丙泊酚通过JAK激酶-信号转导及转录活化因子信号通路抑制类风湿关节炎大鼠炎症反应及滑膜细胞凋亡

李帆，祖丽娅提•阿热甫江，陈红

类风湿关节炎（RA）是一种以慢性、对称性、周围性为主要临床表现的自身免疫性疾病，JAK激酶（JAK）-信号转导及转录活化因子（STAT）信号通路主要参与细胞的生长、存活、分化以及抗病原性等生理活动，近年来，研究表明RA的发病机制与JAKSTAT信号通路表达异常有关［1-11］。近年来有研究发现丙泊酚能够通过调节JAK-STAT信号通路抑制大鼠体内的炎症反应［12-15］，但丙泊酚对于RA的作用及对滑膜细胞凋亡的影响目前尚未有明确报道。从2018年7月至2019年7月，本研究通过建立RA大鼠模型，研究丙泊酚对RA大鼠的作用及其体内JAK-STAT信号通路的影响，为RA的治疗提供新的参考和依据。

1 材料与方法

1.1材料健康Wistar大鼠36只，雄性，SPF级别，7～8周龄，体质量（230±20）g，购于新疆医科大学实验动物中心，动物房温度（22±2）℃，湿度（50±10）%，自由饮食，光照周期12 h，适应性喂养1周后进行实验。本研究符合一般动物实验伦理学原则。酶标仪购自北京岛津公司，双垂直电泳仪、转印电泳仪、凝胶成像仪均购自伯乐生命医学产品有限公司，全自动生化分析仪购自北京岛津公司。丙泊酚购自上海德默医药科技有限公司，牛Ⅱ型胶原、完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂购自深圳欣博盛生物科技有限公司，JAK2、STAT3和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体均购自美国Proteintech公司，膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素（Annexin V-FITC）细胞凋亡检测试剂盒、RIPA蛋白裂解液、肿瘤坏死因子-α（TNFα）、白细胞介素-6（IL-6）及白细胞介素-1β（IL-1β）检测酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海碧云天公司，ECL显色液购自Thermo公司。

1.2RA大鼠模型的建立及给药36只Wistar雄性大鼠，采用随机数字表法分为对照组、模型组、甲氨蝶呤组、丙泊酚低、中、高剂量组，6只/组。采用Ⅱ型胶原诱导法建立RA大鼠模型［16］：使用0.05 mol/L的冰醋酸将牛Ⅱ型胶原溶解，使其终浓度为2.0 g/L，4℃备用，向其中加入含有1 g/L灭活的结核分枝杆菌的完全弗氏佐剂，注射器乳化后采用尾部皮内注射0.1 mg/0.1 mL的牛Ⅱ型胶原。第21天再次尾部皮内注射0.1 mg/0.1 mL胶原进行加强免疫，对照组大鼠不做特殊处理。参照文献［17］标准，隔日按照以下标准对各组大鼠进行关节炎评分：无红斑或肿胀，记0分；踝关节有轻微的红斑或1个趾的肿胀，记1分；踝关节出现红斑和超过1个趾的肿胀，记2分；踝关节以下的足爪肿胀，记3分；包括踝关节在内的全部足爪肿胀，记4分。每个大鼠四肢累计积分之和为关节炎评分。评分>6分者，视为造模成功。造模完成后，丙泊酚低、中、高剂量组分别腹腔注射10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg丙泊酚［12-15］，甲氨蝶呤组腹腔注射甲氨蝶呤（7.5 mg/kg），对照组及模型组给予生理盐水，1次/天，连续28 d，最后一次给药24 h后，再次进行关节炎评分。

1.3大鼠血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平测定末次给药24 h后，眼眶静脉丛取血至不含肝素的玻璃管中，4℃静置4 h，4℃，3 500 r/min离心10 min。取上清液，使用ELISA检测TNF-α、IL-6及IL-1β水平。

1.4各组大鼠脾脏及胸腺脏器指数颈椎脱臼处死大鼠后分离脾脏及胸腺，4℃生理盐水灌流清洗，滤纸吸干水分后称重，计算脏器指数。脏器指数=甲状腺湿重（mg）/大鼠体质量（g）×100%。

1.5流式细胞术检测滑膜细胞凋亡率参照文献［18］方法，颈椎脱臼处死大鼠后，两侧滑膜组织在无菌条件下取出，用无Mg2+、Ca2+的D-Hank’s液冲洗3次后，制成约1 mm3的小块。用吸管吸取数小块组织，均匀排列在培养皿上，置于37℃、5%二氧化碳培养箱内培养7 h，使其贴壁。取出培养瓶后，加入含10%小牛血清的DMEM培养液4 mL，再置于37℃、5%二氧化碳培养箱中继续培养。每隔24 h更换1次培养液，待滑膜细胞长出组织块，继续培养至细胞融合度达90%，用胰蛋白酶消化细胞后，进行3次传代培养。用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集细胞，并以1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入适量培养基重悬细胞后，2 000 r/min离心5 min，弃上清液，加入195μL Annexin V-FITC结合液，再加入5μL的Annexin V-FITC，避光孵育15 min，然后加入10μL碘化丙啶（PI）染色液，避光孵育20 min，随后置于冰浴中，用流式细胞仪检测。

1.6苏木精-伊红（HE）染色颈椎脱臼处死大鼠后，迅速分离大鼠踝关节，放入4%中性甲醛中固定过夜，脱钙液脱钙处理，常规HE染色，在显微镜下观察。

1.7蛋白质印迹法取大鼠踝关节滑膜组织，蛋白裂解液裂解后，12 000 r/min，4℃离心10 min，取上清液加入十二烷基硫酸钠（SDS）上样缓冲液，100℃水浴变性，测定蛋白总浓度，取50μg蛋白进行电泳分离，转膜，5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，经JAK2、STAT3及GAPDH兔抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜。PBST洗膜3次，每次5 min，加入二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，再次清洗3次后显色液显影，利用凝胶成像仪成像，对各蛋白灰度值定量分析，并以GAPDH为内参，计算各蛋白相对表达量。

1.8统计学方法以SPSS 19.0软件分析所有数据，Graphpad prism 5作图。计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，多组间的两两比较采用LSD法。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1丙泊酚对RA大鼠关节评分的改善作用造模完成后，与对照组比较，模型组、丙泊酚低、中、高剂量组及甲氨蝶呤大鼠关节评分显著升高（P<0.05）；给药结束后，与模型组比较，丙泊酚低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组RA大鼠关节评分显著降低（P<0.05），且丙泊酚各剂量组大鼠随着丙泊酚剂量的增加，其关节评分显著降低。见表1。

表1 各组大鼠造模完成后与给药结束后关节评分比较/±s

表1 各组大鼠造模完成后与给药结束后关节评分比较/±s

注：①与对照组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。

组别对照组模型组甲氨蝶呤组丙泊酚低剂量组丙泊酚中剂量组丙泊酚高剂量组F值P值鼠数6 6 6 6 6 6造模完成后0.16±0.07 10.68±1.43①9.51±2.04①10.06±1.28①9.87±1.69①9.79±1.26①137.63 0.026给药结束后0.24±0.18 12.68±0.67①2.51±0.64①②6.76±1.43①②4.37±0.87①②2.68±0.26①②268.91 0.014

2.2丙泊酚对RA大鼠体内炎性因子水平的影响与对照组比较，模型组TNF-α、IL-6及IL-1β水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，丙泊酚低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组TNF-α、IL-6及IL-1β水平均显著降低（P<0.05），且随着丙泊酚剂量的增加，大鼠体内TNF-α、IL-6及IL-1β水平逐渐降低。见表2。

表2 各组大鼠体内TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较/（ng/L，±s）

表2 各组大鼠体内TNF-α、IL-6及IL-1β水平比较/（ng/L，±s）

注：TNF-α为肿瘤坏死因子α，IL-6为白细胞介素-6，IL-1β为白细胞介素-1β。①与对照组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。

组别对照组模型组甲氨蝶呤组丙泊酚低剂量组丙泊酚中剂量组丙泊酚高剂量组F值P值鼠数6 6 6 6 6 6 TNF-α 15.74±1.46 32.87±1.95①14.39±1.54②26.67±1.81①②19.44±1.34①②14.79±1.36②217.06 0.031 IL-6 37.79±1.18 67.71±1.34①35.66±1.82②52.86±1.37①②45.71±2.01①②38.55±2.71②378.19 0.025 IL-1β 16.57±1.66 58.89±1.73①18.04±2.41①②43.29±1.47①②38.64±1.44①②18.72±1.26①②306.55 0.027

2.3丙泊酚对RA大鼠脏器指数的影响与对照组比较，模型组脾脏及胸腺脏器指数显著升高（P<0.05）；与模型组比较，丙泊酚低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组大鼠脾脏及胸腺脏器指数均显著降低（P<0.05），且随着丙泊酚剂量的增加，大鼠脾脏及胸腺脏器指数逐渐下降，同时，丙泊酚高剂量组大鼠脾脏及胸腺脏器指数与对照组大鼠差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 各组大鼠脾脏及胸腺脏器指数比较/（%，±s）

表3 各组大鼠脾脏及胸腺脏器指数比较/（%，±s）

注：①与对照组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。

组别对照组模型组甲氨蝶呤组丙泊酚低剂量组丙泊酚中剂量组丙泊酚高剂量组F值P值鼠数6 6 6 6 6 6脾脏18.26±1.52 38.64±4.68①25.51±2.39①②33.27±2.84①②28.44±1.66①②18.73±1.18②269.78 0.022胸腺8.14±0.81 14.62±1.37①10.11±0.97①②12.32±1.03①②10.67±0.81①②9.42±0.75②199.71 0.018

2.4丙泊酚对RA大鼠滑膜细胞凋亡的影响对照组、模型组、丙泊酚低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组大鼠滑膜细胞凋亡率分别为（5.22±1.23）%、（41.85±3.97）%、（31.71±1.91）%、（24.84±1.91）%、（16.33±2.32）%、（15.62±2.52）%（F=171.93，P=0.012）。与对照组，模型组细胞凋亡率显著升高（P<0.05）；与模型组相比，丙泊酚低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组细胞凋亡率显著降低（P<0.05），且随着丙泊酚剂量的增加，滑膜细胞凋亡率逐渐降低。

2.5丙泊酚对RA大鼠踝关节组织病理学的影响模型组大鼠较对照组表现出踝关节滑膜组织增生，坏死细胞脱落及炎症细胞浸润；与模型组比较丙泊酚低、中剂量组大鼠踝关节细胞坏死及脱落明显减轻，炎症细胞浸润减少，细胞排列相对整齐，滑膜细胞相对完整，丙泊酚高剂量组大鼠踝关节偶见细胞坏死脱落，炎性浸润少见，细胞排列整齐，病理改变明显缓解。

2.6丙泊酚对RA大鼠滑膜组织JAK-STAT信号通路的影响与对照组比较，模型组踝关节滑膜组织JAK2、STAT3水平显著升高（P<0.05）；与模型组比较，丙泊酚低、中、高剂量组及甲氨蝶呤组JAK2、STAT3水平均显著降低（P<0.05），且丙泊酚各剂量组RA大鼠随着丙泊酚剂量的增加，滑膜组织JAK2、STAT3水平降低。见图1，表4。

表4 各组大鼠踝关节滑膜组织JAK2、STAT3水平比较/±s

表4 各组大鼠踝关节滑膜组织JAK2、STAT3水平比较/±s

注：JAK2为JAK激酶2，STAT3为信号转导及转录活化因子3。①与对照组比较，P<0.05。②与模型组比较，P<0.05。

组别对照组模型组甲氨蝶呤组丙泊酚低剂量组丙泊酚中剂量组丙泊酚高剂量组F值P值鼠数6 6 6 6 6 6 JAK2 0.35±0.07 1.19±0.16①0.41±0.05①②0.76±0.04①②0.59±0.04①②0.42±0.04①②77.47 0.011 STAT3 0.22±0.08 0.99±0.05①0.37±0.06②0.73±0.07①②0.55±0.05①②0.35±0.08②93.05 0.021

图1 蛋白质印迹法检测各组大鼠踝关节滑膜组织JAK2、STAT3水平

3 讨论

RA作为一种以慢性、对称性、周围性为主要临床表现的异质性、系统性、自身免疫性疾病，其病因尚未明确，其主要特征是手、足小关节的多关节、对称性、侵袭性关节炎症，随着疾病进展会导致关节畸形及功能丧失。研究表明，RA主要受感染、免疫调节紊乱、内分泌紊乱、遗传因素及环境因素等的影响［1-3］。目前临床常用甲氨蝶呤等免疫抑制剂、非甾体抗炎药、糖皮质激素等药物进行RA的治疗，但由于这些药物长期使用存在较多不良反应且部分病人治疗效果并不理想，所以对于治疗RA药物的开发仍是目前临床亟须解决的问题之一。

近年来研究表明，丙泊酚具有显著的氧化应激及炎症反应抑制作用，能够显著抑制脓毒症大鼠体内炎症反应及氧化应激损伤，同时，具有调节JAKSTAT信号通路，诱导乳腺癌细胞凋亡、抑制肺癌细胞炎症因子水平等药理作用［12-15］，但丙泊酚对于RA的作用及对滑膜细胞凋亡的影响目前尚不明确。血清TNF-α、IL-6及IL-1β水平在RA的发病机制中，TNF-α、IL-6及IL-1β起着关键性作用。成骨细胞受到刺激后，会促进机体TNF-α、IL-6及IL-1β水平的升高，并刺激炎性因子的释放，进而诱导并加重自身免疫性损伤，胸腺及脏器指数则能够反应机体自身免疫反应的强弱，滑膜细胞凋亡数则直接反映了机体关节的损伤程度［1-3］。本研究通过使用牛Ⅱ型胶原诱导建立RA大鼠模型，考察连续28 d给予不同剂量的丙泊酚对RA大鼠的作用。结果表明：与模型组相比，丙泊酚低、中、高剂量组RA大鼠关节炎评分、体内TNF-α、IL-6及IL-1β水平、胸腺及脏器指数、滑膜细胞凋亡率均显著降低，提示丙泊酚能够呈剂量依赖性地缓解RA大鼠关节肿胀程度，防止大鼠RA进一步加重，降低RA大鼠关节评分，同时降低炎性因子水平、脏器指数，抑制滑膜细胞凋亡，延缓疾病进展，改善大鼠RA疾病预后，抑制疾病进一步加重，进而改善RA大鼠的疾病进展及转归，促进RA大鼠关节功能的恢复。组织病理学检查结果表明，丙泊酚能够呈剂量依赖性地显著改善RA大鼠踝关节病理组织学变化，提示丙泊酚能够显著改善RA大鼠踝关节组织病理学状态，促进大鼠踝关节功能恢复。

JAK-STAT信号通路主要参与细胞的生长、存活及抗病原性等生理活动［19-20］。研究表明，JAKSTAT信号通路的异常激活可以诱发自身免疫疾病及炎症的发生［7-11］。近年来研究表明，RA的发病机制与JAK-STAT信号通路表达异常密切相关，且抑制大鼠体内JAK-STAT信号通路的表达，能够显著改善大鼠RA的疾病状态及相关指标［4-6］。本研究结果表明，给予RA大鼠不同剂量的丙泊酚后，丙泊酚低、中、高剂量组大鼠组织JAK2、STAT3水平均显著降低，提示丙泊酚能够呈剂量依赖性地降低RA大鼠踝关节滑膜组织JAK2、STAT3水平，进而抑制大鼠滑膜组织JAK-STAT信号通路的过表达，从而推测丙泊酚可能通过调节RA大鼠体内的JAK-STAT信号通路，进而调节其体内的炎性因子水平，改善大鼠的关节评分及脏器指数，降低滑膜细胞凋亡率。但由于时间及资金有限，对于丙泊酚对RA大鼠的靶向基因调控机制及丙泊酚在临床中的应用优势，需要在今后的研究中继续进行深入探讨。

综上所述，丙泊酚能够抑制RA大鼠体内炎症反应及滑膜细胞凋亡，其作用机制可能与调节RA大鼠体内JAK-STAT信号通路有关。