紫茎泽兰对大鼠肠道结构和肠道黏膜免疫屏障的影响

崔玉晶，高佩，文娟，OKYERE Kumi Samuel，胡延春

（四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130）

紫茎泽兰（Ageratina adenophora），是一种多年生菊科植物，原产于墨西哥和哥斯达黎加，现已入侵至欧洲、大洋洲和亚洲等地［1−2］，1940年从中缅边境传入云南［3］，现已广泛传播到四川、西藏等地，是我国最重要的入侵植物物种之一，对我国农业生产发展造成了极大的危害［4］。紫茎泽兰对羊、大鼠、小鼠等多种动物有很高的毒性，可造成不同动物组织器官的毒性损伤和炎性反应，研究已证实紫茎泽兰可使动物发生肝脏、脾脏等实质脏器的损伤［5］，能够通过氧化损伤、激活炎症反应损伤器官结构与激活免疫应答［6］，但目前仍无紫茎泽兰对肠道影响的报道。因此本研究以SD 大鼠为试验对象，对采食紫茎泽兰的大鼠肠道结构及黏膜免疫的损伤进行探究，旨在为紫茎泽兰对动物机体致毒性提供一定的参考与理论依据。

1 材料与方法

1.1 饲料制备与饲养管理

紫茎泽兰叶片于2019年7月采集自四川省西昌市，将叶片清洗后晾干，用CW700 研磨机研磨成粉末，再经0.425 mm 网筛过筛后得到紫茎泽兰草粉，将草粉存放于阴凉干燥处。标准大鼠粉末饲料购自成都达硕试验动物有限公司。饲料制备参考自Kaushal 等［7］及本试验室前期试验［8−9］和预试验结果，即将紫茎泽兰草粉与标准大鼠粉末饲料按3∶7 的比例加水混合均匀，制作成直径1 cm 圆柱形颗粒状饲料，60 ℃烘干，此为含有30%紫茎泽兰草粉饲料，另按相同的方式用标准大鼠粉末饲料制作不含紫茎泽兰草粉饲料。

试验使用16 只7 周龄雄性SD 大鼠，体重（200±25）g，采购自成都达硕试验动物有限公司［生产许可证号：SCXK（川）2015-030；使用许可证号：SYXK（川）2014-187］，饲养于四川农业大学试验动物房，维持饲养条件在室温22～25 ℃，相对湿度40%～60%，日夜光照12 h 交替。经适应性饲喂7 d 后将大鼠随机分为对照组和试验组（n=8），对照组饲喂0%紫茎泽兰草粉饲料（10 g·100 g−1BW），试验组饲喂30%紫茎泽兰草粉饲料（10 g·100 g−1BW），自由饮水，饲养周期为14 d。

1.2 样品采集

将各组大鼠禁食12 h，用乙醚充分麻醉后颈椎脱臼法处死大鼠，立即剖检，分离肠系膜与脂肪组织，完整的取出肠道，放在盛有预冷PBS（phosphate buffered saline，PBS）平皿中采集各肠段：在距幽门2～3 cm 处采集十二指肠样本，在空肠中段采集空肠样本，在距回肠末端2～3 cm 处采集回肠样本，在距盲肠盲端0.5 cm 处采集盲肠样本，在距肛门8 cm 处采集结肠样本，在距肛门1 cm 处采集直肠样本，将各肠段样本分为三部分，一部分无须冲洗直接放入10%多聚甲醛中，用于制备石蜡切片；一部分用4 ℃PBS 缓冲液洗去肠内容物，用无菌纱布擦干准确称量0.1 g，制备为10%组织匀浆；最后一部分（约50 mg）迅速放入液氮中速冻，用以组织RNA 提取。

1.3 测定指标及方法

1.3.1 HE 染色及组织病理学观察 取制备好的石蜡切片按照制造商说明书进行HE（hematoxylin-eosin staining，HE）染色（武汉塞维尔，G1001），用OLYMPUS 玻片扫描系统扫描HE 切片全片，储存图像备用，用OlyVIA 软件将对照组与试验组各肠段图像进行比较，分析其病理变化。

1.3.2 组织学评分 参照Appleyard 等［10］的方法对各肠段进行病理损伤组织学评分，评分标准见表1。

表1 病理损伤组织学评分Table 1 Criteria for histological scoring of damage

1.3.3 形态学测量 用OlyVIA 软件查看HE 切片图像，选取结构层次清晰，均匀染色区域拍照，用Image Pro Plus 6.0 软件测量小肠（十二指肠、空肠、回肠）的绒毛高度，隐窝深度。将绒毛尖端到绒毛隐窝交界处的距离记为绒毛高度，相邻绒毛间的凹陷深度记为隐窝深度［11］，并根据上述测量结果计算绒毛高度/隐窝深度。在每肠段3 个重复中各分析了10 个定向良好延展均匀的隐绒毛单位。

1.3.4 IELs 及LPLs 计数 用OlyVIA 软件查看HE 切片图像，选取结构层次清晰、均匀染色区域拍照，观察IELs 和LPLs 的分布与数量，约94%的上皮淋巴细胞位于小肠上皮基底部［12］，因此以黏膜上皮层为界，参照Moghaddam 计数方法［13］，每张小肠切片随机选取5 根肠绒毛，每张大肠切片随机选取5 个肠腺，用Image Pro Plus 6.0 图像分析系统计数每1 根肠绒毛或每一个肠腺IELs（intestinal intraepithelial lymphocytes，IELs）与LPLs（lamina propria lymphocytes，LPLs）的数量。

1.3.5 AB−PAS 染色及GCs 计数 取制备好的石蜡切片按照制造商说明书进行AB−PAS 染色（武汉塞维尔，GP1049），用OLYMPUS 玻片扫描系统扫描全片，储存图像后用OlyVIA 软件选取染色均匀的视野拍照，每张切片在200 下随机选取5 个视野并拍照，各试验组与对照组需选取结构相似区域，用Image Pro Plus 6.0 图像分析系统计数每个视野内杯状细胞（goblet cells，GCs）的数量。

1.3.6 qRT−PCR 检测紫茎泽兰对大鼠肠道黏膜细胞因子相关基因mRNA 的影响 采用Oligo 7.0软件对IL-1β、IL-4、TNF-α、IFN-γ和β-actin基因进行特异性引物设计，并由上海生工生物有限公司合成，引物序列如表2 所示，使用Bio-RAD 实时荧光定量PCR 仪（CFX96）对肠道黏膜中细胞因子的表达进行定量分析，反应体系为20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq（2×），10 μmol·L−1的上下游引物各0.4 μL，1 μL 样品DNA 以及8.2 μL DEPC 水，PCR 反应程序为：95 ℃5 min 后，95 ℃10 s，60 ℃下退火及延伸30 s，40 个循环，反应结束后用2−ΔΔCt法计算各基因mRNA 的相对表达量。

1.3.7 ELISA 检测紫茎泽兰对大鼠肠道黏膜细胞因子分泌量在蛋白水平的影响 将制备好的10%组织匀浆按ELISA 试剂盒说明书（江苏晶美），对各肠段IL-1β、IL-4、TNF-α 和IFN-γ 进行定量分析，检测方法参照ELISA试剂盒说明书。

1.4 数据处理

采用SPSS 25.0 统计分析软件中IndependentT-test 程序进行统计分析，试验结果均以“平均值±标准差”（mean±SD）表示，显著性置于0.05 水平。

2 结果与分析

2.1 紫茎泽兰对大鼠肠道病理学损伤

由表3 及图1A 可知，与对照组相比，十二指肠黏膜层炎性细胞浸润，肠绒毛出血及顶端轻度坏死脱落；空肠可见少量淋巴细胞浸润，黏膜下层血管充血扩张，部分绒毛顶端糜烂性坏死甚至脱落，坏死脱落的柱状细胞细胞核破碎、裂解、变形、散见少量红细胞；回肠固有层与上皮层炎性细胞浸润，出现较大面积黏膜层绒毛顶端组织结构破坏，大量肠绒毛顶端凝固性坏死，并伴有出血；盲肠黏膜下层水肿，固有层轻度充血；结肠肌层增厚，固有层淋巴细胞增多；直肠浆膜水肿，肠腺变短，黏膜层及黏膜下层有大量淋巴细胞浸润，出现淋巴细胞增生，局部黏膜上皮细胞坏死脱落。

同时对各肠段进行量化评分，试验组各肠段组织学评分均极显著增加（P＜0.01），其中十二指肠评分增加495.23%，空肠评分增加511.36%，回肠评分增加722.36%，盲肠评分增加366.67%，结肠评分增加436.50%，直肠评分增加976.00%（表3）。

2.2 紫茎泽兰对大鼠小肠形态学的影响

由表4 可知，与对照组相比，采食紫茎泽兰可使大鼠十二指肠绒毛高度、隐窝深度及其比值极显著增加（P＜0.01）；使空肠绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度比值极显著增加（P＜0.01），而隐窝深度虽有增加但无显著性差异（P＞0.05）；使回肠绒毛高度、隐窝深度及其比值极显著增加（P＜0.01）。其中绒毛损伤以空肠最为显著，较对照组绒毛高度降低24.72%，隐窝损伤以十二指肠损伤最为严重，较对照组隐窝深度增加249.27%。

2.3 IELs、LPLs 和GCs 计数结果

由图1B 和表5 可知，与对照组相比，采食紫茎泽兰可极显著增加大鼠各肠段IELs、LPLs 和GCs 数量（P＜0.01）。小肠以回肠IELs、LPLs 和GCs 增加量变化最大，增加量分别达到125.64%、33.91%和48.19%；而在大肠中结肠和直肠IELs 与LPLs 增加量最为显著，其中结肠IELs 与LPLs 增加量分别为95.65%与59.20%，直肠IELs 与LPLs 增加量分别为93.33%与74.71%，直肠GCs 增加56.73%。

2.4 紫茎泽兰对大鼠肠道黏膜sIgA 含量的影响

由表6 可知，与对照组相比，采食紫茎泽兰使大鼠各肠段sIgA 表达量均极显著增加（P＜0.01）。其中十二指肠、空肠、回肠sIgA 增加量均达到了80%以上，其中空肠增加量最高，达119.11%；而盲肠、结肠、直肠增加量相对较低，以结肠sIgA 表达量增加最低，为12.83%。

2.5 肠道黏膜炎性细胞因子表达

由表7 可知，与对照组相比，各肠段促炎因子（IL-1β、IL-2、TNF-α 和IFN-γ）mRNA 表达量和蛋白分泌量均有不同程度的增加，抑炎因子（IL-4、IL-10）mRNA 表达量和蛋白分泌量均有不同程度的减少。其中小肠以空肠和回肠炎性因子显著增加或减少（P＜0.05），大肠以直肠炎性因子极显著增加或减少（P＜0.01）。

3 讨论

肠道是机体内最大的内分泌和免疫器官［14］，在维持肠道平衡稳态中有着重要作用，本试验结果显示，饲喂紫茎泽兰会导致小肠出现以绒毛出血性坏死和糜烂脱落为特征的病理损伤，大肠出现以浆膜水肿，上皮层充血和大量淋巴细胞浸润为特征的病理损伤，同时对小肠进行形态学测量，结果显示，小肠绒毛高度极显著降低，隐窝深度表现不同程度的加深，二者比值均极显著增加，研究表明，绒毛主要发挥吸收作用，长度增加则吸收功能增强，反之降低，而隐窝主要发挥分泌作用，其深度可反映肠上皮细胞成熟率，变深则肠上皮细胞成熟率降低，反之则表明肠上皮细胞成熟率上升，绒毛高度与隐窝深度的比值则综合反映了肠道的健康状况，比值下降表明肠道受损［15］。肠道由内向外依次为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜，被分为小肠和大肠，其各自特殊的肠道结构是构成肠道物理屏障的重要组成部分［16］，从本试验结果来看，紫茎泽兰可通过损伤肠道组织结构，降低小肠的吸收功能，降低肠上皮细胞成熟率，增加肠上皮的通透性，使肠道机械屏障的完整性被破坏。

肠道免疫系统由多个水平共同构成免疫屏障［17］，以抵御病原微生物的入侵，其中肠道免疫细胞及其分泌蛋白在此过程中发挥着重要作用。研究表明，肠道淋巴细胞的总数远超其存在于骨髓、胸腺、脾脏以及淋巴结中的数量［18］，肠道内淋巴细胞根据其分布的不同，可分为IELs 和LPLs。IELs 是肠黏膜免疫系统中最先与外来抗原接触的免疫细胞［19］，是一种快速有效的免疫调节效应物［20］，可分泌包括IL-2、IL-4、IL-10 及IFN-γ 等多种细胞因子［21−22］，能够促进肠道上皮细胞再生、保持肠黏膜结构和功能的完整，保护黏膜免受病原菌的侵害［22］。LPLs 参与宿主防御感染、代谢稳态和组织修复［23］，有助于维持上皮的完整性，并在肠道发生炎症反应时维持稳态［24−25］。GCs 是一种典型的黏液细胞，胞质内充满黏液颗粒，黏液颗粒内富含黏蛋白，分泌排出后与水混合可形成黏液，附着在肠黏膜表面，对组织表面起到润滑和保护作用，PAS 反应呈强阳性，因此，GCs 数量的多少反映了肠黏膜的健康状况，是肠黏膜异常的一个敏感指标。而sIgA 可阻止病原体在肠黏膜表面粘附，并中和肠毒素，抑制病原在肠黏膜上皮的移动，进而维持肠黏膜上皮的完整，因此sIgA 在肠道免疫系统中发挥着核心作用，且肠道黏膜分布着机体约80%的sIgA 细胞［26］，高sIgA 水平通常表明机体正在发生过度免疫反应，提示肠道黏膜免疫的激活，同时sIgA 的分泌也受到辅助性T 细胞分泌的细胞因子调控，如IL-2、TNF-γ、IL-4 和IL-10 等，都可促进sIgA 的分泌［27］，多种炎性细胞因子可损害肠上皮细胞屏障功能，导致肠黏膜通透性增高。本试验发现，饲喂紫茎泽兰可通过增加各肠段IELs、LPLs 和GCs 数量，升高黏膜内sIgA 水平，表明紫茎泽兰通过增加免疫细胞的数量和具有免疫活性的蛋白引起肠道感染或炎症，从而触发过度免疫反应表达。

有研究者［28］认为，细胞因子可以通过不同的途径诱导肠黏膜屏障损伤，且在肠道黏膜屏障发生损伤时细胞因子会显著激活免疫反应［29］，已证实TNF（tumor necrosis factor，TNF）会使肠道黏膜屏障破坏，且TNF 几个小时内就会导致屏障破坏［30−31］。此外，TNF 可通过诱导MLCK 通路发挥其调控屏障功能，而IFN-γ 在肠上皮细胞中也可通过诱导TNFR2 的表达启动这一调节通路［32］，表明多种因子间在调控肠道黏膜屏障中可相互影响，共同调控肠道黏膜免疫。IL-1β 和IL-2 是常见的促炎因子，IL-4 和IL-10 是常见的抑炎因子，这些细胞因子在调控肠道黏膜屏障中也有一定的作用，例如杨华等［33］用大肠杆菌刺激猪肠道上皮细胞发现细胞中IL-1β、IL-2、IL-6 mRNA 的相对表达水平显著升高，而IL-10 mRNA 的相对表达水平显著降低，且在使用丁酸梭菌治疗后细胞中IL-1β、IL-2、IL-6 mRNA 的相对表达水平又显著降低；也有研究表明肠紊乱后IL-1β 表达量增加，IL-4 表达量显著降低［34］，同时，前期研究结果显示，紫茎泽兰可引起动物机体血清中IL-2 等细胞因子显著增加，提示全身性炎性反应［35］，因此在本试验中，促炎因子IL-1β，IL-2，TNF-α 和IFN-γ mRNA 水平与蛋白水平的表达量增高，抑炎因子IL-4 和IL-10 mRNA 水平与蛋白水平的表达量降低，表明紫茎泽兰可引起大鼠肠道炎症反应，并通过调控细胞因子的分泌，从而激活肠道黏膜免疫，这与宋晓平［36］在有毒植物狼毒（Stellera chamaejasme）中的研究结果一致，狼毒中总黄酮对胃肠道有刺激作用，可使胃肠道组织结构破坏，肠黏膜功能异常，而紫茎泽兰是否通过调控紧密连接或其他调节通路增加肠道黏膜通透性还有待进一步的研究。

4 结论

紫茎泽兰可使大鼠出现以十二指肠绒毛出血、空肠绒毛顶端糜烂性坏死、回肠绒毛顶端凝固性坏死、盲肠黏膜下层水肿、结肠淋巴细胞增多、直肠淋巴细胞增生为病理特征的肠道结构损伤，还可不同程度的降低小肠各段绒毛高度、加深隐窝深度、增加绒毛高度/隐窝深度，进一步破坏肠道结构，同时紫茎泽兰可通过增加各肠段IELs、LPLs、GCs 数量，升高黏膜内sIgA 分泌量，增加促炎因子IL-1β、IL-2、TNF-α 和IFN-γ 表达量，降低抑炎因子IL-4 和IL-10 表达量，从而激活肠道黏膜免疫，揭示紫茎泽兰对大鼠肠道的毒性损伤作用。