添加黄梁木叶和壳寡糖对甘蔗梢青贮饲料发酵品质及有氧稳定性的影响

郭香，吴硕，郑明扬，陈德奎，邹璇，陈晓阳，周玮，张庆

（华南农业大学林学与风景园林学院，广东木本饲料工程技术研究中心，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，广东 广州 510642）

甘蔗（Saccharum officinarum）是热带和亚热带地区的一种经济作物，产量高，生产成本低，在中国南方地区广泛种植［1−2］。甘蔗梢是一种农业副产品，经常被焚烧，除了资源浪费外，还会造成环境污染。青贮是保存潮湿作物、延长储存时间和改善饲料适口性的常用方法，这种方法是厌氧条件下的乳酸（lactic acid，LA）发酵［3］。然而，青贮过程中甘蔗梢大量的可溶性碳水化合物和酵母菌的存在会促进以酒精发酵为主导，导致营养物质和干物质的损失，从而降低青贮饲料的有氧稳定性［4−8］。因此，甘蔗梢青贮普遍表现出发酵品质差、营养价值低、有氧稳定性差的特点。混合青贮是提高甘蔗梢青贮发酵性能和营养价值的有效方法。

黄梁木（Neolamarckia cadamba）原产于南亚和东南亚，是一种著名的多功能植物，广泛分布于我国广东、广西、云南等省份。由于其产量高、营养价值高和抗菌强的特性，最近已开始作为木本饲料被广泛栽培［9−10］。在黄梁木叶（N. cadambaleaves，NCL）青贮期间很少发生蛋白质水解，并且饲喂青贮NCL 可以有效改善动物的生长性能和质量［10］。在苜蓿（Medicago sativa）和柱花草（Stylosanthes guianensis）青贮过程中添加NCL 显著提高了其粗蛋白（crude protein，CP）和真蛋白（true protein，TP）含量，显著降低了非蛋白氮（non-protein nitrogen，NPN）和氨态氮（ammonia nitrogen，NH3-N）含量［11］。因为NCL 在青贮过程中具有抗菌和抗真菌特性，可能会直接影响青贮饲料中酵母菌和霉菌等不良微生物的活性［12−13］。到目前为止，还没有在青贮中添加NCL 是如何影响其有氧稳定性的研究。

壳寡糖（chitosan oligosaccharides，CO）是壳聚糖或甲壳素脱乙酰基水解而成的功能性低聚糖和天然碱性氨基葡萄糖聚合物［14］。它们与其他功能性糖一样，对肠道细菌有积极的调节作用，被认为是动物生产中抗生素的替代品［15］。在动物日粮中添加CO 可以改善其生长性能、抗氧化能力、肠道形态和屏障功能以及免疫力［16−18］。Yang等［19］的研究结果表明，日粮中添加CO 能促进断奶仔猪的生长性能和肠道屏障功能，增加双歧杆菌和乳杆菌的数量。CO 的突出生物活性包括抗菌、抗真菌和抗肿瘤活性［17］。杨焕蝶等［20］研究发现，壳聚糖能抑制大肠杆菌的活性，且较低的乙酰度和pH 值使壳聚糖的抑菌活性更强。Jaime 等［21］报道CO 可以破坏真菌细胞，因为它们增加了细胞膜的通透性。此外，一些研究表明，当聚合度为31～54 时，CO 对酵母菌的抑制活性最强［22］。因此，CO 可能改善青贮过程中的有氧稳定性。

使用具有抗菌活性的添加剂可以抑制酵母菌和霉菌的生长，从而减少发酵损失，提高有氧稳定性。本试验旨在研究NCL 和CO 对甘蔗梢青贮发酵品质和有氧稳定性的影响，以此改进甘蔗梢青贮的制备工艺。

1 材料与方法

1.1 原料及青贮制剂

甘蔗和黄梁木在华南农业大学（广州市，北纬23.24°，东经113.64°）试验田种植，2019年12月22日收获。立即用切割机将植株材料切成2 cm 左右，然后混合均匀，甘蔗梢与NCL 按鲜重比为100∶0、85∶15 和70∶30 的比例添加，添加或不添加CO（1%鲜料，fresh matter，FM），分别得到以下添加处理：无添加（control，CK）、15%NCL、30%NCL、CO、15%NCL+CO 和30%NCL+CO，共6 个处理组。混合均匀后，分装到塑料袋中，每袋约210 g，立即用真空封口机封口。共6 组，每组包括7 个重复，在室内温度（15～30 ℃）下保存。210 d 后，对青贮饲料进行发酵特性、化学成分、微生物种群和有氧稳定性分析。

1.2 有氧稳定性测定

随机抽取甘蔗梢发酵210 d 后的2 个塑料袋，共取400 g 原料混合均匀，松散放入18 个16 cm×15 cm、2 L 容积的实验塑料桶中。用一层聚乙烯塑料薄膜覆盖桶，扎出气孔，不仅可以让空气自由渗透青贮，还有助于防止干燥和污染［23−24］。将所有桶放入90 cm×50 cm×60 cm 的纸箱中。使用温度记录仪（SMOWO MDL-1048A，上海天河自动化仪表有限公司）连续7 d 每10 min 测量1 次室温和每个桶的温度。之后，从每个桶中抽取样品进行化学、微生物和有氧稳定性分析。在本研究中，有氧稳定性是指青贮在高于环境温度超过2 °C 之前保持稳定的小时数［24］。

1.3 微生物种群和化学成分分析

将青贮前、青贮第210 天和有氧暴露之后的20 g 样品分别与180 mL 无菌生理盐水溶液混合并逐层稀释，进行微生物数量的测定。采用Wang 等［25］的方法测定乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）、大肠杆菌、酵母菌和霉菌数量。菌落计数以菌落形成单位（colony forming unit，cfu）表示，即每克鲜料中活微生物的数量。从塑料袋中随机抽取20 g 青贮样品，加入180 mL 蒸馏水，在4 ℃条件下贮藏18 h 后取出，进行青贮饲料的pH 值、NH3-N 和有机酸含量的测定。按照万学瑞等［26］的方法，用4 层纱布及定性滤纸过滤之后立即使用玻璃电极pH 计（PHS-3C，INESA 科学仪器有限公司，中国上海）测定pH 值。采用Broderick 等［27］的方法测定NH3-N 的含量。根据Wang等［25］的方法，采用岛津GC-14 型高效液相色谱仪（Shodex Rspak KC-811s-DVB gel column 色谱柱，SPD-M10AVP检测器，日本）测定乳酸（LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）等有机酸含量。将青贮料在65 °C 烘干48 h 测定干物质（dry matter，DM）含量，样品用研磨机粉碎，密封袋保存。使用凯氏氮分析仪（K-9860，中国北京）测定粉碎原料和青贮样品的CP 含量［28］。采用Licitra 等［29］的方法分析NPN 和TP 含量。采用袁缨［30］的方法分析中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）和可溶性碳水化合物（water-soluble carbohydrate，WSC）含量。

1.4 数据统计与分析

采用SPSS 19.0 软件进行双因素方差分析，有统计学意义的阈值为P＜0.05。所有微生物计数数据均经log10变换。

2 结果与分析

2.1 青贮前甘蔗梢的化学特性和微生物种群组成

鲜甘蔗梢的干物质含量为33.0%，粗蛋白含量为6.1%DM（表1）。中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和可溶性碳水化合物含量分别为71.72%DM、37.25%DM 和5.69%DM。乳酸菌、酵母菌、霉菌数分别为3.98、3.77、3.59 log10cfu·g−1FM，大肠杆菌数量低于最低检测值3.00 log10cfu·g−1FM。

表1 青贮前鲜甘蔗梢化学成分及微生物数量Table 1 Chemical composition and microbial populations of fresh sugarcane top prior to ensiling（mean±SD，n=3）

2.2 甘蔗梢青贮的青贮品质和微生物数量

表2 显示了青贮后甘蔗梢的发酵品质和微生物数量。添加CO 后，乳酸和乙酸含量极显著降低（P＜0.01），LAB 数量极显著增加（P＜0.01）。无论是否添加CO，添加NCL 处理的pH 均显著降低（P＜0.05），这与其较高的乳酸含量和较低的LAB 数量相一致。所有处理组均未检出丙酸和丁酸。NCL 处理显著降低了中性洗涤纤维（P＜0.01）和酸性洗涤纤维含量（P＜0.05）。霉菌、酵母菌和大肠杆菌的数量均低于2.00 log10cfu·g−1FM。表3 显示了青贮后甘蔗梢的蛋白组分。NCL 处理极显著提高了粗蛋白和真蛋白含量（P＜0.01），极显著降低了非蛋白氮和氨态氮含量（P＜0.01）。30%NCL+CO 处理的粗蛋白和真蛋白含量显著高于CO 和15%NCL+CO 处理（P＜0.05）。

表2 混合黄梁木叶添加和不添加壳寡糖对甘蔗梢青贮210 d 发酵参数和微生物数量的影响Table 2 Effect of mixing N. cadamba leaves on fermentation parameters and microbial populations of sugarcane top silage with or without chitosan oligosaccharides for 210 days

表3 混合黄梁木叶添加和不添加壳寡糖对甘蔗梢青贮210 d 蛋白组分的影响Table 3 Effect of mixing N. cadamba leaves on the protein fractions of sugarcane top silage with or without chitosan oligosaccharides for 210 days

2.3 有氧暴露后甘蔗梢青贮的发酵特性和蛋白质组成

有氧暴露7 d 后，甘蔗梢青贮的发酵品质和微生物数量如表4 所示。添加CO 后，甘蔗梢青贮的干物质含量极显著增加（P＜0.01）。加入NCL 后，pH 值显著降低（P＜0.05），乳酸含量极显著升高（P＜0.01）。所有处理组均未检出丙酸和丁酸。单独添加CO 和NCL 或组合添加后，甘蔗梢青贮中LAB 的数量极显著增加（P＜0.01）。30%NCL 处理的酵母菌数量最多，添加CO 后酵母菌数量显著减少（P＜0.05）。仅在对照组中检出霉菌，大肠杆菌数量均低于2.00 log10cfu·g−1FM。表5 显示了NCL 和CO 对有氧暴露7 d 后甘蔗梢青贮蛋白质组分的影响。添加NCL 后，甘蔗梢青贮的粗蛋白和真蛋白含量极显著增加（P＜0.01），NPN 和NH3-N 含量极显著降低（P＜0.01）。30%NCL 和30%NCL+CO 处理的NH3-N 含量均显著低于其他处理（P＜0.05），其中30%NCL 处理的NH3-N 含量最低。

表4 混合黄梁木叶添加壳寡糖和不添加壳寡糖对甘蔗梢青贮有氧暴露7 d 后发酵参数和微生物种群的影响Table 4 Effect of mixing N. cadamba leaves on fermentation parameters and microbial populations of sugarcane top silage with or without chitosan oligosaccharides after aerobic exposure for 7 days

表5 混合黄梁木叶添加壳寡糖和不添加壳寡糖对甘蔗梢青贮有氧暴露7 d 后蛋白组分的影响Table 5 Effect of mixing N. cadamba leaves on the protein fractions of sugarcane top silage with or without chitosan oligosaccharides after aerobic exposure for 7 days

2.4 青贮甘蔗梢添加NCL 和CO 的有氧稳定性

表6 显示了NCL 和CO 对甘蔗梢青贮有氧稳定性的影响。15%NCL+CO 处理的有氧稳定性最高，其次是30%NCL+CO 和30%NCL 处理。在有氧暴露7 d 内，15%NCL+CO 处理在青贮过程中没有发生有氧腐烂。最高温度以15%NCL 和15%NCL+CO 处理同时达最低（31.0 ℃）。30%NCL+CO 处理达到最高温度所需时间（172 h）最长。添加NCL（P＜0.05）和CO 可提高甘蔗梢青贮的有氧稳定性。

表6 混合黄梁木叶和壳寡糖对甘蔗梢青贮有氧暴露期间有氧稳定性、最高温度和达到最高温度时间的影响Table 6 Effects of mixing N. cadamba leaves and chitosan oligosaccharides on the aerobic stability，maximum temperature and time to the maximum temperature of sugarcane top silage during aerobic exposure

3 讨论

3.1 青贮前甘蔗梢鲜料的化学特性和微生物种群组成

甘蔗梢作为饲用牧草，具有产量高、生产成本低的优点。本研究中甘蔗梢的粗蛋白和干物质含量低于高雨飞等［31］的结果，因甘蔗梢纤维含量较高，降低了其适口性。NCL 是一种新兴的蛋白质饲料（10.7%DM），且中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量分别为23.7%DM 和15.6%DM［11］。因此，推测添加NCL 可以提高甘蔗梢青贮的蛋白质含量和饲料消化率。可溶性碳水化合物是衡量青贮饲料品质的重要参数，甘蔗梢的可溶性碳水化合物含量（5.69%DM）低于保存良好青贮的理论要求（6%～7%DM）［32］，可能的原因包括甘蔗品种、地理位置和气候的差异。微生物种群的初始丰度是青贮发酵的另一个决定因素，甘蔗梢的初始乳酸菌计数低于5.00 log10cfu·g−1FM，这不利于大规模的乳酸发酵［3］。酵母菌和霉菌的丰度与乳酸菌的丰度相近，可能会阻碍乳酸菌的快速繁殖，从而降低青贮品质。因此，可以添加NCL、CO 等添加剂来提高甘蔗梢青贮的发酵质量。

3.2 不同处理对甘蔗梢青贮发酵质量的影响

青贮是一种长期保存饲料的储存方法，可以减少其养分损失，同时促进动物体内养分的消化吸收［7］。pH 值可用来评价青贮过程中的发酵程度和青贮品质。在本研究中，NCL 处理降低了pH 值，增加了乳酸含量。pH 值降低可以抑制不良微生物的繁殖，减少蛋白质降解，改善牧草保存［33］。Wang 等［11］报道称，NCL 能抑制梭状芽孢杆菌和大肠杆菌等有害微生物的生长，能有效改善高水分苜蓿和柱花草的青贮品质。本研究表明NCL 还能增加乙酸含量（P＞0.05），但Wang 等［13］发现，在NCL 处理下，乙酸含量显著降低。然而研究表明在缺糖情况下，产乙酸的细菌在长时间的青贮中能将乳酸代谢成乙酸［34］。在本研究中，青贮饲料的pH 值的降低和乳酸菌的快速繁殖，抑制了青贮中梭状芽孢杆菌等不良微生物的生长。与He 等［35］的观点一致，NCL 青贮中未检测到丁酸，有效抑制了梭状芽孢杆菌的繁殖。NCL 和CO 处理中纤维含量的降低可以改善甘蔗梢的适口性和消化率，未检出酵母菌、霉菌和大肠杆菌，可能是由于pH 值低（＜4.44）所致，同时，所有处理组均有LAB。Hutkins 等［36］报道LAB可以在pH 4.5～7.5 的范围内生长旺盛，这些腐败微生物通常在pH＜4.5 时受到抑制。此外，与NCL 含有丰富的活性植物营养素也有联系，如单宁，具有很强的抗菌能力。添加CO 导致不良微生物数量的减少可能是因为它们具有很强的抗菌活性。青贮过程中，由于植物蛋白酶和微生物的活动，蛋白质部分转化为NPN。过高的NPN含量不利于动物饲喂，因为与真蛋白相比，NPN 的利用率较低，并增加了畜牧业的氮排放。青贮中NH3-N 含量过高可能会降低青贮饲料的适口性和干物质采食量。NCL 的添加降低了NPN 和NH3-N 的含量，这是因为NCL 中的单宁可以与各种蛋白酶结合，从而抑制蛋白质的降解。与Wang 等［11］的研究结果相同，在高水分苜蓿和柱花草青贮中添加NCL 有效地抑制了蛋白质的降解，因为NCL 的蛋白水解活性较低。以上结果证实了NCL 处理对青贮中蛋白质的降解起到了保护作用。此外，CO 还可能通过抑制不良微生物的生长来减少蛋白质降解。研究表明，饲粮中添加CO 降低了仔猪盲肠中大肠杆菌的比例，增加了有益细菌的数量［37］。在本研究中，CO 增加了LAB数量和粗蛋白含量，降低了NH3-N 含量。综上所述，NCL 和CO 可以改善青贮品质，降低青贮过程中蛋白质的降解。

3.3 有氧暴露对甘蔗梢青贮料发酵品质和有氧稳定性的影响

在青贮过程中，pH 值和乳酸含量可作为评价有氧变质的指标。pH 也被认为是抑制微生物活性的重要因素之一。NCL 处理的pH 降低，主要是因为这些处理的乳酸含量高于CK 和CO 处理。此外，随着乳酸含量的增加，青贮质量也得到了改善。有氧暴露后，对照处理的霉菌数量增加，而NCL 和CO 处理的霉菌均未检出。这表明添加了NCL 和CO 抑制了霉菌的生长。类似地，Wang 等［11］在NCL 处理中未检测到霉菌。NPN 是蛋白质水解的直接指标，大致反映了粗蛋白的营养价值［28］。在本研究中，NCL 处理提高了粗蛋白和真蛋白含量，降低了NPN和NH3-N 含量。这表明添加NCL 处理在有氧暴露过程中甘蔗梢青贮料的蛋白质得到了较好的保存。CO 处理增加了粗蛋白的含量，可能是CO 抑制了有害微生物的生长，从而减少了有氧暴露后蛋白质的降解。NCL 和CO处理下甘蔗梢青贮在有氧暴露后蛋白质保存效果显著的机理值得进一步研究。

有氧稳定性在生产应用中是评估青贮质量的一个重要指标。有氧恶化会对青贮饲料的营养保存和动物的饲料摄入量产生不利影响。青贮饲料的有氧变质是指酵母菌在有氧暴露期间将碳水化合物和乳酸转化为二氧化碳和水的一系列反应［23］。有氧条件下的青贮饲料很大程度上受酵母菌数量的影响。15%NCL+CO 处理组酵母菌数量低于3.00 log10cfu·g−1FM，其他添加NCL 的处理组的酵母菌数量更高，说明15%NCL+CO 组的有氧稳定性最好。低pH 有助于维持有氧稳定性，抑制牧草发酵。在本研究中，15%NCL+CO 处理的甘蔗梢pH 值低于其他处理组。因此，15%NCL+CO 处理可能有利于提高有氧稳定性。乙酸可以抑制腐败微生物的生长，并提高有氧暴露后的有氧稳定性［38］。15%NCL+CO 处理下乙酸含量高于30%NCL+CO 处理。这表明15%NCL+CO处理比30%NCL+CO 处理具有更好的有氧稳定性。温度和储存时间的增加会导致酵母菌和丝状真菌数量增加，它们被认为是好氧恶化的关键指标［39］。其中青贮温度的升高不仅由于好氧微生物的增殖，也由于养分流失的增加。综合考虑，15%NCL 和15%NCL+CO 处理组的最高温度和达到最高温度的时间效果最好。CO 提高了NCL 与甘蔗梢混合的有氧稳定性，这可能是由于CO 降低了酵母菌的数量。综上所述，同时添加15%NCL 和CO可以提高甘蔗梢青贮饲料的有氧稳定性。

4 结论

本研究结果表明，NCL 和CO 对甘蔗梢青贮的发酵品质和有氧稳定性有积极的影响。甘蔗梢添加NCL 青贮210 d 后可降低pH 值、非蛋白氮和氨态氮含量，提高乳酸、乙酸、粗蛋白和真蛋白含量，从而改善青贮品质。有氧暴露7 d 后，NCL 处理的pH 值、非蛋白氮和氨态氮含量降低，而乳酸、乙酸、粗蛋白和真蛋白含量增加。15%NCL+CO 处理的有氧稳定性最高，在有氧暴露过程中几乎没有发生有氧腐败。CO 的抑菌作用有助于改善甘蔗梢青贮品质和有氧稳定性。以上结果表明，15%NCL+CO 处理是提高甘蔗梢青贮发酵品质和有氧稳定性的最佳添加剂组合。