柔肝颗粒的质量标准提高

董玉娟，李素梅，周敏

广东省第二中医院，广东 广州 510095

柔肝方由钩藤、天麻、白芍、川牛膝等七味中药组方而成，是广东省第二中医院心血管科专家多年来总结的临床验方。本方具有平肝柔肝功效，临床研究表明可明显改善高血压肝阳上亢症患者的头痛、头晕、头胀等不适症状，且可有效降低患者血压、血浆肾素及血管紧张素Ⅱ水平［1-2］。为了减少中药煎煮烦琐，保证用药质量，推进中医药现代化，已将其开发为使用方便的颗粒剂。本课题采用薄层色谱法与高效液相色谱法二者结合来为保证柔肝颗粒质量提供方法学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

微量分析天平（Mettler-Toledo XPE26）；电子分析天平（Mettler-Toledo ME55）；电热数恒温水浴锅（HH-2 LICHEN）；数控超声波清洗机（KQ-50E昆山）；薄层自动点样器（CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER 4）；高效液相色谱仪（Agilent 1100）；Agilent Extend-C18 液相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；自动纯水机（MilliPore Advantage A10）。

1.2 药品与试剂

芍药苷对照品（批号：110736-201640，纯度为95.2%）；钩藤对照药材（批号：121190-201204）；白芍对照药材（批号：120905-201610）；川牛膝对照药材（批号：121065-201406）均购于中国食品药品检定研究院。柔肝颗粒（批号：20200506、20200507、20200508，规格：每袋装6 g，每袋相当于饮片23.35 g）来源于广东省第二中医院制剂室。柔肝颗粒阴性对照所用药材均为广州至信药业股份有限公司购买并经鉴定符合《中国药典》中各药材标准。

2 方法与结果

2.1 TLC 的定性鉴别

2.1.1 钩藤（1）供试品溶液制备：三个批号样品分别取样2 g，研钵研细，加入2 mL 浓氨试液，样品浸泡30 min 后加入50 mL 三氯甲烷，置水浴锅中加热回流2 h，取20 mL 滤液蒸干，残渣加1 mL 甲醇溶解残渣即得。（2）对照药材溶液制备：取钩藤对照药材1 g，同（1）法制备。（3）阴性对照溶液制备：按柔肝颗粒处方比例，取除钩藤以外六味中药参照工艺制法进行水煮、浓缩、干燥等步骤制得阴性对照溶液，取样2 g，同（1）法制备。自动点样器精密吸取（1）（2）（3）溶液点于硅胶G 薄层板上，展开缸里展开，展开剂：石油醚（60～90 ℃）-丙酮（6∶4），显色剂：改良碘化铋钾试液。由图1 可见：三个批号样品的色谱图基本一致，表明本制剂生产工艺稳定，且供试品的色谱图与对照药材的色谱图在相同位置上有相同的黄色斑点，该黄色斑点在阴性对照色谱图中未出现。

图1 钩藤的薄层色谱图

2.1.2 川牛膝（1）供试品溶液制备：三个批号样品分别取样4 g，研钵研细后置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，置于数控超声波清洗机中进行超声处理30 min，取滤液蒸干，残渣加10 mL 水溶解，水溶液用50 mL 水饱和正丁醇分次进行萃取，得正丁醇萃取液，用氨试液分次洗涤，弃去，蒸干正丁醇液并加1 mL 甲醇溶解即得。（2）对照药材溶液制备：取1 g 川牛膝对照药材，同（1）法制备。（3）阴性对照溶液制备：按柔肝颗粒处方比例，取除川牛膝以外六味中药，参照工艺制法进行水煮、浓缩、干燥等步骤制得阴性对照溶液，取样4 g，同（1）法制备。自动点样器精密吸取（1）（2）（3）溶液点于硅胶G薄层板上，放置于展开缸中展开，展开剂：三氯甲烷-甲醇-甲酸（9∶1∶0.5），显色剂：1%对二甲氨基苯甲醛10%硫酸乙醇溶液，60 ℃加热至斑点显色清晰，放置于紫外光灯365 nm 下进行检视。结果显示：三个批号样品的色谱图基本一致，且在与对照药材色谱图中相同位置上均有相同的颜色荧光斑点，该荧光斑点在阴性对照色谱图中未出现。见图2。

图2 川牛膝的薄层色谱图

2.1.3 白芍（1）供试品溶液制备：三个批号样品分别取样1 g，研钵研细，加入25 mL 乙醇进行超声处理30 min，取滤液蒸干，加1 mL 乙醇溶解残渣即得。（2）对照药材溶液制备：取白芍对照药材0.5 g，同（1）法制备。（3）阴性对照溶液制备：按柔肝颗粒处方比例，取除白芍以外六味中药参照工艺制法进行水煮、浓缩、干燥等步骤制得阴性对照溶液，取样1 g，同（1）法制备。自动点样器精密吸取（1）（2）（3）溶液点于硅胶G 薄层板上进行展开，展开剂：三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（8∶4∶1），氨蒸气预饱和，显色剂：5%香草醛硫酸溶液加热至斑点显色清晰。结果显示：三个批号样品的色谱图基本一致，且均有相同的蓝紫色斑点与对照药材色谱图的对应位置一致，在阴性对照色谱图中未见该蓝紫色斑点。见图3。

图3 白芍的薄层色谱图

2.2 高效液相色谱的定量分析

2.2.1 溶液的制备供试品溶液的制备：取已研细的柔肝颗粒样品约0.5 g，置于50 mL 具塞锥形瓶中精密称定，精密加入25 mL 稀乙醇，称定重量，超声处理30 min 后，取出放冷，待其冷却后再称重，用稀乙醇补重后取续滤液进行检测。对照品储备液的制备：精密称定芍药苷对照品2.647 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度摇匀制成100.8 μg/mL 的溶液。阴性对照溶液的制备：按柔肝颗粒处方比例，取除白芍以外六味中药参照工艺制法进行水煮、浓缩、干燥等步骤制得阴性对照，取已研细的阴性对照0.5 g，精密称定，同法制得。

2.2.2 色谱条件液相色谱柱：Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），检测波长：230 nm，柱温：25 ℃，流速：1 mL/min，进样量：10 μL。

2.2.3 测定法分别精密吸取上述“2.2.1”项中的三种溶液注入高效液相色谱仪中进行测定，在供试品溶液的HPLC 色谱图中可找到与对照品芍药苷一致的色谱峰，且在阴性对照的色谱图中未出现该色谱峰。见图4。

图4 高效液相色谱图：A.芍药苷对照品；B.供试品；C.阴性样品

2.2.4 方法学考察（1）线性关系考察：取芍药苷对照品溶液（100.8 μg/mL）加甲醇稀释制成分别为10.08 μg/mL、20.16 μg/mL、30.24 μg/mL、50.40 μg/mL、70.56 μg/mL、100.80 μg/mL 6 种不同浓度的溶液。精密吸取6 种不同浓度的对照品溶液各10 μL 进行检测，横坐标为芍药苷进样量，纵坐标为芍药苷峰面积，得回归方程：Y=3 132.8X+51.719（r=0.999 9），表明在0.100 8～1.008 μg 范围内芍药苷呈良好线性回归。（2）精密度试验：同一供试品溶液连续进样检测6 次，计算6 次所得芍药苷峰面积的RSD 为0.46%，表明所用HPLC 仪器精密度良好。（3）重复性试验：分别精密称取6 份供试品，制备供试品溶液，进样检测，6 份供试品溶液中芍药苷含量的RSD 计算结果为0.58%，表明所建立的HPLC 含量检测方法重现性良好。（4）稳定性试验：同一供试品溶液分别于0、2、4、8、12 h 进样检测，5 次所得芍药苷峰面积的RSD 计算结果为0.21%，表明在12 h 内样品溶液稳定，保证检测结果可靠。（5）加样回收试验：精密称取已知芍药苷含量的供试品9 份，分别按80%、100%、120%加入芍药苷对照品各3 份，制备供试品溶液，检测，计算得回收率为98.56%，RSD 为1.04%。

2.2.5 供试品含量测定分别称取3 个批号（20200506、20200507、20200508）柔肝颗粒样品0.5 g，精密称定，各2 份，制备供试品溶液，计算得柔肝颗粒中芍药苷的含量分别为：4.972 6 mg/g、4.753 7 mg/g、4.831 7 mg/g，平均含量为4.852 7 mg/g。以平均含量80%设限，拟定每袋制剂中芍药苷的含量不少于23.29 mg。

3 讨论

柔肝颗粒由钩藤、天麻、白芍、川牛膝、桑寄生、杜仲、茯苓七味中药经水提、浓缩、干燥、制粒等步骤制备而成。方中钩藤长于清肝热，天麻息风止痉，平抑肝阳，二者用以为君药而达平肝祛风功效；白芍养血柔肝、川牛膝味苦善泄降而引血下行，二者相配以为臣，火气无从上扰，养阴泻火相得益彰；桑寄生、杜仲补肝肾以固本，茯苓健脾利水以安中焦脾胃，三药共奏柔肝益肾，宁心安神之功，为佐药。目前柔肝颗粒只根据《中国药典》颗粒剂检查项下的粒度、水分、溶化性等进行质量控制，无针对本方所含的药材与有效成分进行检测。由于缺乏系统化标准化的质量评价且检测指标较少、检测手段较低，中药制剂质量良莠不齐，质量可控性较差难以保证有效性，临床使用反馈疗效不稳定为医院制剂存在的主要问题之一［3-5］。为了有效地控制柔肝颗粒制剂的质量，本试验采用TLC 薄层色谱与HPLC含量测定来制定质量标准检测方法。

本试验采用TLC 定性鉴别方法进行鉴别君药和臣药，结果提示天麻色谱图阴性有干扰；钩藤、白芍的色谱方法均在《中国药典》的基础上进行调整，分离度较好、无拖尾、斑点清晰、阴性无干扰；川牛膝参照《中国药典》方法进行鉴别时，斑点分离度差，拖尾严重，在参考文献［6］的基础上再做调整后，结果理想。钩藤、白芍、川牛膝的鉴别方法简便、可操作性强，故选择上述药材作为本制剂的快速定性鉴别方法的指标。在建立含量测定方法时，应选择君药为含量测定指标，在参考《中国药典》与文献［7-9］对钩藤碱与天麻素进行实验时，阴性均有干扰，故选择臣药白芍进行研究。现代研究表明［10-11］白芍具有抗炎镇痛、保肝、扩张血管、改善心肌肥厚等作用，其药理作用与柔肝颗粒的功效具有显著相关性，故选择芍药苷为含量检测指标，在建立含量测定方法时，同时对流动相、色谱柱、流速、柱温等进行了考察，在综合考虑仪器的耐用性、色谱峰的分离度、色谱峰峰形、分析时间等因素后，明确了芍药苷的检测方法，所建立的方法准确、可靠，重现性好。

本研究所建立的薄层色谱和含量测定方法能对柔肝颗粒的质量进行有效地控制，可为保证柔肝颗粒的临床应用和进一步研究提供理论基础。