罗格列酮对急性胰腺炎大鼠肺组织HMGB1和JAK2/STAT3信号通路调控的研究

陆贝　王京瑞　殷俊杰　蔡阳　徐孙兵

[摘要] 目的 探討罗格列酮对SAP模型大鼠早期炎症介质、晚期炎症因子HMGB1和JAK2/STAT3信号通路表达的调控。方法 72只SD大鼠随机分为3组，假手术组（SO组，n=24）、胰腺炎模型组（SAP组，n=24）和罗格列酮组（ROSI组，n=24）。SAP组在麻醉后两次腹腔内注射左旋精氨酸，ROSI组在SAP建模后30 min静脉注射罗格列酮针6 mg/kg，SO组在麻醉后腹腔注射等体积生理盐水。3组术后6 、12和24 h分别采样（每个时间点n=8），测定血清TNF-α、IL-1β、IL-6等早期炎症因子含量，观察大鼠肺组织病理改变，测定肺髓过氧化物酶和肺干/湿重比，检测肺组织HMGB1、JAK2、STAT3蛋白表达情况。 结果 ROSI组大鼠的血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量较SAP组明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）;与SAP组比较，ROSI组的肺组织病理损伤减轻，肺MPO表达降低，干/湿重比下降，HMGB1、JAK2、STAT3蛋白表达明显减低，差异有统计学意义（P<0.05）。结论 罗格列酮能抑制肺组织JAK2、STAT3表达，降低早期、晚期炎症因子表达，减轻SAP导致的肺损伤。

[关键词] 胰腺炎;肺损伤;炎症因子;信号通路

[中图分类号] R364.5          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2022）14-0020-05

Research on the regulation of rosiglitazone on signaling pathways of HMGB1 and JAK2/STAT3 in pulmonary tissue of rats with acute pancreatitis

LU Bei   WANG Jingrui   YIN Junjie   CAI Yang   XU Sunbing

Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery， Affiliated Hangzhou First People′s Hospital， Zhejiang University School of Medicine， Hangzhou 310006， China

[Abstract] Objective To investigate the expression regulation of rosiglitazone on signaling pathways of HMGB1 and JAK2/STAT3 in early inflammatory mediators， late inflammatory factors of rats with SAP model. Methods A total of 72 SD rats were randomly divided into the sham operation group （SO， n=24）， the pancreatitis model group （SAP， n=24） and the rosiglitazone group （ROSI， n=24）. The SAP group was injected with L-arginine intraperitoneally twice after anesthesia， the ROSI group was injected with rosiglitazone by 6mg/kg intravenously 30 minutes after SAP modeling， and the SO group was injected with the same volume of normal saline intraperitoneally after anesthesia. Samples were taken at 6 hours， 12 hours and 24 hours after operation in three groups （n=8， at each time point）. The contents of early inflammatory factors such as TNF-α， IL-1β， IL-6 in serum were detected. The pathological changes of rat pulmonary tissue were observed， the pulmonary myeloperoxidase and the pulmonary dry/wet weight ratio were detected， and the expression of HMGB1， JAK2 and STAT3 protein in pulmonary tissue were detected. Results The levels of serum IL-1β， IL-6 and TNF-α in the ROSI group were remarkably lower than those in the SAP group， with statistically significant differences （P<0.05）. Compared with the SAP group， in the ROSI group， the pathological injury of pulmonary tissue was alleviated， MPO expression in lung was decreased， dry/wet weight ratio was lowered， and HMGB1， JAK2， STAT3 protein expression were remarkably reduced， with statistically significant differences （P<0.05）. Conclusion Rosiglitazone can inhibit the expression of JAK2 and STAT3 in pulmonary tissue， reduce the expression of early and late inflammatory factors， and alleviate pulmonary injury caused by SAP.9662AB48-F1CC-4F9C-AD31-4A74CA88EAAC

[Key words] Pancreatitis; Pulmonary injury; Inflammatory factors; Signaling pathway

急性肺损伤（acute lung injury，ALI）是重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis，SAP）引发的多器官功能不全（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）之一，严重者可发生呼吸衰竭甚至死亡，其发病率及病死率高达50%和60%[1-4]。全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）是MODS和ALI已知的重要发病机制之一，多种信号通路诱发早期、晚期炎症因子级联释放效应已得到公认。Janus激酶/信号转导与转录激活子（Janus activated kinase / signal transducer and activator of transcriptions，JAK/STAT）信号通路是近年发现的一条细胞内信号转导途径，涉及细胞因子调控，细胞免疫调节及增殖、分化、凋亡等过程。本研究使用炎症反应调节剂——过氧化物酶体增殖物激活受体-γ（peroxisome proliferators-activated receptor-γ，PPAR-γ）激动剂罗格列酮来观察其对SAP大鼠肺损伤的保护作用，并探讨JAK2/STAT3信号通路可能的调节机制，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

72 只成年雄性清潔级SD大鼠，体重255～315 g，浙江中医药大学动物实验中心提供（SYVK浙2018-0012）。戊巴比妥钠针剂、二甲基亚砜（DMSO）、L-精氨酸（L-arginine）购自Sigma公司（Sigma，USA）;罗格列酮（rosiglitazone）购自Cayman公司（Cayman，USA）;Janus激酶2（JAK2）、信号转导与转录激活子3（STAT3）、高迁移率族蛋白B1（HMGB1）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等ELISA试剂盒购自R&D公司（R&D，USA）。本研究通过浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院医学伦理委员会审批（批号：17258）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组  大鼠术前禁食12 h，随机分为模型组（SAP组，n=24）、罗格列酮组（ROSI组，n=24）、假手术组（SO组，n=24）。每组制模后6 h（n=8）、12 h（n=8）和24 h（n=8）剖杀，采样检测。

1.2.2 模型制备  麻醉方法：腹腔内注射2.5%戊巴比妥钠，剂量0.2 ml/100 g;麻醉后向大鼠腹腔内先后两次注射浓度为20 g/L的L-精氨酸2.0 g/kg，间隔1 h，完成SAP制模，股静脉插管备用。ROSI组SAP制模成功后，经股静脉插管一次性注射10%DMSO溶解的罗格列酮溶液6 mg/kg;SO组麻醉后仅向腹腔内注射等体积0.9%NS。

1.3 观察指标与评价标准

1.3.1 血清炎症细胞因子检测  血清肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），白细胞介素-1β（interieukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interieukin-6，IL-6）的含量采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测，具体操作参照ELISA检测试剂盒说明书。

1.3.2 肺组织形态学变化  大鼠相应观察时间点剖杀后以4%多聚甲醛固定右肺前叶组织，石蜡包埋，浸泡、染色、分色、脱水、透明、固定、封片后光镜下观察。

1.3.3 肺组织JAK2、STAT3、HMGB1、MPO检测  取右肺中叶适量组织，制成组织匀浆后离心取上清备用，用双抗体夹心法检测JAK2、STAT3、HMGB1、MPO的表达，具体操作参照ELISA检测试剂盒说明书。

1.3.4 肺含水量（干/湿重比）  滤纸吸干左肺叶表面液体，去除脂肪，称量湿重。80℃烤箱干燥48 h，称量干重，计算肺组织干/湿重比。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析，计量资料符合正态分布以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用ANOVA方差分析，组内比较用SNK-q检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组血清炎症因子水平比较

SAP组及ROSI组血清炎症细胞因子TNF-α，IL-1β、IL-6随时间延长而升高，两组各时间点的血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于SO组，差异有统计学意义（P<0.05）。ROSI组6、12、24 h各指标水平均低于SAP模型组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

2.2 各组肺组织病理改变比较

SO组大鼠肺组织大体无明显异常，SAP组大鼠大体可见肺组织明显点状出血，ROSI组变化介于两者之间。镜下SO组大鼠肺泡及间质结构正常（封三图2A）;SAP组可见大量炎症细胞浸润，肺泡腔出血、渗出，间隔增宽，部分肺泡破裂、塌陷或不张（封三图2B）。ROSI组各时间点炎症细胞浸润、渗出、肺泡损伤程度较SAP组不同程度减轻（封三图2C）。

2.3 各组肺JAK2、STAT3蛋白表达比较

SAP组、ROSI组造模后3个时间点肺泡上皮细胞JAK2、STAT3蛋白表达较SO组升高（P<0.05）。ROSI组12、24 h的JAK2表达，6、12、24 h的STAT3表达均低于SAP模型组（P<0.05）。见表2。9662AB48-F1CC-4F9C-AD31-4A74CA88EAAC

2.4 各组肺内晚期炎症介质HMGB1表达比较

SAP组、ROSI组SD大鼠肺肾组织HMGB1的表达随时间延长而增加，SAP组及ROSI组各时间点HMGB1的表达均高于SO组，差异有统计学意义（P<0.05）。ROSI组6、12、24 h肺HMGB1表达均低于SAP组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3、图2。

2.5 各组肺髓过氧化物酶活性比较

SAP组、ROSI组肺组织MPO活性较SO组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）。ROSI组6、12、24 h肺MPO活性低于SAP组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4、图3。

2.6 各组肺干/湿重比（含水量）

SAP组、ROSI组肺脏干/湿重高于SO组，差异有统计学意义（P<0.05），ROSI组12、24 h肺干/湿重比低于SAP组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表5、图4。

3 讨论

SAP早期肺损伤主要由全身过度炎症反应引起，具体机制比较复杂，可能与中性粒细胞、肥大细胞、巨噬细胞[3-5]等有关，或与TNF-α，IL等炎症因子、血小板活化因子、核因子-κB等相关，抑或有互相协同机制。细胞因子之间不仅存在密切的相互作用，同时也可与信号传导通路相互作用影响疾病进程，且一旦被激活，将发生不断放大的瀑布效应[3]。现已发现多种细胞因子与JAK/STAT信号通路相互作用，其中JAK2和STAT3在胰腺腺泡细胞中均发现有特异性抗体。JAK/STAT3通路可由炎症因子活化、传导完成信号转導过程，并通常在炎症反应早期发挥作用[6-11]。JAK通过细胞因子诱导，形成活化的p-STAT3，将信号传导至细胞核内调节基因表达。STAT3广泛表达于多种组织和细胞，STAT3信号通路的异常激活可引起细胞功能失调，诱发细胞凋亡、免疫反应和炎症反应等过程。不少研究已证实STAT3的激活见于误吸、急性胰腺炎、休克复苏等损伤模型。SAP并发肺损伤时，IL-6、IL-1β等早期炎症因子的变化趋势与JAK2和STAT3蛋白表达呈正比[7]，且STAT3激活早于肺损伤的发生，推测JAK2/STAT3信号通路在肺损伤早期发挥重要作用。TNF-α、IL-1β、IL-6等早期炎症因子通过JAK/STAT信号通路介导进一步激活晚期炎症因子HMGB1等，在炎症进展过程中发挥作用。在感染性疾病中，高迁移率族蛋白B1是首个被证实的晚期炎症反应介质。研究表明当机体暴露于内毒素后，血清中高迁移率族蛋白B1在24 h以后才明显升高，而延迟应用HMGB1的中和性抗体可减轻内毒素相关性损伤。在胰腺炎动物模型的血清中同样能检出HMGB1，并可能作为早期炎症反应因子的下游因子参与全身炎症反应活动，与胰腺炎病情的加重有关。

本研究结果显示，SAP组大鼠在造模6 h后肺组织有明显的急性损伤改变，肺组织JAK2、STAT3表达升高，血清IL-1β、IL-6、TNF-α升高，肺晚期炎症因子HMGB1表达增多，肺MPO活性升高，肺含水量增加，且炎症指标及损伤程度基本随时间延长递增，于12、24 h达到峰值后回落，与已有的研究结果较一致，表明早期、晚期炎症因子的上调与JAK2、STAT3蛋白表达同步，两者可能存在受调节关系。ROSI组大鼠肺病理损伤较SAP组减轻，12、24 h肺组织JAK2 6、12、24 h肺组织STAT3蛋白，6、12、24 h肺组织MPO活性和肺含水量下降，6、12、24 h早期、晚期炎症因子均较SAP组减低，且部分指标24 h与12 h比较，差异有统计学意义（P<0.05），提示罗格列酮对JAK2/STAT3信号通路和炎症因子有明确的抑制作用，对SAP肺损伤有保护作用。

活化的PPAR-γ在炎症、损伤和休克模型中具有抗炎作用，其中罗格列酮具有高选择性[12-20]。本研究中罗格列酮对JAK2/STAT3信号通路，早期、晚期炎症因子具有同步调控作用，虽不能确定两者的上下游关系及量效关系，但借鉴以往的研究推测罗格列酮通过JAK2/STAT3信号通路下调炎症反应，保护SAP导致的肺损伤，为今后进一步研究提供基础。

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（收稿日期：2021-07-30）9662AB48-F1CC-4F9C-AD31-4A74CA88EAAC