELISA 试剂盒（Chicken IgA ELISA Kit，Bethyl Laboratories，Cat No.E33-103）提供的Dilution Buffer（需从10× 稀释至1×）对血清进行稀释处理，肠道组织样品需匀浆后再进行稀释处理。样品前处理完成后，按试剂盒提供的试剂及方法建立标准曲线并进行测定，反应终止后使用全自动酶标仪（SpectraMax190，Molecular Devices，美国）在450 nm 波长下读取样品吸光值，使用ELISACalc 软件选择四参数方程进行标准曲线拟合，根据吸光值计算出血清样品中IgA 及肠道样本中sIgA 的含量。样品蛋白质浓度按照蛋白定量测定试剂盒说明书（南京建成生物工程研究所）检测。

1.5 统计分析 除1～17 日龄生长性能数据采用单因素分析外，其他数据采用SPSS 25.0 统计分析软件中一般线性模型（GLM）进行双因素方差分析，当差异显著时，采用Duncan's 多重比较进行分析。<0.05 为差异显著，试验结果用平均值与SEM 表示。

2 结果

2.1 PE 对CP 感染肉鸡生长性能的影响 由表3 可知，添加PE 降低了1～17 日龄肉鸡的ADFI（<0.05），而对1～17 日龄肉鸡ADG、FCR 无显著影响；添加PE 与CP 感染对18～23 日龄肉鸡FCR 具有交互作用（<0.05）；与对照组相比，CP 感染提高了18～23 日龄肉鸡FCR；与CP 组相比，添加PE 有抑制18～23 日龄肉鸡FCR上升的趋势（>0.05），对18～23 日龄肉鸡ADG 和ADFI 无显著影响；添加PE 对24～30 日龄肉鸡ADG、ADFI 和FCR 均无显著影响。

表3 PE 对CP 感染肉鸡生长性能的影响

2.2 PE 对CP 感染肉鸡血清DAO 活力和肠道组织形态的影响 由表4 可知，与非感染组相比，CP 感染和PE处理均提高了23 日龄肉鸡血清DAO 活力（<0.05）。对于23 日龄肉鸡肠道组织形态，CP 应激增加了十二指肠CD，并降低了VH/CD（<0.05）。添加PE 和CP 感染对23 日龄肉鸡十二指肠VH 和VH/CD、回肠VH 和VH/CD 具有交互作用（<0.05）：与对照组相比，CP 感染降低了23 日龄肉鸡十二指肠和回肠VH、VH/CD（<0.05）；与CP 组相比，添加PE 有抑制23日龄肉鸡十二指肠和回肠VH 和VH/CD 降低的趋势（>0.05）。

表4 PE 对23 日龄CP 感染肉鸡血清DAO 活力和肠道组织形态的影响

2.3 PE 对CP 感染肉鸡肠道屏障基因表达的影响 由表5 可知，在第23 日龄，添加PE 和CP 感染对肉鸡十二指肠、空肠、回肠和及回肠和的相对表达量具有交互作用（<0.05）：与对照组相比，CP 感染下调了十二指肠和空肠、的相对表达量（<0.05）；与CP 组相比，添加PE 抑制了其相对表达量的下调并回调至对照组水平，其中十二指肠的相对表达量高于对照组。与对照组相比，PE 组和CP 组下调了肉鸡回肠和的相对表达量（<0.05），PE+CP 组和的mRNA 表达量高于其他3 组（<0.05）。

表5 PE 对23 日龄CP 感染肉鸡肠道屏障功能基因相对表达量的影响

2.4 PE 对CP 感染肉鸡免疫球蛋白含量的影响 由表6可知，与不添加PE 相比，饲粮中添加PE 提高了23 日龄肉鸡血清IgA、十二指肠和空肠sIgA 含量（<0.05）。与非感染组相比，CP 感染显低了23 日龄肉鸡回肠sIgA 含量（<0.05）。

表6 PE 对23 日龄CP 感染肉鸡血清IgA 和肠道sIgA 含量的影响

3 讨论

3.1 PE 对CP 感染肉鸡生长性能的影响 葛根主要提取物——葛根素是一种异黄酮类化合物，而黄酮类物质能改善肠道健康、促进动物生长。葛根作为药食同源性物质，已被农业农村部列入饲料原料目录，但其在肉鸡生产上的应用较少且研究结果不一致。刘博等研究发现，添加10 mg/kg 葛根总黄酮能提高AA 肉鸡的生长性能。吕梦云研究表明，饲粮添加不同含量葛藤黄酮提取物可在一定程度上提高肉鸡ADG，但差异不显著。汪纪仓等研究表明，饲喂不同水平的葛根素对AA 肉鸡生长性能无显著影响。本试验发现，在未感染期（1～17日龄）PE 显著降低了肉鸡的ADFI，改善肉鸡FCR，从而提高肉鸡生长性能。Li 等研究发现，CP 感染降低了肉鸡的ADG，提高了FCR。同样，本研究也表明，在CP 感染期（18～23 日龄），CP 感染显著增加了肉鸡FCR，但饲粮中添加PE 可明显抑制CP 感染导致的肉鸡FCR 增加，表明PE 可一定程度上缓解CP 感染导致的肉鸡生产性能下降。本研究发现，在CP 感染后期（24～30 日龄），PE 对肉鸡ADG、ADFI 和FCR 等指标均无显著影响。因此，PE 可能对处于应激状态肉鸡的生长性能具有积极作用。

3.2 PE 对CP 感染肉鸡肠道形态和屏障基因表达的影响 正常生理条件下血清DAO 水平很低，但当肠屏障受损时，肠屏障通透性增加，大量DAO 被释放到血液。Wang 等研究表明，鸡白痢沙门氏菌感染使肉鸡血清DAO 活力在数值上升高，但差异不显著。Lan和Wu等研究表明，热应激显著增加了肉鸡血清DAO 活性。因此，血清DAO 活性可作为监测肠道通透性和屏障损伤的指标。本试验中CP 感染肉鸡的血清DAO 活力显著上升，表明CP 感染可使肉鸡肠道通透性增强、屏障功能受损，与Liu 等的研究结果一致。有关PE 饲粮提高了肉鸡血液DAO 活性的原因有待进一步研究。

肠道健康对肉鸡生长至关重要，肠道VH、CD 和VH/CD 是衡量肠道健康状况的重要指标。绒毛顶端的细胞功能成熟且活跃，在肠道健康程度较高时，小肠绒毛较高，隐窝较浅，此时小肠消化吸收功能较强；而当绒毛变短，隐窝变深，表明肠道上皮细胞正迅速周转，顶端上皮细胞减少，消化能力减弱。当肠黏膜组织受损时，肠黏膜层会变薄、绒毛变短、绒毛表面积减少、隐窝变浅。Cheng 等研究表明，CP 感染会使肉鸡十二指肠和空肠产生坏死性病变。Li 等研究也发现，CP 感染后肉鸡肠道的VH 和VH/CD 显著降低。本试验中，CP 感染显著增加了肉鸡十二指肠CD 并降低了十二指肠和回肠VH 及VH/CD，表明CP 应激导致肉鸡肠道组织形态异常，诱导肠道损伤，与Cheng 等的研究结果相似，但损伤肠段略有不同，可能与CP 感染方式不同有关。Prihambodo 等分析表明，当饲粮中添加黄酮类化合物时，随着黄酮剂量的增加，十二指肠VH 显著增加，且十二指肠和空肠VH/CD 也明显提高。尽管本研究中CP 感染显著降低了23 日龄肉鸡十二指肠和回肠VH 及VH/CD，但日粮中添加PE 有增加23 日龄肉鸡十二指肠VH 和VH/CD 的趋势，表明PE 可能具有改善CP 感染肠道组织形态异常的作用。

肠道屏障由机械屏障、化学屏障、微生物屏障和免疫屏障组成，其中机械屏障又称物理屏障，由上皮细胞和连接复合体组成，连接复合体由紧密连接（TJ）组成。TJ 蛋白是维持上皮细胞完整性的关键，包括OCCLUDIN、CLAUDIN、CADHERIN 连接、GAP 连接和桥粒等。而肠道屏障功能受损或肠道通透性增加会导致细菌移位和致敏化合物从肠道进入机体，从而诱发免疫反应，增加机体感染风险。CLAUDIN 是构成紧密连接的结构骨架蛋白，其中CLAUDIN-2 与细胞旁孔道形成有关，可使细胞旁路通透性增强。研究表明，CP 肠毒素（CPE）是一种具有细胞毒性的毒素，能直接将CLAUDIN 家族作为细胞表面受体附着。Saitoh等认为，CPE 可与特定的CLAUDIN 结合，导致TJ的解体和细胞旁跨上皮细胞层的通透性增加。此外，Singh 等研究表明，在Caco-2 细胞单层中肠毒素与其受体（CLAUDIN）结合后，CPE 还可以与其他TJ（如OCCLUDIN）相互作用。Song 等研究表明，患坏死性肠炎的肉鸡空肠Claudin-1、Claudin-4、和的表达显著下调，表明CP 分泌的肠毒素是损伤肠上皮细胞紧密连接的主要诱因之一。本试验中，CP感染显著下调了回肠相对表达量以及十二指肠、空肠和回肠的相对表达量，饲粮中添加PE 能抑制十二指肠和空肠相对表达量的继续下调，并使之回调至对照组水平，这表明饲粮中添加PE 可能通过特异性调控肠道表达缓解CP 感染对肠道造成的损伤；而添加PE 对回肠相对表达量的下调没有抑制效果，可能与PE 作用的肠段位点有关。

E-cadherin 是黏着连接（AJ）中肠黏膜屏障的关键成分，对肠道通透性至关重要。Zhang 等试验表明，-茶氨酸可以提高肉鸡肠道中的mRNA表达水平。本研究中，CP 感染可显著下调肉鸡肠道的相对表达量，进一步说明CP 感染可能诱导肠道通透性变化；而添加PE 抑制了十二指肠和空肠相对表达量下调，使感染组的相对表达量上调至对照组水平，表明饲粮中添加PE 能起到一定缓解作用。消化道黏蛋白（MUCIN）是消化道屏障主要成分。研究表明，MUCIN-2 的合成发生在杯状细胞，该蛋白的缺乏会造成细菌易位和肠道炎症。Gharib-Naseri 等研究表明，感染坏死性肠炎下调了肉鸡相对表达量，但上调了相对表达量。Kitessa 等研究表明，CP 和艾美耳球虫混合感染能显著下调的相对表达量。本研究结果也表明，CP 感染有下调肉鸡回肠相对表达量的趋势，但添加PE 能抑制其下调并回调至对照组水平；添加PE 可显著上调回肠的相对表达量，表明添加PE 能在一定程度上调控CP 感染肉鸡基因表达。Wu 等通过荧光强度检测试验也表明，葛根素能增加在结肠组织中表达。因此，饲粮中添加PE可能通过调控肠道屏障功能相关基因的表达，缓解CP感染造成的肉鸡肠道损伤。

3.3 PE 对CP 感染肉鸡屏障免疫的影响 IgA 通常分为血清型IgA 和sIgA。血清型IgA 具有多种抗体活性，能与抗原特异性结合，从而减少这些抗原诱导的炎症反应发生；sIgA 是由分泌IgA 的浆细胞产生的特异性免疫球蛋白，它能保护肠上皮细胞免受病原体侵袭，对保护消化道黏膜具有重要作用。Zhang 等研究表明，大肠杆菌感染降低了肉鸡空肠sIgA，并使肠道通透性增加，增强了大肠杆菌在肠细胞上的定植，导致肠道屏障功能紊乱。本研究也发现，CP 感染在数值上降低了血清IgA、空肠和回肠sIgA 含量，但差异不显著。Jiang 等研究中，传染性法氏囊病病毒（IBDV）也对血清IgA 含量没有显著影响；Kulkarni研究表明，肠道抗体反应主要由IgY 主导，系统免疫产生的特异性IgY 比特异性IgA 更多，黏膜IgY 对CP 诱导的坏死性肠炎的免疫反应更重要，而CP 蛋白对黏膜IgA 的反应性较弱，表明免疫球蛋白水平的变化可能与感染的病原体不同有关。Zhang 等发现，饲粮中添加染料木黄酮能抑制大肠杆菌感染导致的sIgA 降低，提高空肠sIgA 水平。Jiang 等也认为，大豆异黄酮能增加感染IBDV 肉鸡的血清抗体含量。因此，IgA 在宿主防御黏膜传播的病原体中起重要作用，可阻止病原体与上皮细胞结合，中和它们的毒素以维持黏膜表面动态平衡。本试验发现，饲粮中添加PE 能显著提高血清IgA 及十二指肠、空肠和回肠sIgA 含量，表明饲粮中添加PE 能有效提高肉鸡黏膜免疫功能与防御能力。Peng 等试验证实，饲粮中添加800 mg/kg 葛根素能提高IgA、IgM 和IgG 含量。本研究中，当肉鸡处于CP 感染应激时，添加PE 一定程度上提高了血清IgA、十二指肠和空肠sIgA，表明PE 具有缓解CP 感染肉鸡肠道免疫功能下降的积极效果。

4 结论

本研究结果表明，饲粮中添加PE 可抑制CP 感染肉鸡FCR 的增加，改善了肠道组织形态，提高了肉鸡免疫功能，并调节肠道屏障功能相关基因表达。