多浪羊GnRHR 基因克隆、初情期组织表达研究及生物信息学分析

张继虎，隋志远，李庆瑾，张志帅，邢 凤*

（1.塔里木大学动物科学学院，新疆阿拉尔 843300；2.新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室，新疆阿拉尔 843300）

初情期是动物初次发情并排卵的时期，,也是繁殖能力开始的时期。下丘脑-垂体-性腺轴（Hypothalamic-pituitary-gonad Axis，HPG 轴）在 初情期的启动过程中发挥着重要作用，其中初情期开始的标志是下丘脑促性腺激素释放激素（GnRH）的脉动性分泌刺激垂体促性腺激素细胞中基因的表达。垂体GnRHR 和GnRH 结合可激活下游的几个信号级联，包括肌醇1,4,5-三磷酸、丝裂原活化蛋白激酶、二酰甘油和腺苷酰环化酶途径，促使促黄体生成素（LH）和促卵泡素（FSH）的合成与释放。FSH 和LH 能够作用于性腺，使得性腺释放各类类固醇激素，从而使动物生殖器官开始发育直至成熟。具有7 个跨膜结构，还具有一个胞外氨基末端和一个胞内COOH末端，是典型的G 蛋白偶联受体家族成员。自从在大鼠垂体中克隆得到第1 个后，许多物种GnRHR 也被成功克隆，其中包括鸭、鸡、牛蛙、纹状壁虎、黑鲈和蟹等动物。

多浪羊具有肉质好、初情期来临早等优点，是生产羔羊肉的理想品种，国内外少有对多浪羊初情期基因及TA 克隆表达等相关的研究报道。因此，本研究利用克隆测序、生物信息学分析和实时荧光定量PCR 的方法，对多浪羊基因的CDS 序列进行克隆、分析以及测定初情期前、初情期和初情期后HPG 相关组织的表达量，为研究基因的功能和进一步阐明GnRHR 如何影响绵羊初情期的启动过程提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 于新疆麦盖提县良种多浪羊繁育中心，采用公羊试情法（每天10:00、18:00 2 次试情）和外阴观察法，选取初情期前（90 日龄）、初情期（第1 次发情4～6 h 内）和初情期后（初情期结束10 d 后）的多浪羊各5 只，取适量上述多浪羊的下丘脑、垂体、子宫、卵巢和输卵管5 种组织，无菌手术剪剪碎后放入冻存管中，迅速置于液氮中保存，并尽快转移至-80℃冰箱中。

1.2 主要试剂 DNA Marker2000、胶回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；PMD-19T 购自大连宝生物工程有限公司；反转录试剂盒、qPCR 试剂盒、DH5感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；蓝白斑试剂购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 多浪羊RNA 提取与cDNA 合成 利用Transzol 法提取组织RNA，提取后的RNA 利用核酸蛋白检测仪检测浓度。检测合格后，统一浓度进行反转录试剂盒合成cDNA。

1.4 引物设计及基因的克隆 从GeneBank 上找到绵羊基因的mRNA 序列（登录号为：NM_001009397.1），根据Primer Premier 6.0 设计基因克隆的引物（表1）。PCR 反应体系：9.5 μL ddHO，12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix，1 μL Primer-F（5 nmol/μL）、1 μL Primer-R（5 nmol/μL），1 μL cDNA（500 ng/μL），反应总体系为25 μL。反应条件：95℃，3 min；95℃，30 s；58℃，30 s；72℃，1 min；重复35 个循环；72℃，5 min；4℃保存。PCR 产物经1.5%琼脂糖凝胶检测后，做胶回收纯化处理并与PMD-19T 载体连接，连接后在16℃条件下反应30 min。取反应好的连接产物5 μL 与100 μL DH5感受态细胞混合，冰浴30 min 后，42℃条件下热激90 s，然后快速转入离心管中冰浴。随后加入400 μL 不含氨苄青霉素的培养基，进行摇床复苏，条件为37℃，225 r/min，90 min。待溶液变浑浊后，4 000 rpm 离心5 min，弃掉适量上清液，将剩余菌液均匀铺在含有氨苄青霉素的培养基上，放置30 min。将培养皿倒置，37℃恒温培养箱过夜。通过蓝白斑试剂挑选重组子后进行PCR 扩增，合格菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序。利用测序获得的序列设计荧光定量PCR 引物，以为内参基因。引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 多浪羊GnRHR 克隆及荧光定量PCR 引物

1.5 实时荧光定量PCR 以多浪羊cDNA 为模板，利用实时荧光定量PCR 检测各组织中的表达量。反应体系：5.5 μL ddHO，7.5 μL 2×Transtant qPCR Mix 上下游引物各0.5 μL（5 nmol/μL），1 μL cDNA（500 ng/μL），反应总体系为15 μL。反应条件：95℃，2 min；95℃，15 s；55℃，15 s；68℃，20 s，重复反应40 次。

1.6 统计分析 采用2法计算得到的CT 值，使用SPSS 24.0 分析差异是否显著。>0.05 表示差异不显著，<0.05 表示差异显著，<0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1基因的克隆 多浪羊基因通过PCR 扩增后，用1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测（图1）。可以看出，在1 170 bp 处有明显的单一特异DNA 条带，条带大小符合预期，证明已成功扩增出了多浪羊基因的CDS 序列。将得到的序列通过BLAST对比发现，多浪羊基因的CDS 序列与绵羊的同源性为99.90%。

图1 多浪羊GnRHR 基因PCR 产物

2.2 同源序列对比及进化树构建 通过NCBI 分别获取犬（登录号：NP_001003121.1_1）、鸡（登录号：NP_001012627.1_1）、牛（登录号：XP_005208079.1_1）、绵羊（登录号：NP_001009397.1_1）、小鼠（登录号：NP_001297580.1_1）、人（登录号：NP_000397.1_1）的CDS 序列，利用MEGA 7.0 构建进化树（图2）。结果显示，多浪羊与绵羊的亲缘关系最近，同源性为99.90%，其次是牛，同源性为95.71%。

图2 同源进化树构建图

2.3 GnRHR 蛋白生物信息学分析

2.3.1 GnRHR 蛋白理化性质预测分析 利用ExPASy软件预测多浪羊GnRHR 蛋白的亲水性和疏水性（图3）及其理化性质，发现第68 位的谷氨酸（Glu）亲水性最强，亲水性分值为-3.589；第225 位的亮氨酸（Leu）疏水性最强，疏水性分值是3.300。GnRHR 氨基酸亲水性/疏水性分布图可以看出GnRHR 蛋白序列中疏水性的氨基酸区域多于亲水性区域（图3），疏水性总平均值为0.355，表明多浪羊GnRHR 属于疏水蛋白。ExPASy 预测得出多浪羊GnRHR 蛋白的化学式为CHNOS；等电点为9.23；存在16 个带负电残基（天冬氨酸+谷氨酸）和26 个带正电残基（精氨酸+赖氨酸）；其N 末端氨基酸为蛋氨酸（Met），稳定指数为32.28，属于稳定蛋白。

图3 GnRHR 蛋白疏水性/亲水性预测

2.3.2 多浪羊GnRHR 蛋白二级结构和三级结构预测 由图4 可知，GnRHR 蛋白二级结构主要由-螺旋和无规卷曲组成，分别为38.41%和32.93%，其余结构为延伸链和-转角，分别为26.52%和2.13%。利用PHYRE2在线软件，预测分析多浪羊GnRHR 的三级结构（图5），该结构基于c4djgA 模板进行建模。

图4 多浪羊GnRHR 蛋白二级结构预测图

图5 多浪羊GnRHR 蛋白三级结构预测图

2.3.3 GnRHR 蛋白结构域及跨膜区域预测分析 由图6可知，多浪羊GnRHR 蛋白存在1 个低复杂度区域和7个跨膜区域。预测到多浪羊GnRHR 蛋白氨基酸序列从第22 位到第33 位为低复杂度区域；存在7 个跨膜结构，分别位于第39 到第58 位、第79 到101 位、第116 到第137 位、第158 到第180 位、第209 到第231 位、第270 到292 位、第307 到326 位氨基酸。由图7 可知，GnRHR 蛋白存在7 个跨膜区域，跨膜区域起始位置与SMART 软件预测序列一致。

图6 多浪羊GnRHR 蛋白结构域预测图

图7 多浪羊GnRHR 蛋白跨膜预测图

2.3.4 GnRHR 蛋白磷酸化位点预测分析 由图8 可知，多浪羊基因编码产物存在11 个丝氨酸、15 个苏氨酸和1 个酪氨酸的潜力值大于阈值，表明多浪羊GnRHR 有26 个磷酸化位点。

图8 多浪羊GnRHR 蛋白磷酸化位点预测图

2.4基因初情期不同组织中的表达 通过实时荧光定量PCR 方法对基因在多浪羊下丘脑、垂体、子宫、卵巢和输卵管5 种组织中的表达进行检测（图9）。结果显示，基因在初情期前、初情期和初情期后3 个时期中，5 种组织均有表达，其趋势均为初情期时升高，初情期后开始降低。基因在多浪羊3 个时期中均为垂体和卵巢中高表达，下丘脑、子宫和输卵管中低表达。初情期前基因在垂体中表达量相对较高，显著高于下丘脑、子宫、卵巢和输卵管；进入初情期时，垂体和卵巢中表达量最高，极显著高于其他组织；初情期后垂体和卵巢相对表达量仍然较高，显著高于其他组织。多浪羊垂体基因初情期时表达量极显著高于初情期前和初情期后；初情期时卵巢中表达量显著上升，初情期后卵巢中相对表达量开始下降，但并不显著；初情期时下丘脑、子宫和输卵管中表达量呈上升趋势，但差异并不显著。

图9 不同组织各时期GnRHR 相对分泌量

3 讨论

本研究克隆出多浪羊基因CDS 序列，对其进行同源比较以及构建进化树发现，与绵羊的同源性最高，其次是牛，说明GnRHR 符合生物进化的特点，反映了进化过程中DNA 序列差异的功能限制。绵羊基因由3 个外显子和2 个内含子组成，CDS 序列全长987 bp，编码328 个氨基酸，是一个单一的拷贝基因。生物信息学分析显示，多浪羊GnRHR 分子式为CHNOS，等电点为9.23，为碱性蛋白，与榕江小香羊GnRHR 蛋白CHNOS、等电点为9.39 相差不大，同属于碱性蛋白；稳定指数为32.51，其N 末端的蛋氨酸主要起到稳定作用，属于稳定蛋白；疏水性总平均值为0.355，属于疏水蛋白，其疏水性有利于该蛋白向内折叠生成稳定的二级结构（主要是生成-螺旋以保证其稳定性或者为跨膜蛋白），进而生成特定的空间构象和三级结构以发挥其作用。软件分析显示该蛋白最主要的二级结构是-螺旋，为39.94%，同时利用软件预测到该蛋白存在7 个跨膜结构，且预测其功能域时发现存在7 个跨膜区域，表明该蛋白属于跨膜蛋白，与榕江小香羊GnRHR 蛋白跨膜区域一致，这与该蛋白为疏水蛋白相符合；该蛋白含有26个磷酸化位点，可能成为蛋白激酶和磷酸酶的修饰位点，在调节细胞内通路的过程中发挥着重要作用。

通路能够促进促性腺激素的合成与分泌，在动物初情期的启动过程中发挥着重要的作用，其中基因是重要的介导者和组成部分。作为整合中心的下丘脑能够产生脉动性GnRH 刺激垂体细胞基因表达，激活早已经建立好的垂体-性腺轴。进入初情期的牦牛血清中GnRH 含量极显著高于伐情期的牦牛且在24 h 内有明显的3 个峰值，同时Kadokawa 等证明哺乳动物的GnRHR 聚集在促性腺激素的表面，并且随着GnRH 浓度的升高而增加，表明哺乳动物初情期时GnRH 能够以脉冲的方式刺激垂体细胞基因从而发挥作用。初情期垂体分泌的LH 和FSH 随血液循环到达卵巢，促进卵泡发育和完善卵巢功能，刺激卵巢分泌雌激素，从而使动物表现出第1 次发情和排卵。雌激素能够直接作用于垂体，也可通过其正反馈过程中增加的GnRH 促使基因表达。与的相互作用能够刺激对性腺功能有至关重要作用的促性腺激素合成与分泌，在初情期启动过程中发挥着重要作用。有研究表明，通过使用药物，能够调控基因的表达，从而调节人进入青春期和小鼠进入初情期的时间。Howard发现基因发生突变能够阻碍性腺发育，造成繁殖障碍。本研究采用荧光定量PCR 的方法检测了初情期和初情期前后3 个时期多浪羊基因在HPG 轴相关组织的相对表达量，结果显示基因在垂体中高表达，且初情期时表达量最高，与前人研究结果一致；但与甘家藏绵羊发情后期卵巢中表达量最高不一致，推测原因可能是不同时期基因表达存在差异。卵巢是除垂体外表达最高的组织，与小鼠卵巢和卵巢颗粒细胞中存在mRNA 的结果一致，同时也表明在初情期时对卵巢发挥其功能具有重要作用。龙威海等对不同品种山羊在不同组织中的表达情况进行了检测，发现黔北麻羊、贵州白山羊和小香羊垂体组织中表达量最高，在下丘脑、子宫、卵巢和输卵管中均有表达，与本实验研究结果一致；贵州黑山羊下丘脑组织中表达量最高，推测不一致原因为不同物种不同环境下能够影响基因表达。在HPG 轴相关组织初情期及初情期前后不同时期均有表达且表达量具有差异，说明基因对绵羊初情期的启动以及生殖系统的发育完善和维持正常的繁殖活动密切相关。

4 结论

本研究通过克隆获得了多浪羊基因的CDS序列，该序列长987 bp，编码328 个氨基酸。生物信息学显示该蛋白为疏水蛋白，属于稳定蛋白，存在7 个跨膜区域，有26 个潜在磷酸化位点。利用实时荧光定量PCR 的方法，发现多浪羊基因在垂体中表达量最高，其次为卵巢，在HPG 轴相关组织中均有表达，表明基因在多浪羊初情期启动的过程中发挥着重要的作用。