重组大肠杆菌产腈水合酶的发酵工艺研究

齐勇，陈森林，芮枝花，沙云冲，姚崇虎

（安徽瑞邦生物科技有限公司，安徽 马鞍山 243100）

烟酰胺（Nicotinamide），俗称维生素B3，分子式为C6H6N2O，分子量122，广泛存在于自然界中，属于B 族维生素。烟酰胺作为一种辅酶，参与机体多种氧化还原反应，并且直接参与到碳水化合物、蛋白质和脂肪的代谢当中[1]；作为药物，烟酰胺可治疗皮肤病、神经疾病、糖尿病、肝脏疾病及日光性皮炎等；在添加剂领域[2]，它作为补充人体必需的维生素可以添加到食品中，同时它也可以应用于畜牧业，作为动物的饲料添加剂；此外，烟酰胺在医学上同样应用广泛，可作为医药中间体治疗各类疾病[3]。

烟酰胺的合成方法一直受到关注。其生产工艺主要有化学合成和生物合成两种方法。烟酰胺的化学合成法是利用吡啶类物质作为原料，首先通过氧化反应得到3-氰基吡啶，之后3-氰基吡啶在一定条件下进行碱水解反应得到烟酰胺[4]。传统的化学合成法存在工艺产率和纯度较低等弊端，而且反应条件苛刻，并对环境有一定污染。生物法即利用已知的腈水合酶催化3-氰基吡啶生产烟酰胺[5]，随着DNA重组技术的发展以及目前大肠杆菌表达系统的开发和成熟，腈水合酶的异源表达已经实现[6]，利用腈水合酶催化烟腈来合成烟酰胺已经成为目前最普遍的方法。部分学者利用重组大肠杆菌表达腈水合酶基因，并顺利地进行了小试水平的烟酰胺生产，其烟酰胺的最终产量可以达到23%。

本研究构建出一株产腈水合酶的重组大肠杆菌M910001-pMh1229 进行高密度发酵，并系统研究了发酵条件，同时鉴定了其催化合成烟酰胺的能力，降低其烟酰胺合成中副产物烟酸的生成及其稳定性探究，为烟酰胺的产业化生产提供技术支持。

1 实验部分

1.1 菌种

大肠杆菌M910001-pMh1229，本实验室构建，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.20430。

1.2 培养基

1.2.1 活化斜面培养基

LB 培养基：5 g/L 酵母粉；10 g/L 蛋白胨；10 g/L NaCl，琼脂粉20 g/L。

1.2.2 种子培养基

发酵一级种子培养基：5 g/L酵母粉；10 g/L蛋白胨；

10 g/L NaCl。

发酵二级种子培养基：TB 培养基：24 g/L 酵母粉；12 g/L 蛋 白 胨；2.31 g/L KH2PO4；16.43 g/L K2HPO4·3H2O；5.04 g/L甘油。

1.2.3 发酵培养基

基 础 盐 溶 液：17.1 g/L Na2HPO4·12H2O；3 g/L KH2PO4；1 g/L NaCl；1 g/L NH4Cl；1.3 g/L MgSO4·7H2O。

发酵基础培养基：32 g/L 酵母粉；20 g/L 甘油；17.1 g/L Na2HPO4·12H2O；3 g/L KH2PO4；1 g/L NaCl；1 g/L NH4Cl；1.3 g/L MgSO4·7H2O；0.03 g/L氯化钴。

1.2.4 补料流加培养基

发酵补料培养基：100 g/L酵母粉；400 g/L甘油。

注：以上培养基均为卡那霉素抗性，Kana终浓度均为50 mg/L。

1.3 主要仪器

YXQ-LS-75SII 立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；5 L自动控制发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司；隔水式恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；722 分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；OLYMPUS 生物显微镜，日本OLYMPUS 会社；Agilent1200高效液相色谱仪，Agilent Technologies。

1.4 培养方法

1.4.1 菌种活化

使用接种环每次从保藏-80℃的甘油管中蘸取1～2滴环菌液，然后均匀接种于3 支初代斜面培养基上，在37℃培养箱中培养12 h，之后再从培养好的一代斜面培养基中取一环菌体接种于二代斜面培养基上，在37℃培养箱中培养12 h。

1.4.2 一级种子培养

将3 支活化好的菌种斜面分别接种到3 个250 mL的三角摇瓶中，每个摇瓶含有40 mL 的一级种子培养基，然后将其放置于37℃、220 r/min的摇床上，培养8 h。

1.4.3 二级种子培养

将培养好的3 个一级种子液分别接种到3 个500 mL的三角摇瓶中，每个摇瓶含有150 mL的二级种子培养基，然后将其放置于37℃、220 r/min 的摇床上，培养8 h。

1.4.4 发酵培养

将二级种子液150 mL全部转接至装有发酵培养基的5 L 发酵罐中，发酵培养基体积为2 L。发酵过程中通过流加氨水，将pH控制在7.0左右。通过控制转速及通气量将溶氧控制在35%～45%。初始发酵温度为35℃，发酵过程通过补料流加培养基进行高密度发酵，当发酵液OD600达到60左右，降温至18℃，加入诱导剂进行诱导，每4～6 h 取样检测发酵液OD 值、酶活。至酶活不再上升即可放罐。

1.5 检测方法

1.5.1 pH值和溶氧DO测定

采用发酵罐自带的梅特勒pH电极和光学溶氧电极进行测定。

1.5.2 菌体量测定

每隔4 h取样，分别稀释100、200、400倍，用紫外分光光度计测定其生物量OD600 的吸光值，其吸光值范围在0.3～0.7。如超过吸光值范围后需换下一个稀释倍数。按公式（1）计算菌体的生物量：

1.5.3 发酵液酶活测定

底物溶液：称取70 g 烟腈，溶于1 L PBS 缓冲溶液中。缓冲溶液（PBS）的配制：称取三水磷酸氢二钾21.6 g，磷酸二氢钾0.72 g，溶于1 L的超纯水中；使用高效液相色谱分析仪进行发酵液酶活的测定，将底物溶液放置在控温30℃混匀振荡器上进行振荡，向其加入10 μL处理后的发酵液。反应10 min后加入500 μL的乙腈溶液终止反应。将反应后的溶液用离心机在12000 r/min的条件下离心3 min，将离心后的反应液上清液稀释10倍，然后过0.22 μm 微孔滤膜，最后采用液相色谱分析仪进行测定；色谱柱条件：VP-ODS C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm），体积分数为50%乙腈溶液和2.28 g/L磷酸二氢钾水溶液为流动相，以1∶10的比例进行同时洗脱，柱温30℃，流速1 mL/min，检测波长为230 nm。按照公式（2）计算发酵液酶：

式中：c-液相色谱得出的烟酰胺浓度，μg/mL；V-反应体积，这里是500 μL 反应液＋500 μL 乙腈；X-反应进样前的稀释倍数（10）；T-反应时间，10 min；v-所加粗酶液体积，10 μL；122-烟酰胺分子量。

发酵液酶活（U/mL）=粗酶液酶活×发酵液稀释倍数

2 结果与讨论

在大肠杆菌发酵过程中，发酵培养基的条件及诱导剂的条件是决定最终发酵酶活的两大关键因素，因此我们从这两方面重点探讨了其对发酵过程及酶活的影响。

2.1 培养基优化

2.1.1 不同氮源对发酵产腈水合酶酶活的影响

细菌菌体的细胞物质如蛋白质、核酸等含氮化合物均由氮源组成。目前常用的氮源主要由有机氮源和无机氮源组成。而无机氮源一般含有铵盐、氨水等，可供微生物直接利用，称为速效氮源；有机氮源一般较为广泛，如蛋白胨、酵母粉、玉米浆等。在发酵工业中，有机氮源不仅作为提供菌体生长繁殖和合成目标产物的氮元素，还存在一些目标产物所合成必须的调节物、前体等物质。因此，工业发酵的成功与否即是选择合适的有机氮源。

本试验以基础盐溶液培养基为基础，加入20 g/L的甘油，额外加入32 g/L的氮源（OXOID酵母抽提物、安琪酵母粉902、安琪酵母粉905、安琪酵母粉908、大豆蛋白胨、鱼骨蛋白胨和玉米浆干粉）。分别考查这些氮源对该菌生长和产酶影响，结果如图1所示。

图1 不同氮源对发酵产腈水合酶酶活的影响

由图1 可知，最初采用酵母抽提物单配基础盐溶液作为发酵培养基，明显可以看到，虽然菌体量达到了120，但是酶活较低，仅仅只有2521 μ/mL，随后在选择其他不同氮源后，菌体量和酶活呈现了明显上升的趋势，图1 可以看到重组菌在利用酵母粉作为氮源其产酶能力最好，其中安琪酵母粉908 酶活可以达到5880 μ/mL，OD600 达到了210，说明该氮源更利于产酶。而蛋白胨等其他氮源的产酶能力次之，效果较好的大豆蛋白胨最高酶活只有4871 μ/mL，OD600 达到了198。因此我们选择安琪酵母粉908作为最适氮源。

2.1.2 不同碳源对发酵产腈水合酶酶活的影响

碳源在发酵工业的领域中非常关键，其不仅提供细胞的碳架，也为细胞的生命活动提供所需的能量。常用的碳源有糖类、油脂、有机酸和小分子醇类等[17-18]。为了确定该重组菌的最适碳源，将对碳源进行优化。

本试验以基础盐溶液培养基为基础，加入32 g/L的安琪酵母粉908，额外加入20 g/L 的碳源（葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、甘油），来考查这些碳源对菌体生长和产酶影响，结果如图2所示。

图2 不同碳源对发酵产腈水合酶酶活的影响

由图2 可知，重组菌在利用麦芽糖、蔗糖和淀粉作为碳源时，其菌体量达到了170、190和165，相对应的酶活也平均在5000 μ/mL 左右，但是重组菌在利用葡萄糖和甘油作为碳源时效果比其他碳源较好，两者OD600水平相当，酶活分别为6551 μ/mL 和6621 μ/mL，OD值分别为210 和215。但是与葡糖糖相比，甘油代谢较慢，不会产生葡萄糖效应，不容易产生代谢副产物，因此在对比以上碳源时，我们选择大肠杆菌较为容易吸收的甘油作为最适碳源。

2.2 诱导条件的优化

发酵过程中采用诱导剂进行诱导是必须的。但是IPTG即异丙基硫代半乳糖苷作为实验室最常用的诱导剂，由于其本身不能被大肠杆菌代谢，因此利用少量的IPTG 即可诱导使其表达量增高，产物稳定。其在细胞内可以稳定诱导蛋白表达同时并不受细胞代谢的影响。但是在工业化大规模的发酵中，IPTG 由于本身存在价格昂贵和一定的毒性等缺陷，因此并不适合工业化应用。相比较IPTG，乳糖同样可作为诱导剂来诱导蛋白表达，其具备双重作用，不仅作为诱导剂，还可以作为碳源供重组细菌发酵利用。因此，将两种诱导剂进行相比，选取最佳的诱导剂。

通过上述选择合适的碳源和氮源后，我们采用其作为发酵培养基，保持其他条件不变，选择不同诱导剂诱导分别考查其对重组菌生长和产酶影响，结果如图3和图4所示。

如图3 所示，重组菌利用IPTG 诱导的酶活仅仅达到了5231 μ/mL，菌体量180；反之，重组菌在利用乳糖作为诱导剂，不管是其酶活还是菌体生长情况都远好于IPTG 诱导。利用乳糖诱导，酶活达到了7521 μ/mL，OD600 达到了220，分别提高了43.8%和22.2%。

图3 不同诱导剂对发酵产腈水合酶酶活的影响

如图4 所示，在最优培养基的条件下，对比了两种诱导剂的优劣后，选择乳糖作为诱导剂进行发酵，通过控制乳糖在发酵体系中的终浓度为0.5 g/L、1 g/L、1.5 g/L、2 g/L、2.5 g/L、3 g/L、3.5 g/L、4 g/L。从图4可知，当诱导剂浓度为3 g/L时，菌体的生长和产酶效果最好，酶活达到了8500 μ/mL，OD600达到了225。

图4 不同乳糖浓度对发酵产腈水合酶酶活的影响

通过分析发现，选择乳糖作为诱导剂，其发酵酶活及菌体量都随着乳糖在发酵体系中的终浓度上升而增加，但当乳糖浓度超过3 g/L时，其酶活出现了略微下降的趋势，由此可知，再增加乳糖浓度，将对发酵酶活产生抑制作用，同时还会增加发酵成本，因此基本确定乳糖浓度为3 g/L 为最适诱导浓度，此时的酶活及生物量最高。

3 结论

（1）本研究利用本公司实验室所构建出的一株产腈水合酶的重组大肠杆菌M910001-pMh1229进行高密度发酵，并对其发酵条件进行了系统研究，在基础盐溶液的基础上，采用单因素法对发酵过程中培养基进行优化。通过氮源、碳源的筛选，确定最优的碳氮源。最终确定了发酵培养基成分，其组成为：32 g/L酵母粉，20 g/L 甘油，17.1 g/L Na2HPO4·12H2O，3 g/L KH2PO4，1 g/L NaCl，1 g/L NH4Cl，1.3 g/L MgSO4·7H2O，并利用乳糖作为诱导剂，浓度为3 g/L。

（2）优化后的培养基对于该菌发酵产腈水合酶酶活可以达到8500 μ/mL，OD600 达到了225，酶活对比优化前提高了45%，为烟酰胺的产业化生产提供技术支持。