基于多组学数据研究奥卡西平抗痫机制

徐 雯 吕玉芹 高 蕾 张敬军

山东第一医科大学第二附属医院，山东泰安 271000

癫痫是神经系统常见病，病因复杂，发病机制尚未完全阐明[1］。奥卡西平是卡马西平的10-酮类似物，通过抑制持续、高频、重复神经元放电，减少突触传递兴奋发挥抗痫作用[2］。70%～80%的癫痫患者由一个或多个遗传因素导致，其余20%～30%由后天因素引起，如中风、肿瘤或头部损伤[4］。基因组技术和生物信息学的进步促进了全基因组范围内基因变异的发现[3］，本研究从遗传学角度结合药物靶点信息，利用生物信息学如单细胞测序、全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）等 研 究奥卡西平与癫痫基因的相关性，进一步明确奥卡西平抗癫痫机制，为其临床应用及实验研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据库与软件

DrugBank数据库（http：//www.drugbank.ca/）；DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）；MAGMA软件（https：//ctglab.nl/software/magma）；GWAS数据库；EWCE包。

1.2 利用DrugBank获取奥卡西平的靶基因

DrugBank是世界上使用最广泛的参考药物资源之一，涵盖药物靶点、药物作用和药物相互作用信息[5-6］。进入DrugBank，输入关键词Oxcarbazepine进行检索，药物靶点包括四个方面：Targets、Enzymes、Carriers、Transporters，展开靶点信息详细页面，下载、存储并整理数据。

1.3 利用DAVID数据库进行奥卡西平25个靶基因的ID转换

DAVID是一个整合了生物学数据和分析工具的生物信息数据库，为大规模的基因或蛋白提供系统的功能注释信息。DAVID可将大型基因列表压缩为基因功能组，在基因/蛋白质标识符之间进行转换，可视化多基因对多术语的关系，将不同种类的术语聚集到组中，搜索相关基因或术语，动态查看生物路径列表中的基因[7］。进入DAVID网站（https：//david.ncifcrf.gov/），选择shortcut to DAVID Tools进入Gene ID conversion界面，upload界面输入奥卡西平基因列表，Select Identifier列表下选择Official-Gene-Symbol，List Type处选择Gene List，然后点击Submit List；List界面中List manager选择List 1，Use，Species选择Homo Sapiens，点击select species；Background界面选择Homo Sapiens，Use，Successfully submitted gene list；转换成基因类型ENTREZ-GENE-ID（Default），submit to conversion Tool，点击Download File，结果保存于文本文档中，命名为set.txt文件。

1.4 奥卡西平靶基因与癫痫GWAS数据的关联分析

基于GWAS数据，将全基因组中的单核苷酸多态性（single nucleotide ploymorphism，SNP）作为分子遗传标记，进行全基因组对照分析或相关性研究，利用MAGMA软件将药物靶点与疾病靶点进行映射，获得奥卡西平治疗癫痫的潜在作用靶点。应用基因集分析方法，计算P值（P<0.05，差异具有统计学意义），证明奥卡西平靶基因在GWAS层面与癫痫致病基因存在关联。

1.5 奥卡西平靶基因与稀有变异癫痫危险基因的遗传重叠

为研究奥卡西平靶点与稀有变异的癫痫危险基因是否存在遗传重叠，对稀有变异进行了外显子分析[8］，使用102个单基因癫痫基因作为已知疾病基因的集合，这些基因来源于1 165例患者和3 877名对照者的外显子测序[9］。以人类全基因组（约20 000个基因）为背景，进行Fisher精确检验，分析奥卡西平靶基因与单基因癫痫基因重叠的意义。检验水准α=0.05。

1.6 奥卡西平靶基因表达加权细胞型富集分析

利用表达加权细胞类型富集（EWCE）方法探索奥卡西平靶基因是否能定位于特定脑细胞类型，使用单细胞转录组数据集，比较输入基因列表的平均表达水平与随机生成相同大小的每个细胞类型基因列表的平均表达水平。本研究采用Karolinska研究所的大脑scRNA-seq数据集（包括9 970个细胞），用24种细胞类型注释来自小鼠大脑新皮质、下丘脑、中脑、海马和纹状体以及富含少突胶质细胞、多巴胺能神经元的样本；以及linnarsson实验室的另一个scRNA-seq数据集（包括3 005个细胞）。考虑到物种之间差异，应用了艾伦脑科学研究所的另一个人类单核RNA测序数据集的结果，包括人类中颞皮层的4 401个细胞。使用小鼠单细胞转录组测序数据作为背景基因集，将人的奥卡西平靶基因转换成小鼠的基因形式，使用EWCE计算奥卡西平靶基因在脑细胞中表达富集的显著性，利用ggplot2生成图形。

1.7 奥卡西平靶向富集途径分析

为进一步了解奥卡西平治疗癫痫的潜在靶点基因功能及其在信号通路中的作用，将奥卡西平靶点导入DAVID数据库，将P<0.05作为差异具有统计学意义的筛选条件，将物种定义为homo sapiens，进行基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路富集分析。GO富集选取生物过程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF）、细胞组分（cellular component，CC）进行分析。

2 结果

2.1 通过DrugBank查找奥卡西平靶基因

共获取到25种奥卡西平靶基因，主要为钠离子通道、细胞色素P450家族成员、醛酮还原酶家族成员、血清白蛋白、羰基还原酶家族成员，见表1。

表1 奥卡西平25种关键靶基因

2.2 利用DAVID数据库转换靶基因ID

利用DAVID数据库获取上述25种癫痫靶基因的ID信息，见表2。

表2 奥卡西平25种关键靶基因ID信息表

2.3 奥卡西平靶基因与癫痫GWAS数据的关联分析

基因集分析显示，奥卡西平靶基因与癫痫存在关联（P<0.001），其中药物靶点SCN1A、SCN7A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B与癫痫GWAS关联性最强，见表3。

表3 奥卡西平靶基因与癫痫GWAS关联分析

2.4 奥卡西平靶基因与稀有变异癫痫危险基因的遗传重叠

癫痫102个已知致病基因包括：ADSL、CHRNA2、CSTB、GABRA1、GRIN2B、KCNQ2、NHLRC1、PPT1、SCN9A、STX1B、WWOX、ALDH7A1、CHRNA4、CTSD、GABRB2、HCN1、KCNQ3、NR2F1、PRICKLE1、SIK1、STXBP1、ZEB2、ALG13、CHRNA7、DEPDC5、GABRB3、HNRNPU、KCNT1、NRXN1、 PRICKLE2、 SLC13A5、 SYNGAP1、ARHGEF9、CHRNB2、DNAJC5、GABRG2、IQSEC2、KCTD7、PCDH19、PRRT2、SLC25A22、TBC1D24、ARX、CLN2、DNM1、GAMT、KANSL1、LGI1、PIGA、QARS、SLC2A1、TCF4、ATP1A2、CLN3、DYRK1A、GATM、KCNA2、MAGI2、PIGO、SCARB2、SLC35A2、TPP1、ATP6AP2、CLN5、EEF1A2、GNAO1、KCNB1、MBD5、PIGV、SCN1A、SLC6A1、TSC1、CACNA1A、CLN6、EPM2A、GOSR2、KCNC1、MECP2、PNKP、SCN1B、SLC6A8、TSC2、CDKL5、CLN8、FOLR1、GRIN1、KCNJ10、MEF2C、PNPO、SCN2A、SLC9A6、UBE3A、CHD2、CNTNAP2、FOXG1、GRIN2A、KCNMA1、MFSD8、POLG、SCN8A、SPTAN1、WDR45。

运用R语言对奥卡西平靶基因与102种单基因遗传性癫痫研究发现，奥卡西平靶基因与102种单基因遗传病靶基因重合基因有5种，分别是SCN1A、SCN2A、SCN8A、SCN9A、SCN1B。进行Fisher确切检验，得出P<0.001，证明奥卡西平靶基因与癫痫稀有变异基因存在关联性。

2.5 奥卡西平靶基因EWCE分析

为评估奥卡西平靶基因集的表达是否显著富集于特定脑细胞类型，通过EWCE进行分析。基于Karolinska研究所数据集，得出奥卡西平靶基因集主要富集于两种细胞类型（P<0.05），包括下丘脑GABA能神经元（P=0.035）和中型多棘神经元（medium spiny neuron，MSN）（P=0.046）。利用ggplot绘制柱状图，见图1。

图1 奥卡西平靶基因细胞型富集

2.6 奥卡西平靶向通路富集途径分析

通过奥卡西平25个靶基因的路径富集分析，GO功能富集分析结果显示，BP、MF和CC相关条目分别为30、18、5条。BP主要涉及突触后膜电位调节、钠离子跨膜转运、动作电位膜去极化、神经元动作电位、离子跨膜转运的调节、钠离子跨膜转运蛋白活性的调节、钠离子转运的正向调节等，见图2。MF主要包括电压门控钠通道活性、电压门控钠通道活动参与心肌细胞动作电位、钠通道调节剂活性、离子通道活性，见图3。CC主要集中在电压门控钠通道复合体、郎飞结、闰盘、Z板、T管，见图4。KEGG通路富集分析共得到7条信号通路，主要涉及细胞色素P450对外源物质的代谢、类固醇激素生物合成、花生四烯酸代谢、化学致癌作用、心肌细胞中的肾上腺素能信号，见图5。这些重要途径表明，奥卡西平靶基因在钠离子跨膜转运中发挥至关重要的作用。

图2 奥卡西平靶基因GO-BP富集

图3 奥卡西平靶基因GO-MF富集

图4 奥卡西平靶基因GO-CC富集

3 讨论

通过DrugBank数据库检索到25个奥卡西平潜在靶点，钠离子通道和细胞色素P450家族成员最为关键。SCN1A、SCN2A、SCN8A、SCN9A、SCN1B这5种靶基因与102种单基因遗传病靶基因重合，表明奥卡西平靶基因与癫痫稀有变异基因存在显著关联。奥卡西平与钠通道结合，抑制高频重复神经元放电，膜去极化激活钠通道，引起电压依赖的构象变化，增加对钠离子通透性，进一步使细胞去极化。膜失活后通道关闭，对钠离子通透性降低，膜电位恢复静止状态[10］。KEGG通路富集分析共得到7条信号通路，主要涉及细胞色素P450对外源物质的代谢。奥卡西平是一种窄谱酶诱导剂，影响细胞色素P450 3A4（CYP3A4）代谢[11］。CYP3A4在肝脏和肠道中含量最高，负责药物及内源性底物（如前列腺素、类固醇激素和脂肪酸）的代谢[12］。

基因集分析显示，奥卡西平靶基因与癫痫显著相关，其中与癫痫GWAS关联性最强的药物靶点是SCN1A、SCN7A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B。SCN1A位 于 染 色 体2q24.3[13］，编 码NAV1.1通道的α亚基，与多种癫痫综合征相关，其变异导致的癫痫中Dravet综合征超过80%[14］。SCN1A突变导致抑制性GABA能中间神经元钠电流显著减少，减弱GABA能抑制功能，使大脑兴奋和抑制失衡，导致癫痫发作[15］。SCN7A基因编码一个非典型钠通道（Nax），为Na+浓度门控通道。该通道作为血液中Na+水平传感器，通过改变神经元兴奋性控制钠摄取[16］。癫痫发生过程中，SCN7A在海马中表达明显上调，其机制尚未完全阐明[17］。SCN9A在染色体2q24.3上有27个外显子，编码电压门控钠通道Nav1.7的α亚基，表达于背根神经节细胞、神经内分泌细胞和平滑肌细胞[18］。Nav1.7在中枢神经系统中发挥作用，文献报道了其在大脑中（特别是胚胎海马体）表达；SCN9A基因突变导致Nav1.7通道中补体相关蛋白或二级信使变化，从而导致兴奋阈值降低，重复放电增加，大脑钠通道功能改变，神经元之间连接受阻，导致癫痫发作[19］。SCN10A编码电压门控钠通道Nav1.8的α亚基，NaV1.8钠通道选择性表达于初级感觉神经元，如背根神经节、三叉神经节和结状神经节神经元，因此被称为特异性感觉神经元[20］。在小鼠神经元中，电流钳记录显示长时程动作电位的神经元兴奋性增强，表明SCN10A在调节中枢神经系统神经元活动中发挥作用[21］。NaV1.8是电压门控钠通道，从失活状态快速恢复，在背根神经节和外周神经轴突的无髓感觉神经元中重复放电[22］。目前尚不明确Nav1.8疾病突变如何诱导感觉神经元过度兴奋[23］。SCN11A定位于人类3号染色体（3p21-24），编码钠通道Nav1.9a/NaN，在背根神经节和三叉神经节的伤害性初级感觉神经元中优先表达[24］。炎症介质通过G蛋白偶联途径使持续钠电流介导的NaV1.9幅度增加，NaV1.9通过延长阈下刺激的去极化效应调节神经元兴奋性[25］。SCN3B突变使NaV1.5的胞质转运功能受损，转染细胞表面NaV1.5的表达降低。NaV1.5在小胶质细胞生理过程中发挥核心作用，小胶质细胞是中枢神经系统中的巨噬细胞，参与神经炎症反应，对癫痫的发生有重要作用[26］。转染细胞的全细胞膜片钳记录显示，SCN3B突变显著降低了钠电流[27］。在无海马硬化的颞叶癫痫患者中，SCN3B基因产物Navβ3表达下调，进而影响海马区的微电路，影响兴奋性，导致癫痫发生[28］。

通过单细胞测序及EWCE方法，得出奥卡西平主要富集于下丘脑GABA能神经元和MSN。在中枢神经系统，GABA受体在神经元和胶质细胞中均有表达[29］。GABA能系统是脑内神经元兴奋性的主要抑制因子，突变会干扰GABA受体的离子通道运输特性。GABA与GABA受体结合导致通道开放，允许氯离子流入，突触后膜超极化，导致神经元电活动的快速抑制，奥卡西平通过增加GABA受体表达发挥作用[30］。在大脑发育过程中，胎儿端脑的外侧神经节隆起形成纹状体神经元。GABA能MSN是纹状体的主要神经元类型，约占90%以上，是以多巴胺和谷氨酸能输入为主的投射神经元。纹状体的多巴胺能输入来自黑质致密部，谷氨酸能输入来自皮质和丘脑等区域[31］。MSN树突营养不良破坏了突触通信的结构基础，通过延伸的皮质纹状体通路中断信号。鉴于多巴胺和谷氨酸输入共同到达一个MSN脊椎，需要完全了解这些递质及其下游信号靶点的同源受体的动态调节，才能显著提高治疗癫痫的效果[32］。

综上，本研究通过多组学数据的整合分析和网络药理学方法，发现奥卡西平药物靶点共25种，与癫痫致病基因存在关联性，其中药物靶点SCN1A、SCN7A、SCN9A、SCN10A、SCN11A、SCN3B与癫痫GWAS关联性最强。奥卡西平可能通过作用于下丘脑GABA能神经元、中型多棘神经元中的钠离子通道基因发挥抗痫作用。本研究为进一步明确奥卡西平抗痫作用机制及其临床用药的有效性和安全性提供了理论依据。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突