堆肥腐殖化：非生物学与生物学调控机制概述

解新宇 史明子 齐海石 吴迪 张旭 张椿浩 吴占海 魏自民

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨 150030）

堆肥化是易腐有机固废资源化、无害化处理的最广泛的方式，具有污染小、成本低及效率高的优点。堆肥化处理的终极目标是固定碳，并完成有机组分向腐殖质的转化，该过程又称为腐殖化进程。腐殖质作为腐殖化进程的主要副产物被众多研究者广泛研究［1-2］。腐殖酸是一类组成成分复杂的混合物质，其结构中包含碳水化合物、蛋白及脂类等，有的会与芳香族化合物相结合，一般包括一些被部分分解的木质素单体、单宁、多酚、醌及其他微生物次级代谢的聚酮类物质等［3］。腐殖质由于其具有较强的离子交换及络合能力，常常被用作环境修复剂去缓解有机、无机以及重金属污染［4］。

近年来，国内外对于腐殖质形成机制的研究起始于土壤，而堆肥可看作是土壤的快速腐殖化进程。有研究表明，堆肥物料的腐殖酸结构与土壤中腐殖酸相比较为“稚嫩”［5］。众多研究学者发现堆肥腐殖酸中含有甲氧基、醇羟基、羰基、羧基、酚羟基、醌基等众多含氧基团，并总结出许多腐殖酸结构模型，其中最具有代表性的是Stevenson的腐殖酸结构模型［6］。

通常，堆肥是有机物动态变化的过程，根据有机组分变化情况，一般将堆肥进程划分成两个阶段，即活化阶段和固化阶段。活化阶段是在微生物的参与下易被分解利用物质被微生物所消耗的过程，以满足微生物生长所需营养物来源。因此，堆肥过程微生物活动主要存在分解（即微生物分解有机物以维持基本代谢活动，此过程主要以有机物消耗矿化产生CO2为主）与合成（即参与到分解产物再转化过程，此过程主要以缩合形成腐殖酸为主）两种代谢途径［7］。两种途径共同作用，在堆肥进程中相辅相成，促进腐殖化进程的顺利进行。

1 腐殖化进程的非生物学途径调控机制

腐殖酸合成主要由化学反应所驱动，即多种腐殖酸前体彼此之间通过缩合或聚合的方式形成腐殖酸大分子。据报道，腐殖酸形成的非生物途径主要可归为四大类，即木质素-蛋白理论、多酚自缩合、多酚-蛋白途径以及美拉德反应［6］。木质素单位与氨基酸发生反应，形成腐殖质分子的核心，因此被称为木质素-蛋白质理论。然而随着对腐殖酸结构的进一步认知，发现腐殖酸核心骨架一般由一种芳香的含氮物质构成。这种含氮物质通常以蛋白质或氨基酸的形式存在，随后提出了类似于木质素-蛋白质理论的酚-蛋白质理论，以替代木质素-蛋白理论。多酚自缩合则是多酚化合物通过环断裂后再与其他酚类化合物进行缩合，从而形成腐殖酸大分子结构。美拉德反应是指还原糖与氨基酸以及蛋白质之间的多重复杂反应，又被称为非酶棕色化反应。还原糖的美拉德反应被认为是堆肥初期腐殖酸形成的主要原因［8］。在堆肥过程中，物料本身性质是非生物途径的决定因素，这是由于堆肥物料分解或水解可为非生物途径形成提供底物，但由于物料自身性质的复杂性，往往多种非生物途径共同作用于腐殖酸形成。

在堆肥进程中，微生物会与非生物途径竞争底物，导致非生物途径进展缓慢，致使大量的腐殖酸前体被微生物所消耗以满足其生长活动所需的营养消耗。因此，为加速堆肥中非生物途径进程，多种功能材料被添加以提升腐殖酸形成，加速非生物途径，从而减少腐殖酸前体物的浪费，减少碳排放，固定更多的碳元素。在众多功能材料中，二氧化锰由于其优良的催化性能、较强的离子交换能力以及氧化还原性，被广泛选择作为腐殖酸形成的非生物途径的催化剂［9］。二氧化锰可催化氨基酸与还原糖聚合成腐殖酸骨架，加速腐殖化进程［1］。与此同时，二氧化锰还可催化酚类化合物的环断裂，这有助于酚类化合物与其他前体物之间聚合或缩合反应的发生。非生物途径由于其在腐殖酸形成中的重要性越来越受到关注。

2 腐殖化进程的生物学途径调控机制

2.1 CO2的生物固定与腐殖化

目前，堆肥方面的研究很少将CO2的释放与堆肥腐殖酸的形成联系在一起，表面上看二者无明显关联，因为CO2主要产生于堆肥中、前期，而腐殖酸则主要形成于堆肥腐熟后期［10］。但是，综合腐殖酸形成的几种学说（木质素-氨基酸复合体为核心的木质素学说、酚氧化为醌后与含氮化合物缩合的多酚学说、微生物合成学说、以植物及微生物残体为核心的糖-胺缩合假说）可以发现，腐殖酸的核心部分为芳香族类物质，与其结合的氨基酸、糖类、含氮化合物等大都来源于碳代谢的中间产物［11］，由于这些代谢中间产物结构简单，大都在堆肥前期在微生物作用下快速分解，是堆肥CO2释放的主要来源［12］。因此，如果对有机物质代谢途径加以调控，抑制各类有机物代谢的三羧酸循环，在减少堆肥CO2释放的同时，又为堆肥腐熟后期腐殖酸的形成提供了原材料，达到有机废弃物堆肥资源化效率最大化［13］。

堆肥体系中腐殖酸的形成以及碳动态变化最终是微生物生长和活动的结果，土壤“微生物碳泵”（microbial carbon pump）可以解释微生物是如何介导堆肥过程进行碳转化的，说明微生物是如何在堆肥体系中发挥积极作用的。当堆体中易分解的小分子物质较多，稳定有机组分含量较少时，微生物代谢比较活跃，这时容易发生矿化，因为更多的能源用于进行细胞呼吸同时生成CO2，这不利于体系内的碳储存，导致腐殖酸生成量较少，此时启动效应（start-up effect）强于掩埋效应（entombing effect）。当堆肥体系中可以被微生物直接利用的有机组分逐渐减少，由微生物从胞内释放的水解酶开始水解胞外大分子复杂有机组分，从而为细胞生长提供所需能源，同时开始合成腐殖酸形成所需的前体物［14-15］，此时掩埋效应与启动效应达成平衡状态。如果只是简单降低所有微生物的代谢强度，其腐殖酸的合成也会受到抑制。因此，合理调控某些微生物代谢强度，使其向分解有机组分从而合成腐殖酸为主要方向发展，将对促进有机固废高质资源化有重要意义。

2.2 木质纤维素分解与腐殖化

木质纤维素组分是农业废弃物中较丰富的组分，主要由纤维素、半纤维素和木质素等三维网状结构组成［16］。纤维素是由葡萄糖单元通过β-1，4-糖苷键连接而成的线性大分子化合物，半纤维素是由己糖、戊糖和葡萄糖醛酸组成的杂多糖化合物［17］。由于半纤维素结构松散，结构非结晶化、高度分支，它的分解较纤维素容易。木质素是由苯丙烷亚基通过醚键或者碳碳键连接的高分子化合物，由于其结构高度复杂，酶水解极其困难。据报道，木质素存在于纤维素和半纤维素表面，阻碍了纤维素和半纤维素酶的与外界的接触，降低了纤维素和半纤维素的生物转化［18］。因此，木质素结构的打散对于整个木质纤维素的利用及转化极为重要。

在堆肥过程中，木质纤维素的分解需要纤维素酶、半纤维素酶及木质素酶的参与。其中，纤维素的水解需要3种酶的参与，包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖甘酶［19］。它们共同作用在纤维素表面，释放纤维糊精、纤维二糖及葡萄糖，其中β-葡萄糖甘酶水解纤维二糖的糖苷键，产生大量的葡萄糖。同样，半纤维素酶根据主链及侧链的结构分为主链分解酶和侧链分解，生成的小分子阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖等单糖都能进入细胞内进行糖酵解和三羧酸循环，彻底矿化形成CO2和H2O［10］。因此，在堆肥过程中，有效控制小分子单糖的产生，促使纤维二糖、木二糖向腐殖酸转化。此外，木质素过氧化物酶、漆酶、锰过氧化物酶及纤维二糖脱氢酶是目前研究较热的木质素酶，主要对木质素侧链残基进行氧化并分解，形成单苯环或者多苯环化合物。同样，上述中间代谢产物也可作为腐殖酸前体与其它前体聚合向腐殖酸转化。堆肥进程中细菌主要在初级代谢过程中合成木质素酶，而真菌主要在次生代谢过程中产生木质素酶分解木质素［20］。因此，根据微生物生长特征进行合理的控制微生物的活性，增加微生物产酶量，并对木质纤维素进行分解如图1所示［21］。此外，影响木质纤维素酶的合成因素有很多［20］，例如碳源、氮源、微量元素、金属离子、酶促诱导物及表面活性剂，这些都是考虑的关键因素，找到酶促活性的关键影响因素对于木质纤维素酶的产生有重要的作用，能够快速分解木质纤维素组分，这对于腐殖酸的形成提供了支撑。

图1 堆肥过程机理图Fig. 1 Diagram of the mechanism of the composting

在堆肥过程中，木质纤维素组分分解并产生碳水化合物、氨基酸、苯环化合物，它们不仅作为腐殖酸形成的骨架，而且可以缩合形成腐殖酸。美拉德反应学说主要强调堆肥中木质纤维素分解的多糖与氨基酸进行缩合。当堆肥进行到高温期末时，木质纤维素分解多糖较多，可添加富含氨基酸、蛋白质等含量高的有机废弃物进行缩合，促进腐殖酸合成。微生物形成假说主要强调了微生物在腐殖酸形成过程中的作用。微生物在堆肥过程中扮演着多方位的角色，不仅作为分解者分解大分子聚合物，而且作为生产者将分解的小分子化合物重新缩合形成腐殖酸类物质［22］。因此，木质纤维素分解产物均是腐殖酸形成的骨架及底物。在合适的时期，添加富含蛋白的有机废弃物，增加木质纤维素酶的活性通过控制关键因素对于木质纤维素废弃物向腐殖酸转化提供一个必要的选择。

2.3 反硝化过程与腐殖化

在微生物的参与下，反硝化作用利用硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、氧化氮还原酶以及氧化亚氮还原酶，将硝酸盐、亚硝酸盐逐级还原，最终形成一氧化氮、氧化亚氮或氮气并释放出来［23］。由于反硝化作用是造成氮损失的重要原因，同时释放臭氧层破坏者——温室气体，因此在环境及农业领域一直作为研究焦点［24］。在好氧堆肥过程中，反硝化作用受到的关注相对较少，其重要性往往容易被忽视，主要由于其被认为是在严格的厌氧条件下才能存在。近年来，已经证实反硝化作用存在于好氧堆肥中，尤其是在含氮素丰富，含水率高的有机固体废弃物中［25-26］。在堆肥过程中，由于堆肥原料被压实和堆积，或堆肥颗粒半径较长，形成堆肥团聚体，阻碍氧气的进入，使堆肥内部空气渗透性和流动性下降，导致局部厌氧，从而发生反硝化作用［27］。另外，固有观念认为反硝化微生物大多为厌氧菌，只有在严格的厌氧条件下才能启动反硝化作用［28］。实际上，反硝化作用在好氧条件下也可以发生，许多反硝化微生物已被证实能够进行好氧呼吸［29-30］。

在堆肥过程中，考虑到具有芳香分解能力的反硝化微生物可能会对堆肥芳香族类化合物腐殖酸的形成产生潜在的危害［26，31］。基于此，有研究发现，若堆肥中反硝化作用的电子受体硝酸盐含量过高同样可有效地促进反硝化作用，并导致芳香族类化合物腐殖酸含量下降。当硝酸盐含量较高时，参与芳香族类化合物腐殖酸前体（邻苯二酚、酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）分解途径相关物种显著富集。例如，Paracoccus为典型的反硝化微生物，同时是编码芳香氨基酸转氨酶的物种来源，并参与了酪氨酸的分解，其在硝酸盐含量高的情况下，Paracoccus丰度显著升高。反硝化微生物Pseudomonas代谢功能更具多样性，可以是编码儿茶酚1，2-双加氧酶、芳香族氨基酸转氨酶、色氨酸2，3-双加氧酶、苯乙酰辅酶A连接酶的物种来源［32-33］。此外，已证实微生境可以驱动具有芳香生物分解功能的反硝化微生物与腐殖酸的相互作用。添加硝酸盐可以显著影响微生境包括细菌群落多样性及有机质、氨含量等环境因子。微生境的改变进一步驱动了具有芳香生物分解能力的反硝化微生物。而多数芳香生物分解能力的反硝化功能微生物间呈现合作关系。总体而言，反硝化作用在堆肥中可以刺激具有芳香化合物分解能力的功能微生物代谢活性，导致芳香族化合物前体的裂解，最终影响的芳香族化合物腐殖酸的合成与积累。值得一提的是，研究发现由于不同堆肥原料特性差异较大，不同物料堆肥过程中均具有反硝化微生物，但丰度及多样性各不相同［26］。反硝化微生物在园林垃圾中总体丰度在堆肥过程中呈下降趋势，但在鸡粪和秸秆垃圾中，反硝化微生物丰度总体丰度呈上升趋势。且各物料主导的反硝化微生物具有差异性，如鸡粪堆肥中主导反硝化作用的微生物为Pseudomonas、Sphingomonas及Pusillimonas。而Acinetobacter、Sphingomonas、Ochrobactrum在园林垃圾中丰度较高［14］。因此，反硝化作用与芳香族类化合物腐殖酸生物稳定性关系在各堆肥物料中需要更进一步研究及验证。

2.4 堆肥前体物与腐殖化

前体物对腐殖酸的相对分子质量和结构复杂程度将有一定的影响。通过相关性分析发现酚类、羧基、氨基酸、还原糖与腐殖酸呈现明显负相关关系［34］，所以研究者认为它们是合成腐殖酸的重要前体物。酚类主要来源与木质素类物质，或者由微生物胞内合成，同时酚类将在多酚氧化酶作用下生成醌基化合物，但在有氧条件下，酚羟基不稳定，作为腐殖酸的芳香族骨架通过多酚-蛋白途径聚合促进其形成［30］。氨基酸和还原糖也是细菌代谢所需的能量和碳源，氨基酸和还原糖的生成量越大，对促进腐殖酸合成的作用越明显［35］。因此，如果微生物利用了较多的氨基酸和还原糖，将会造成腐殖酸生成量的减少，降低堆肥品质。此外，有研究发现，在多酚缺失或者不足的环境条件下，还原糖与氨基酸同样能够参与合成腐殖酸，这证明了氨基酸、还原糖对合成腐殖酸起到重要作用。因此，适度调控腐殖酸前体物也可以达到控制腐殖化进程的目的。

3 总结和展望

堆肥作为农业有机固体废弃物处理的可持续技术手段，科研工作者一直致力于不断提升堆肥腐殖化程度，增加腐殖质产量，且此项工作已经取得了较大突破。从非生物学及生物学途径出发，针对堆肥不同生境，掌握堆肥腐殖化调控策略，为今后的研究奠定了理论与方法学基础。非生物学合成腐殖质的研究中，从4种腐殖质合成途径出发，针对木质素-蛋白理论、多酚自缩合、多酚-蛋白途径以及美拉德反应合成框架，结合现代化学合成过程，已经演变出人工腐殖质合成技术。研究者利用焦磷酸钠碱液及氢氧化钠溶液从褐煤中提取腐殖质，是现今较完善的化学合成腐殖质的方法，但褐煤属于不可再生资源，大量的消耗也会给地球环境生态带来较大压力［36-37］。因此，研究者进一步开发出利用酸碱水热技术促进废弃物腐殖质的转化技术，先后从秸秆、污泥等废弃物中提取腐殖质，该技术提取出的人造腐殖质中含有较多的芳烃及长链脂肪烃结构，且利用该法提取的腐殖质在结构和形态上与土壤中天然合成的腐殖质具有较高的相似性［38］。由此，水热提取腐殖质以其成本低、易规模化等优势，具有广泛的应用前景，相信未来有望实现广泛推广。在生物学腐殖质合成层面，随着组学、分子标记、微流控等技术的发展，结合新兴统计学及生物信息学手段，首先明确促腐殖质合成功能微生物组与组外微生物群落之间及功能微生物组内相关微生物之间的相互关系，捕获必要的腐殖质生成途径生态学原理及关键限制因子（微生境与微生物之间或微生物与微生物之间），以分子生态学模型精确预测微生物组腐殖质生成量。其次，以上述过程为基础，通过外加促腐材料及生态群落改造的形式优化微生物群落生态位，增加腐殖质相关途径合成通量，从根本上增加腐殖质合成总量。另外，也可通过大数据分析推进不可培养功能微生物组的分选与价值提升，从微流控细胞分选技术出发，在复杂样品中自动分选稳定同位素标记的细胞，进而结合组学技术进行实验室培养，开发完成一整套腐殖质合成不可培养功能微生物组组学原位工具，以此将腐殖质高效合成功能引入合成腐殖质的原生环境，达到腐殖质在堆肥过程中的高产。综上所述，随着科学技术水平的不断提高，相信未来堆肥腐殖化将会更加现代化、智能化，促进非生物及生物学途径腐殖化进程的高质资源化进行。