产IAA兼具溶磷解钾高效促生菌的筛选、鉴定及其 广谱性应用

张昊鑫 王中华 牛兵 郭慷 刘璐 姜瑛 张仕祥

（1. 河南农业大学资源与环境学院，郑州 450002；2. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州 450001）

烟草作为主要经济作物，在我国分布广泛，河南省种烟历史悠久，潮土是河南省种植烟草的主要土壤类型之一［1］；同时潮土因其分布较为广泛、土层深厚、地势平坦、易于耕作，也是我国小麦、玉米等粮食作物的种植土壤类型之一。而潮土的砂粒含量较高，保肥供水的能力较差，因其积累腐殖质的能力较弱而总体肥力偏低［2］。如何改善和利用潮土的性状，充分发挥经济与粮食作物在潮土的生产潜力，是人们共同关注的热点问题。

能够促进植物生长、防治病害、增加作物产量的微生物统称为植物根际促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）［3］。大量研究表明，PGPR菌剂能够在一定程度上改善潮土性质，增加其保肥供水能力，显著提高作物产量［4-5］。PGPR菌兼具溶磷、解钾、产吲哚乙酸（indole acetic acid，IAA）等能力，可有效改善土壤中磷、钾的有效性，降低化肥施用量，进一步提升农产品的产量和品质［6-7］，可持续生产优质农产品［8］。

根际促生菌和作物之间的相互影响具有波动性，在盆栽试验中取得较好的实验结果不代表在实际生产过程中也能够取得相近的结果［9］，菌剂的广泛应用仍存在局限性。筛选具有良好促生能力的PGPR，使之契合不同作物、不同土壤，是PGPR产业发展的方向［10］。

本研究从烟草的潮土种植区，挑选出一株长势良好的烟草植株，收集根际土壤，分离筛选出能够高产IAA并溶解难溶性钾、无机磷、有机磷的多功能根际促生菌，并对其进行鉴定、条件优化、盆栽应用试验、烟草与小麦的大田应用试验，为实现经济作物与粮食作物的安全生产以及增产提效提供优质的微生物资源。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试土壤 土壤样品采集于许昌市国家烟草基地植烟区10-20 cm烟草根际潮土，采集后去除杂质，装入自封袋中，4℃保存，其基本理化性状见 表1。

表1 供试土壤基本理化性状Table 1 Basic physical and chemical properties of tested soil

1.1.2 培养基 试验培养基培养配方 LB液体培养基：氯化钠 10 g，蛋白胨 10 g，酵母提取物 5 g（固体再加琼脂20 g），蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0-7.2。

无机盐培养基：磷酸二氢钾 1.00 g，七水硫酸镁 0.40 g，氯化钙 0.10 g，氯化铁 0.01 g，氯化钠 0.20 g，硫酸铵 3.00 g，蒸馏水定容至 1 000 mL。

液态解钾细菌培养基［11］：蔗糖 10.0 g，酵母膏 0.5 g，硫酸铵 1.00 g，磷酸氢二钠 2.00 g，七水硫酸镁 0.50 g，碳酸钙 1.00 g，钾长石粉 1.00 g，蒸馏水 1 000 mL。

无机磷细菌培养基（PKO培养基）［12］：磷酸三钙 5 g，葡萄糖 10 g，硫酸铵 0.5 g，氯化钠 0.3 g，七水合硫酸镁 0.3 g，氯化钾 0.3 g，硫酸锰 0.03 g，七 水合硫酸亚铁 0.03 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0-7.2。

有机磷培养基：在无机磷培养基的基础上加 0.2 g可溶性卵磷脂，再加0.4 g酵母膏。以上培养基均需在121℃，灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 烟草根际多功能促生菌的筛选

1.2.1.1 菌株的分离纯化 准备好带有玻璃珠并装有 90 mL无菌水的 250 mL锥形瓶，加入 10 g供试土壤，在摇床中震动 20 min，取出静置 10 min后得到浓度为 0.1 g/mL的菌悬液，对此菌悬液依次进行稀释，得到浓度为10-2、10-3、10-4…10-8g/mL的菌悬液。采用稀释涂布法分离纯化细菌，4℃ 保存［13］。

1.2.1.2 产IAA能力测定 将分离纯化后的细菌接种于 50 mL含有L-色氨酸（100 mg/L）的LB液体培养基，在30℃，180 r/min条件下培养1 d。

（1）定性测定［14］：在白色陶瓷板上滴加50 μL菌悬液，并加等体积的 Salkowski比色液（50 mL 35% HClO4+1 mL 0.5 mol/L FeCl3）。白色陶瓷板于室温避光静置30 min后观察，颜色变红者表示能够分泌吲哚乙酸。

（2）定量测定［15］：在10 000 r/min的条件下将10 mL菌悬液离心10 min取2.5 mL上清液，同时配置浓度依次为0、10、20、30、40、50、60 μg/mL的IAA标准溶液，按1∶1的体积比与Salkowski比色液混合，避光静置30 min，测定其OD530值，根据标准曲线获得YC9产IAA浓度。

1.2.1.3 解钾能力测定 将分离纯化后的菌株按1%（V/V）接种量接种于50 mL解钾细菌液体培养基，30℃，200 r/min培养3 d后，在6 000 r/min的条件下，离心20 min，取上清液，采用火焰分光光度计测定K+含量［11］。

1.2.1.4 溶无机/有机磷能力测定 将分离纯化后的菌株按1%（V/V）接种量接种于50 mL无机磷细菌液体培养基（PKO培养基）/有机磷细菌液体培养基，30℃，180 r/min培养4 d后，取培养液10 mL，10 000 r/min离心15 min，采用钼蓝比色法测定上清液中有效磷含量［12］。

1.2.2 菌株鉴定

1.2.2.1 菌株形态学鉴定 将筛选的菌株接种到LB平板上，30℃培养1 d，观察菌落大小、形状、表面形态、边缘特征、透明度等［16］，并对菌体进行电镜（日立S-3400N）扫描观察［17］。

1.2.2.2 生理生化指标鉴定 革兰氏染色、好氧性、接触酶、甲基红（M.R）、二乙酰（V-P）、淀粉水解、明胶水解、硝酸盐还原、柠檬酸盐利用等试验方法均参照《常见细菌系统鉴定手册》［16］。

1.2.2.3 16S rDNA分子学鉴定 将菌株用LB液体培养基培养至对数生长期，离心收集菌体，采用SDSCTAB法提取总基因组DNA［18］，采用细菌16S rDNA通 用 引 物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）进 行16S rDNA的PCR扩增［19］。由北京美亿美生物技术有限公司进行测序并将序列与GenBank数据库进行比较，通过MEGA 7.0软件建立系统发育树，分子序列提交GenBank，获得登录号。

1.2.3 不同条件对菌株生长及产IAA能力的影响 按照表2分别对含有L-色氨酸（100 mg/L）的液体培养基进行调节，不同装液量和pH采用LB液体培养基，不同碳、氮源采用无机盐培养基分别以1%、0.1%（M/V）的量加入，将筛选出的菌株按1%（V/V）接种量接种于250 mL三角瓶，置于30℃，180 r/min摇床培养24 h，按定量测定的方法测定产IAA的量，同时测定OD600菌株生长情况。

表2 菌株生长及产IAA能力条件优化Table 2 Optimization of conditions for strain growth and IAA production capacity

1.2.4 盆栽试验 烟草种子（豫烟10号）用10%双氧水浸泡30 min，表面消毒，无菌水冲洗多次，在室温条件下催芽2 d，选取发芽一致的种子备用。采集自然条件下0-20 cm土层的新鲜潮土，过5 mm筛，每盆装700 g的土样，种植烟草。将筛选得到的菌株接种于LB液体培养基，30℃，180 r/min摇床培养，培养菌长至对数生长期，然后在10 000 r/min条件下将菌悬液离心10 min，离心重悬3次后制成1011CFU/mL的菌悬液，以108CFU/g的接种量接种至土壤中，对照土壤喷洒等量经过灭菌处理的菌悬液，每个处理4次重复。调节含水量至田间持水量的60%［20］，室温培养30 d后采样，根系图像用根系扫描仪（LA1600+ scanner，Canada）扫描获得，用根系分析软件（Winrhizo2003b，Canada）分析相关根系指标，IAA含量用HPLC法测定［21］，并分别用钼锑抗比色法和火焰光度法测定土壤中速效磷、速效钾含量，植株的鲜重、株高、SPAD值及全氮、全磷、全钾含量［22］。

1.2.5 YC9菌剂在大田的应用试验

1.2.5.1 烟田的应用 在许昌市试验区进行试验，土壤类型为潮土，理化性状见表1。试验地整地、基肥施用、起垄、移栽时间均按照当地烟叶生产模式进行。按照当地常规施肥N 54.22 kg/hm2，P2O595.85 kg/hm2，K2O 347.26 kg/hm2，70%作基肥，30%作追肥［23］。处理为在常规施肥基础上穴施以骨粉为载体含有效活菌数1011CFU/g的YC9菌剂，施用量40.0 kg/hm2，以在常规施肥基础上施用灭菌菌剂为对照。各处理试验面积为50 m2，3次重复，采用小区随机区组排列试验。供试烟草品种为豫烟10号。测定土壤的pH、IAA、有效氮、速效磷、速效钾，测定方法同盆栽试验，烤后烟叶产量、不同等级烟比例按小区计算，然后折合出最终产量。烤后烟叶取中部叶进行烟碱、总糖、还原糖、钾、氯含量测定。采用比色法测定烟碱，总糖、还原糖采用蒽酮硫酸法测定，采用流动分析仪法测定总氮、钾、氯 含量［22，24］。

1.2.5.2 麦田的应用 试验于河南省新郑市华北小麦-玉米轮作营养与施肥科学观测试验站进行，土壤类型为砂质潮土，理化性状见表3。播种量为150 kg /hm2，生育期间其他管理措施同当地高产小麦田管理措施。以当地常规施肥方式，基施复合肥（N∶P2O5∶K2O=15∶15∶15）600 kg/hm2，于 小 麦拔节期开沟追施尿素120 kg/hm2。处理为在常规施肥基础上施用以骨粉为载体含有效活菌数1011CFU/g的YC9微生物菌剂，施用量为40.0 kg/hm2，在常规施肥基础上施用灭菌菌剂为对照。供试小麦品种为矮抗58。于小麦成熟期在小麦行间采用5点取样法，采集0-20 cm土壤样品，测定土壤中pH、IAA、有效氮、速效磷、速效钾，测定方法同盆栽试验，并取1 m双行的穗数，取20株小麦测地上部生物量、穗粒数、株高、有效穗数和千粒重，每小区收获4 m2测实际产量［25］。

表3 麦田供试土壤基本性质Table 3 Basic properties of test soil in wheat field

1.2.6 数据分析 采用 Microsoft Office 2010、SPSS 23.0 和Metabo Analyst进行数据的统计和分析，Origin 6.0作图，单因素方差分析采用LSD法检验处理间的差异显著性（P＜0.05），相关性采用Pearson相关性分析。

2 结果

2.1 烟草根际多功能促生菌的筛选

从采集的土壤样品里共筛选分离出12株菌株，将其分别命名为YC1-12，在实验室摇瓶条件下对其进行各项促生功能验证，得到一株产IAA、解钾、解无机磷、解有机磷能力较好的菌株YC9，其高产IAA达61.71 mg/L、对钾长石粉的转化量达到17.57 mg/L、对磷酸三钙的转化量达到98.25 mg/L，对卵磷脂的转化量达0.64 mg/L（表4）。

表4 YC9各项促生能力Table 4 Various growth promoting abilities of YC9

2.2 YC9菌株形态、生理生化指标及分子鉴定

经过平板划线对YC9进行形态的观察（图1-A），可见YC9菌落体积较大，中央向上突起，半透明，边缘较为光滑，表面湿润光滑，黏稠状，革兰氏阳性（图1-B）。扫描电镜结果表明，其菌体为杆状，菌体大小为（2.25-3.25）μm×（0.62-0.93）μm （图1-C）。

图1 菌株YC9的菌落图（A），革兰氏染色图（B）及电镜图（C）Fig. 1 Colony diagram（A），Gram staining diagram（B）and electron microscope diagram（C）of strain YC9

YC9的16S rDNA基因片段约为 1.5 kb。用GenBank数据库对菌株YC9的16S rDNA进行比对，并以同源性较高的菌株为参照菌进行系统发育分析，发现YC9与威兹曼芽胞杆（Bacillus wiedmannii）FSL W8-0169（NR152692）高度同源（98.88%）。用MEGA version 7.0 软件构建YC9的16SrDNA系统发育树（图2）。GenBank上传序列，获得登录号KP743129。

图 2 YC9 菌株 16S rDNA 基因序列的系统发育树Fig. 2 Phylogenetic tree of 16S rDNA gene sequence of YC9 strain

YC9各项生理生化指标如表5所示，该菌株兼性厌氧，除甲基红反应和柠檬酸盐利用为阴性，其余指标均为阳性。参照菌株同为兼性厌氧，甲基红反应为阴性，柠檬酸盐利用有55%呈阳性，其余指标均为阳性。结合形态、16S rDNA结果以及生理生化特征，鉴定YC9为威兹曼芽胞杆菌（Bacillus wiedmannii）。

表5 YC9菌株的生理生化特性Table 5 Physiological and biochemical characteristics of YC9 strain

2.3 不同条件对菌株YC9生长及产IAA能力的影响

如图3所示，随着装液量增加，通气量减少，装液量达到150 mL/ 250 mL时，YC9产IAA量最多，达到72.82 mg/L。pH为4和10时YC9无法生长，其最适pH为7-9，IAA产量维持在75.2 mg/L左右。当以酵母粉和蛋白胨为氮源，葡糖糖、蔗糖和果糖为碳源时，菌体生长以及产IAA能力均较好，当分别以蛋白胨和葡萄糖为氮源和碳源时，IAA产量均达到最高，可分别达到75.33 mg/L和74.24 mg/L。

图3 不同培养条件对YC9菌株产IAA能力和生长状况（OD600）的影响Fig. 3 Effects of different culture conditions on the IAA production capacity and growth status（OD600）of YC9 strain

2.4 接种YC9对烟草盆栽土壤性质及烟草生长的影响

如表6所示，与对照相比，接菌30 d后，土壤的速效磷、速效钾分别显著增加了21.23%、10.37%，其中IAA的含量增加了261.54%，达到极显著水平，表明YC9能够显著改善土壤中养分的含量，为烟草的生长提供有利的生存环境。

表6 接种菌株YC9 30 d后对土壤IAA以及速效磷钾含量的影响Table 6 Effects of inoculating strain YC9 on the soil IAA and available phosphorus and potassium contents after 30 d

烟草根系扫描分析结果表明（图4-A），与对照相比，接菌处理的根长、根表面积、根体积、根尖数分别显著增加了124.12%、121.84%、164.00%、105.19%。长势相关数据表明（图4-B），接菌处理的株高、SPAD、全氮、全磷、全钾分别显著提升了17.99%、15.52%、22.58%、22.56%、22.51%，而植株的鲜重极显著增加了58.87%。

图4 YC9对烟草盆栽根系（A）和植株（B）的影响Fig. 4 Effect of YC9 on the root（A）and plant（B）of tobacco in the pot experiment

2.5 YC9处理烟草盆栽幼苗各指标之间的主成分分析、热图分析、相关矩阵以及随机森林

采用主成分分析（PCA）的方法研究了YC9对烟草盆栽试验各指标的影响，其中PC1和PC2在整体的变异中分别占了90.8%和7.3%（图5-A）；CK和YC9处理显著分离（图5-B）；PC1显著影响了土壤速效磷、速效钾、IAA含量、根总长、根表面积、根体积、根尖数、根平均直径、根分枝数、植株鲜重、株高、SPAD值、植株全氮、植株全磷、植株全钾，PC2显著影响了土壤速效磷、速效钾、IAA含量、植株鲜重、株高、根总长、根体积（图5-C）。随机森林图结果（图5-D）表明：对于土壤营养指标，Mean Decrease Accuracy值由大到小依次为土壤速效磷、土壤速效钾、IAA；对于地下部指标，Mean Decrease Accuracy值由大到小依次为根体积、根总长、根表面积、根尖数、根分支数、根平均直径；对于地上部指标 Mean Decrease Accuracy值由大到小依次为SPAD值、植株全磷、株高、植株全钾、植株全氮和植株鲜重。

图5 YC9处理下烟草盆栽土壤及烟草各指标变化的主成分分析（A、B、C）和随机森林图（D）Fig. 5 Principal component analysis（A，B，and C）and random forest map（D）of tobacco potted soil and tobacco indexes under YC9 treatment

相关性分析结果表明，土壤中速效磷浓度与根总长、根体积、SPAD值、植株鲜重呈显著正相关；土壤中速效钾浓度与根总长、根表面积、根体积、植株全钾呈显著正相关，与植株鲜重、株高、SPAD值和植株全磷呈极显著正相关；土壤中IAA浓度与根总长、根体积、SPAD值、植株鲜重呈显著正相关（表7）。

2.6 接种YC9菌剂对烟田土壤理化性质以及烟草产量和品质的影响

对烟田土壤的理化性质进行分析发现（图6-A），土壤IAA、速效磷、速效钾含量分别显著增加了63.16%、17.55%和14.17%。由表8和图6-B可知， 与对照相比，接菌处理使烟草叶片化学品质指标中的总糖、还原糖、烟碱、K+的含量分别增加了11.01%、14.84%、2.95%、17.06%，钾氯比、糖碱比、两糖比分别增加了36.02%、11.52%、3.61%，Cl-的含量减少了13.89%，烤烟的产量和上等烟的比例分别增加了14.3%和9.6%。

表8 YC9处理对烤烟产量性状的影响Table 8 Effects of YC9 treatment on the yield characters of flue-cured tobacco

2.7 接种YC9菌剂对麦田土壤理化性质以及小麦产量的影响

由图7-A可知，小麦土壤中IAA、有效氮、速效磷、速效钾的含量分别显著提升了65.62%、7.52%、10.64%、14.73%。小麦产量性状中成熟期地上部生物量、有效穗数、产量分别极显著增加了61.63%、62.77%、43.81%，千粒重显著增加了7.61%，而穗粒数没有显著变化（图7-B），同时小麦增产了43.8%。

图 6 YC9菌剂对烟田土壤理化性质（A）以及烟草品质的影响（B）Fig. 6 Effects of YC9 bacterial agent on the physical and chemical properties of tobacco field soil（A）and tobacco yield and quality（B）

图 7 YC9菌剂对麦田土壤理化性质（A）以及小麦产量的影响（B）Fig. 7 Effect of YC9 bacterial agent on the physical and chemical properties of wheat field soil（A）and wheat yield（B）

3 讨论

近年来，我国在根际促生菌的研究上取得了许多成果，为微生物肥料的开发提供了菌种资源［26-27］。然而，大部分实验都只停留在筛选出来的细菌在寄主植物和实验室条件下的研究，生产的菌肥在实际生产的田间条件却并不如实验预期。因此，在当地大田条件下筛选开发高效菌株，研究促生菌的广谱性是极有必要的［28］。

本研究中获得的菌种为威兹曼芽胞杆菌（Bacillus wiedmannii）YC9，具有高效的产IAA、解钾能力、解有机、无机磷能力。威兹曼芽胞杆菌是Rachel A. Miller［29］在2016年发现的蜡样芽孢杆菌群中的一个新物种。陈元等［30］发现威兹曼芽胞杆菌 MSM可用于厌氧和好氧废水中Pd（II）的原位还原和修复，并有研究发现威兹曼芽胞杆菌 RS59-6具有在水分胁迫下促进玉米生长的潜力［31］。目前，对威兹曼芽胞杆菌作为菌肥使用研究较少。

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本研究筛选出的YC9在寄主植物烟草的盆栽、大田实验中都取得了较优的效果，接种YC9使得烟草根系更长更多，具有更大的表面积，根系生长指标与土壤IAA、有效磷钾均显著相关，IAA能够诱导植物不定根的形成［32］，同时磷元素能够促进生长调节物质分泌，改善植株营养状况，促进植株根系发育和地上部的生长［33］。

为探究YC9在非寄主植物与土壤中能否同样发挥较好的促生以及提高肥料利用率的效果，在河南省砂质潮土上进行了粮食作物冬小麦的大田验证实验。结果表明小麦土壤中养分含量有所增加，IAA、有效氮、速效钾、速效磷的含量分别提升了65.62%、7.52%、14.73%、10.64%。小麦的产量得到了提高，有效穗数、千粒重分别增加了61.63%、7.61%。已有许多研究表明部分促生菌株不仅能够在原本的生活环境中能够较好地生存，在其它环境下也能够正常生长发挥其促生作用。例如王欢等［34］从茶树根际筛选出的GD12菌株应用到白菜、空心菜、苋菜均有明显促生作用，植株的株高和鲜重均有显著增加。张芬芬等［35］从冬小麦根际分离出的ZX-2020菌株接种到玉米田中，玉米的幼苗根、茎长度和叶面积均有显著提高，分别增加54.49%、26.96%和36.06%。

PGPR提高了土壤中矿质元素的有效性，同时PGPR分泌的IAA促进了植物根系的生长，植物根系更为发达，有利于植物从土壤中汲取营养和水分，解除因营养胁迫导致植物大量合成的乙烯的抑制作用，从而补偿土壤中营养的缺乏，达到增产的目的［36-37］。河南大部分地区采用冬小麦/夏玉米轮作制度，YC9能否对玉米起到较好的促生效果，值得进一步研究。

4 结论

本研究筛选得到了一株兼具产IAA、解磷、解钾的威兹曼芽胞杆菌YC9，其在150 mL/250 mL装液量、pH7-9、以蛋白胨、葡萄糖分别为氮、碳源时生长状况以及产IAA能力最优；在烟草盆栽实验中，接菌处理显著提高了土壤速效磷、速效钾、IAA含量，烟草的株高、SPAD、全氮磷钾含量；在大田应用中能够有效地改善烟草的品质，并提高经济作物烟草和粮食作物小麦的产量，具有应用上的广谱性，是优良的菌株资源。