EZH2在AML1/ETO阳性急性髓系白血病中的表达及临床意义

陈荣华 王艳梅 石瑞平

郑州人民医院血液内科，河南郑州 450002

急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一类以发热、贫血等症状为主要表现的恶性克隆性血液系统疾病，病情进展迅速，确诊后若不经特殊治疗，数天后即可死亡，经积极规范化治疗可延长患者生存期[1］。AML1/ETO融合基因阳性是AML的一种独立亚型，虽然其预后相对较好，但部分患者治疗后易复发，不利于其长期存活[2］。因此，寻找与AML1/ETO阳性AML预后相关的生物标志物，对减少复发及提高患者长期存活率非常重要。果蝇zeste基因增强子人类同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）是PcG基因家族的重要成员之一，其异常表达在多种血液系统肿瘤中扮演着重要角色[3］。已有研究证实，EZH2与AML发病及患者预后有关[4］。但EZH2在AML1/ETO阳性AML发病中的作用及与患者预后的关系尚不明确。因此，本研究着重探讨EZH2表达与AML1/ETO阳性AML患者临床资料及无复发生存、总生存的关系，旨在为延长AML1/ETO阳性AML患者生存期提供帮助。

1 资料与方法

1.1 研究对象

选取2015年1月至2018年1月郑州人民医院血液内科收治的AML1/ETO阳性AML患者40例作为AML1/ETO阳性组，另选取同期接受治疗的AML1/ETO阴性AML患者40例作为对照组。纳入标准：（1）均经骨髓细胞形态学、免疫学等检查确诊[5］；（2）均为初诊、初治患者；（3）均自愿签署知情同意书。排除标准：（1）合并其他血液系统疾病；（2）临床资料不全；（3）年龄<18岁；（4）肝肾功能障碍。本研究经本院医学伦理委员会批准。AML1/ETO阳性组男25例，女15例；年龄18~75岁，中位年龄37岁；FAB分型：M1 9例，M2 18例，M4 9例，M5 4例。对照组男26例，女14例；年龄18~75岁，中位年龄38岁；FAB分型：M1 7例，M2 17例，M4 10例，M5 6例。AML1/ETO阳性组和对照组性别、年龄等相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

1.2 方法

1.2.1 骨髓单个核细胞（bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs）分离 常规骨髓穿刺抽取骨髓液，每例患者4 mL，肝素抗凝处理，采用人骨髓淋巴细胞分离液（购自北京索莱宝科技有限公司）分离BM-MNCs，磷酸缓冲盐溶液洗涤2次后保存（−80℃）备用。

1.2.2 EZH2 mRNA表达检测 采用实时荧光定量聚合酶链反应（fluorescence quantitive polymerase chain reaction，FQ-PCR）检 测 患 者BM-MNCs中EZH2 mRNA表达水平。采用TRIzoI试剂盒（购自北京利维宁生物科技有限公司）提取BM-MNCs总RNA，取A260/280值在1.8~2.0间的RNA样本，反转录得cDNA，进行PCR反应。EZH2正向引物：5'-GACCCTGACCTCTGTCTTACTT-3'，反 向引 物：5'-GATGGTGCCAGGCAATAGATG-3'；内参β-actin正向引物：5'-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3'，反向引物：5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3'，均由上海英潍捷基公司设计并合成。反应条件为：94℃、5 min，94℃、15 s，60℃、1 min，40个循环。每个标本设置3个复孔，用2-∆∆Ct法计算EZH2 mRNA的相对表达量。根据EZH2 mRNA相对表达量将AML1/ETO阳性AML患者分为低表达组（<均值者，n=19）和高表达组（≥均值者，n=21）。

1.2.3 首次诱导治疗 患者均接受IA方案治疗，具体为：去甲氧柔红霉素（生产厂家：瀚晖制药有限公司，批准文号：国药准字H20050145，规格：5 mg），8~10 mg/m2，第1~3 d；阿糖胞苷（生产厂家：辅仁药业集团熙德隆肿瘤药品有限公司，批准文号：国 药 准 字H20074232，规格：50 mg），75~100 mg/m2，第1~7 d。诱导治疗2个疗程，诱导治疗达完全缓解后行巩固治疗。

1.2.4 随访 通过电话或门诊对AML1/ETO阳性AML患者随访3年，随访截止日期为2021年1月31日。随访结束后统计无复发生存和总生存情况，并计算3年无复发生存率和总生存率。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件处理数据。计量资料以均数±标准差（xˉ±s）描述，比较采用独立样本t检验；EZH2 mRNA表达水平与白细胞计数、外周血幼稚细胞比例的相关性采用Pearson相关分析；采用Kaplan-Meier法分析EZH2 mRNA表达水平与AML1/ETO阳性AML患者预后的关系，行Log-rank检验；影响AML1/ETO阳性AML患者无复发生存和总生存的危险因素采用Cox回归分析。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 两组患者BM-MNCs中EZH2 mRNA表达比较

对照组和AML1/ETO阳性组患者BM-MNCs中EZH2 mRNA表达水平分别为（1.00±0.26）、（1.75±0.54）。AML1/ETO阳性组患者BM-MNCs中EZH2 mRNA表达水平明显高于对照组（t=7.914，P<0.001），差异有统计学意义。

2.2 EZH2 mRNA表达水平与AML1/ETO阳性AML患者临床资料的关系

BM-MNCs中EZH2 mRNA表达水平与AML1/ETO阳性AML患者性别、年龄、FAB分型、乳酸脱氢酶及骨髓中幼稚细胞比例无关（P>0.05），与患者白细胞计数、外周血幼稚细胞比例、髓外浸润、染色体核型预后分层及首次诱导治疗后疗效呈线性相关（P<0.05）。详见表1。

表1 EZH2 mRNA表达水平与AML1/ETO阳性AML患者临床资料的关系（ ±s）

表1 EZH2 mRNA表达水平与AML1/ETO阳性AML患者临床资料的关系（ ±s）

临床资料性别男女年龄（岁）<37≥37 FAB分型M1+M2 M4+M5白细胞计数（×109/L）<40≥40乳酸脱氢酶正常升高骨髓中幼稚细胞比例<60%≥60%外周血幼稚细胞比例<60%≥60%髓外浸润无有染色体核型预后分层良好中、高危首次诱导治疗后疗效完全缓解部分缓解+未缓解n 25 15 22 18 27 13 19 21 9 31 17 23 16 24 14 26 11 29 28 12 EZH2 mRNA 1.80±0.51 1.71±0.44 1.79±0.50 1.68±0.43 1.62±0.41 1.84±0.49 1.55±0.40 1.90±0.52 1.67±0.43 1.81±0.47 1.64±0.42 1.83±0.46 1.53±0.39 1.96±0.51 1.54±0.40 2.01±0.52 1.59±0.42 1.94±0.50 1.48±0.39 1.97±0.53 t 0.568 0.736 1.492 2.367 0.801 1.339 2.857 2.940 2.058 3.263 P 0.574 0.466 0.144 0.023 0.428 0.188 0.007 0.006 0.046 0.002

2.3 EZH2 mRNA表达水平与白细胞计数、外周血幼稚细胞比例的相关性

AML1/ETO阳性AML患者EZH2 mRNA表达水平与白细胞计数（r=0.609，P<0.001）、外周血幼稚细胞比例（r=0.502，P<0.001）呈正相关，详见图1。

图1 EZH2 mRNA表达水平与白细胞计数、外周血幼稚细胞比例的相关性

2.4 EZH2 mRNA表达水平与AML1/ETO阳性AML患者预后的关系

40例AML1/ETO阳性AML患者随访3年内无复发生存21例，总生存25例，死亡15例，3年无复发生存率为52.50%（21/40），3年总生存率为62.50%（25/40）。Kaplan-Meier曲线显示，EZH2 mRNA低表达组3年无复发生存率（63.16%）高于EZH2 mRNA高表达组（42.86%），但差异无统计学意义（χ2=1.648，P=0.199）；3年总生存率（78.95%）明显高于EZH2 mRNA高表达组（47.62%），差异有统计学意义（χ2=4.177，P=0.041）。详见图2。

图2 EZH2 mRNA表达水平与AML1/ETO阳性AML患者预后的关系

2.5 影响AML1/ETO阳性AML患者无复发生存的危险因素分析

Cox回归分析显示，首次诱导治疗后疗效、EZH2 mRNA表达等是影响AML1/ETO阳性AML患者无复发生存的独立危险因素（P<0.05）。详见表2。

表2 影响AML1/ETO阳性AML患者无复发生存的危险因素分析

2.6 影响AML1/ETO阳性AML患者总生存的危险因素分析

Cox回归分析显示，首次诱导治疗后疗效、EZH2 mRNA表达等是影响AML1/ETO阳性AML患者总生存的独立危险因素（P<0.05）。详见表3。

表3 影响AML1/ETO阳性AML患者总生存的危险因素分析

3 讨论

AML最常见的遗传学改变为t（8；21）（q22；q22）染色体易位，其易位产生AML1/ETO融合基因，多存在于FAB分型中的M2，并可形成一种具有致癌活性的融合蛋白，在AML发病中起重要作用[6］。其中AML1作为一种转录活化因子，能特异性结合DNA的结合蛋白，并可通过激活或抑制髓系过氧化物酶、白细胞介素-3等靶基因的转录活化，在造血细胞生长、发育过程中发挥关键作用；而ETO是一种含有锌指结构的转录因子，可通过与果蝇Nervy基因同源的功能域2或4的相互作用稳定其二聚体状态，参与血细胞的早期分化[7］。研究发现，AML1/ETO阳性是预后较好的异常染色体之一，但由于其异质性极大，AML1/ETO阳性AML患者复发率较高，严重影响预后[8］。因此，找寻能够早期评估AML1/ETO阳性AML患者复发和总生存的生物标志物，具有一定的临床意义。

EZH2基因位于7q35染色体，具有高度保守的SET、富含半胱氨酸区等结构域，可通过催化组蛋白H3第27位赖氨酸三甲基化而抑制相关靶基因的表达，参与多种恶性血液病的发生、发展[9］。侯越等[10］研究报道，多发性骨髓瘤患者骨髓中EZH2 mRNA和蛋白均高表达，其高表达与多发性骨髓瘤发病及复发有关。邓玉洁等[11］研究发现，EZH2低表达的弥漫大B细胞淋巴瘤患者远期生存率较高。李乾鹏等[12］研究报道，BM-MNCs中EZH2 mRNA高表达参与AML发病。为探讨EZH2与AML1/ETO阳性AML发生、发展的关系，本研究采用FQ-PCR法检测BM-MNCs中EZH2 mRNA表达水平，结果发现AML1/ETO阳性组患者BM-MNCs中EZH2 mRNA表达水平较对照组高，提示EZH2 mRNA表达升高可能与AML1/ETO阳性AML发生有一定关联。本研究还发现，BM-MNCs中EZH2 mRNA表达水平与AML1/ETO阳性AML患者白细胞计数、外周血幼稚细胞比例、髓外浸润、染色体核型预后分层及首次诱导治疗后疗效有关，且Pearson相关分析发现其与白细胞计数、外周血幼稚细胞比例呈正相关，进一步提示EZH2 mRNA表达可能在AML1/ETO阳性AML发病中起一定作用。

Dou等[13］研究发现，EZH1高表达的AML1/ETO阳性AML患者较EZH1低表达的患者表现出更差的总生存期。本研究Kaplan-Meier曲线也得到相似的结果，即EZH2 mRNA低表达组3年无复发生存率、3年总生存率均高于EZH2 mRNA高表达组，提示EZH2 mRNA表达可能与AML1/ETO阳性AML患者预后有关。Cox回归分析显示，EZH2 mRNA表达是影响AML1/ETO阳性AML患者无复发生存、总生存的独立危险因素，提示检测EZH2 mRNA表达可能有助于评估AML1/ETO阳性AML患者预后情况。同时还需关注首次诱导治疗后疗效对AML1/ETO阳性AML患者预后的影响。但是影响AML1/ETO阳性AML患者预后的因素较多，为验证结果准确性，今后需增加样本量继续分析。

综上所述，AML1/ETO阳性AML患者EZH2 mRNA表达水平与白细胞计数、外周血幼稚细胞比例呈正相关，且EZH2 mRNA高表达患者预后较低表达患者差，可能成为AML1/ETO阳性AML患者预后的判断指标。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突