中性粒细胞胞外陷阱、炎性蛋白水平对全膝关节置换术后下肢深静脉血栓形成预测价值分析

郑桂莲，耿晓慧，张莎莎，王茜，高文香

下肢深静脉血栓形成（DVT）是全膝关节置换术后的常见并发症之一，若无任何形式的预防措施，DVT的发生率高达50%～60%，可能诱发肺栓塞等，威胁病人生命安全，因此早期识别DVT的危险因素，并预测DVT发生风险意义重大。动物学研究表明，给予肽酰基精氨酸脱亚氨酶4破坏中性粒细胞胞外陷阱（NETs），可降低动脉损伤小鼠动脉内膜损伤的程度与急性血栓并发症的发生，提示NETs与急性血栓类疾病的发生有关［1］。C反应蛋白（CRP）、巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP-1α）是两种炎性蛋白［2］。根据以往资料，低CRP与高CRP病人外周血脂蛋白相关凝血抑制物水平差异有统计学意义，提示CRP与凝血功能有关，而MIP-1α被证实与糖尿病微血管病变、血栓形成密切相关［3-4］。但NETs、CRP、MIP-1α在全膝关节置换术后下肢DVT中的研究较少。基于此，本研究首次探讨NETs、CRP、MIP-1α对全膝关节置换术后下肢DVT预测价值，旨在为临床提供参考依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料选取河南省洛阳正骨医院2018年1月至2019年6月全膝关节置换术病人110例，根据是否伴有DVT分为观察组36例（DVT病人）及对照组74例（无DVT病人）。所有病人术后均出现下肢疼痛、皮肤颜色异常等疑似DVT症状，DVT诊断标准参照中华医学会制定的《深静脉血栓形成的诊断和治疗指南（第二版）》［5］。确诊后给予常规抗DVT治疗。入组者均对该研究知情，自愿签署知情同意书。该研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2纳入、排除标准纳入标准：于该院行全膝关节置换术病人；观察组符合DVT诊断标准；围手术期无发热等感染迹象或感染疾病；无认知功能障碍；检测配合度良好；入组前3个月无急性脑梗死、心肌梗死。排除标准：合并白血病者；长期应用免疫调节剂及影响凝血功能药物者；有精神病史者；术后伤口有红肿或浅表感染者；凝血功能异常者。

1.3标本采集与检测（1）主要试剂、仪器：低温高速离心机、超净工作台（美国Thermo）；低速离心机（日本KUBOTA）；移液器（法国Gilson）；anti-MPO monoclonal capture antibody（美国ABD Serotec）；per‐oxidase substrate（ABTIS）、显色剂（TMB）、peroxi‐dase-labeled anti-DNA monoclonal antibody（德国Ro‐hce）；CRP试剂盒（艾美捷科技有限公司）；MIP-1α试剂盒（上海康朗生物科技有限公司）。

（2）两组术前12 h均给予低分子肝素（深圳赛保尔生物药业有限公司，国药准字H20060190）100U/kg，皮下注射，术后每日皮下注射1次，100 U/kg，共注射3次。术前、术后1 d、术后3 d分别采集空腹肘部静脉血5 mL，3 000 r/min，离心15 min，上清置入EP管中，保存于−80℃。采用MPO-DNA复合物的捕获酶联免疫吸附法检测NETs。96孔板中，加入75μg浓度为5 mg/L anti-MPOmonoclonal capture antibody于每孔，4℃冰箱中过夜。次日取出96孔板，弃去孔内液，加入300μL洗涤液，重复3次。加入1%牛血清白蛋白（BSA）125μL于每孔进行封闭。弃去孔内液，加入300μL洗涤液，重复3次。每孔加入20μL血清与80μL含有peroxidase-la‐beled anti-DNA monoclonal antibody的反应缓冲液（稀释比为1∶25），室温下，300 r/min摇96孔板2 h。弃去孔内液，加入300μL洗涤液，重复3次。加入100μL显色剂，室温下避光反应0.5 h，加入终止液，405 nm波长位置记录吸光度。

（3）通过酶联免疫吸附法检测血清CRP、MIP-1α水平。实验开始前，各试剂均应平衡至室温；试剂或样品配制时，均需充分混匀，并尽量避免起泡。分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加标准品&样品稀释液100μL，余孔分别加标准品或待测样品100μL。给酶标板覆膜，37℃孵育90 min。弃去孔内液体，甩干，不用洗板，每孔中加入生物素化抗体工作液100μL（在使用前20 min内配制），给酶标板加上覆膜，37℃温育1 h。弃去液体，洗板3次，每次浸泡30 s，大约350微升/孔，甩干并在吸水纸上轻拍将孔内液体拍干。每孔加酶结合物工作液（临用前20 min内配制，避光放置）100μL，加上覆膜，37℃温育30 min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔加显色剂（TMB）90μL，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15 min。每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色。立即用酶标仪在450 nm波长测量各孔的吸光度。分别以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，根据样本吸光度在曲线上计算出各指标浓度。

1.4观察指标（1）比较两组一般资料。（2）比较两组血清NETs、CRP、MIP-1α水平。（3）分析全膝关节置换术后下肢DVT的危险因素。（4）分析血清NETs、CRP、MIP-1α单独及联合预测下肢DVT的效能参数。

1.5统计学方法采用SPSS22.0统计学软件处理数据，计量资料以±s表示，组间比较行两独立样本t检验，计数资料用例（%）表示，组间比较采用χ2检验，采用logistic逐步回归法分析DVT发生的影响因素，受试者工作特征（ROC）曲线及曲线下面积（AUC）分析各指标预测DVT的价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组一般资料两组年龄、体质量指数（BMI）、合并内科疾病比例差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 两组全膝关节置换术病人一般资料比较

2.2两组血清NETs、CRP、MIP-1α水平观察组术后1 d、术后3 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平高于对照组（P<0.05），见表2。

表2 两组全膝关节置换术病人血清NETs、CRP、MIP-1α水平/±s

表2 两组全膝关节置换术病人血清NETs、CRP、MIP-1α水平/±s

注：NETs为中性粒细胞胞外陷阱，CRP为C反应蛋白，MIP-1α为巨噬细胞炎性蛋白1α。

组别对照组术前术后1 d术后3 d观察组术前术后1 d术后3 d组间t，P值术前术后1 d术后3 d例数74 36 NETs（吸光度）0.19±0.06 0.38±0.13 0.37±0.13 0.20±0.08 0.52±0.16 0.26±0.08 0.73，0.465 4.91，<0.001 5.47，<0.001 CRP/（mg/L）10.58±2.69 25.28±8.42 13.16±4.37 10.26±2.34 35.27±11.74 19.64±6.55 0.61，0.543 5.11，<0.001 6.16，<0.001 MIP-1α/（ng/L）10.90±2.81 26.63±8.84 15.22±5.10 11.34±3.15 38.09±12.68 21.07±7.02 0.74，0.461 5.51，<0.001 4.97，<0.001

2.3全膝关节置换术后下肢DVT的影响因素以全膝关节置换术后是否有下肢DVT作为因变量（0=否，1=是），年龄（1=≤60岁，2=>60岁）、合并内科疾病（0=无，1=有）、BMI（1=≤24 kg/m2，2=>24 kg/m2）、术后3 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平作为自变量（多重共线性诊断结果提示术后1 d、3 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平可能存在多重共线性，同时术后1d由于创伤、疼痛产生的应激反应可能会对各指标变化造成较大影响，故将术后1 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平予以剔除），进行logistic逐步回归分析，结果显示，年龄、合并内科疾病、BMI、术后3 d血清NETs、CRP、MIP-1α水平是全膝关节置换术后下肢DVT的独立影响因素（P<0.05），见表3。

表3 全膝关节置换术后下肢深静脉血栓形成（DVT）的影响因素

2.4血清NETs、CRP、MIP-1α单独及联合检测对下肢DVT的预测价值术后3 d血清CRP预测下肢DVT的灵敏度最高，而术后3 d联合检测预测下肢DVT的特异度、准确度、约登指数和AUC值最高，见表4。

表4 各指标单独及联合检测对全膝关节置换术病人术后下肢深静脉血栓形成（DVT）预测的效能参数

3 讨论

全膝关节置换术后DVT发生率较高，如何防治DVT成为临床研究的热点与难点。刘宏炜等［6］报道指出，高龄、患有糖尿病是DVT发生的相关危险因素。该研究显示，除以上因素外，血清NETs、CRP、MIP-1α水平是全膝关节置换术后下肢DVT的重要影响因素，与DVT发生密切相关，可为临床针对性筛查DVT高危人群提供参考。

NETs由活化的中性粒细胞释放及组蛋白、中性粒细胞细胞内颗粒组成的细胞外小段DNA结构，具有抗微生物特性，在结扎小鼠下腔静脉血栓小鼠模型外周循环中的表达高于正常小鼠［7-8］。而预先通过脱氧核糖核酸酶降解DNA成分去除NETs后，小鼠静脉血栓形成明显改善［9］。该研究显示，DVT病人术后1 d、术后3 d血清NETs水平高于无DVT病人，表明NETs与DVT发生有关，调控DVT高风险人群NETs或从基因水平靶向NETs有助于预防DVT的发生。薛龙等［10］研究发现，术后NETs水平与全膝关节置换术后下肢DVT具有相关性，支持该研究结论。NETs在静脉内皮细胞表面大量聚集之后，可启动与内皮细胞、血小板间的反应，并结合Ⅻ因子和VWF等，促进纤维蛋白形成、红细胞与血小板聚集，加快血液凝固，且NETs还能为静脉血栓形成提供纤维样骨架结构，故可影响DVT的发生［11-12］，可为临床预测DVT的发生提供量化参考。

CRP系细胞膜糖蛋白，主要由肝脏合成。郑春莲等［13］报道显示，DVT病人治疗前CRP较高，而治疗后CRP降低，并伴有病情的改善，提示CRP与DVT有关。该研究显示，DVT病人术后1 d、术后3 d血清CRP水平高于无DVT病人，表明CRP与DVT发生有关，调控CRP或从基因水平靶向CRP，可能为DVT的防治提供了一个潜在新思路。佟冰渡等［14］研究发现，DVT病人自术后第3天开始，CRP持续高于非DVT病人，从侧面论证了该研究结论。CRP可刺激诱导机体单核细胞分泌组织因子、炎症递质，损伤血管内皮，介导血小板凝聚，并引起人体内皮细胞合成凝血因子，启动凝血瀑布样反应，从而影响DVT的发生［15-16］，可为临床预测DVT发生选取合适的指标提供参考。

MIP-1α主要由成纤维细胞、单核细胞等产生，参与炎症反应［17-18］。注射MIP-1α抗体诱导MIP-1α的耗竭，可减小小鼠模型的血栓，提示MIP-1α可能与血栓形成有关［19］。该研究显示，MIP-1α在DVT中表达高于无DVT病人，表明MIP-1α可影响DVT的发生，抑制MIP-1α表达有助于减少高风险人群DVT的发生。且术后3 d MIP-1α预测DVT发生的AUC达0.737，截断值>18.57 ng/L时，灵敏度为0.667，特异度为0.730，可为临床提供量化的参考信息。结合文献分析，MIP-1α可趋化单核细胞、T细胞、中性粒细胞向损伤部位迁移，诱发炎症反应与血小板在损伤部位的聚集，从而增加DVT发生风险。

现阶段全膝关节置换术后DVT的评估常采用超声检查、凝血功能检查等，但多在发生后方可明确，不利于DVT的预防。有研究报道，MIP-1α预测老年卧床静脉血栓栓塞症的AUC为0.739［20］，与该研究MIP-1α的AUC相似。且该研究还发现，NETs、CRP、MIP-1α能预测DVT的发生，且在术后3 d进行三者的联合预测具有更高的特异度、准确度、约登指数和AUC值，可防患于未然，尽早采取有针对性的预防措施，以减少或避免DVT的发生，为临床预防DVT提供客观数据与循证支持，而选择术后3 d各指标变化进行预测，也在一定程度降低了术后早期由于创伤引起的各指标应激性升高而导致的假阳性率升高的可能。但不足之处在于，纳入样本量较少，可能造成数据的偏倚，仍需后续增加病例数进行进一步地验证、完善。

综上所述，NETs、CRP、MIP-1α在全膝关节置换术后DVT病人中呈高表达，与DVT发生显著相关，并对DVT发生具有一定的预测价值，尤其是三者联合检测具有更高的预测效能。靶向NETs、CRP、MIP-1α可能为防治DVT提供了一个新思路。