液相芯片技术在东莞市腹泻病原体检测中的应用

李艳芬 叶雪仪 陈永迪 张莉萍 黄勇 刘璇

腹泻是全球公共卫生问题,造成严重的疾病负担,每年约有200 万人因为腹泻而死亡［1］。感染性腹泻的主要病因为细菌、病毒、真菌、寄生虫等病原微生物［2］。由于临床上难以区分致病病原体,实验室的传统诊断方法,如培养、显微镜检测、免疫诊断等方法,灵敏度低且费时费力,而且一般无法覆盖较多的病原体,可能出现花费了大量时间却没有找到致病原因的情况。因此,了解感染性腹泻病原谱情况,提高病原体的检测速度与能力,是控制和降低腹泻在本地区居民中发生和流行的重要基础。近年来高通量多重检测病原体分子诊断方法受到极大关注,其中的液相芯片技术为肠道感染病原调查提供了强有力的手段［3］。Luminex 公司生产的腹泻病原检测试剂盒(xTAG,GPP)可在同一反应管中同时检测包括细菌、病毒和寄生虫等15 种腹泻病原体［1,3］。该技术与常规传染病病原体检测方法比较,高通量、高速度、多重检测的优势尤为明显［4］。本文采用液相芯片技术,于2019 年1 月～2021 年4 月检测了251 例腹泻病例标本,以了解近年来东莞地区腹泻病原种类及分布情况,为临床实验室选择该地区病原体检测种类以及医生实施针对性治疗提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 收集2019 年1 月～2021 年4 月东莞市东华医院门诊腹泻患者251 例。样本选取参照腹泻判定标准：大便次数≥3 次/d,且大便性状有改变(呈稀便、水样便、黏脓便或脓血便等)。其中,男154 例(61.4%),女97 例(38.6%)；年龄1 个月～83 岁,中位年龄1 岁。

1.2 仪器与试剂 仪器：西安天隆NP968 提取仪、ABI ProFlex PCR 扩增仪、Luminex MAGPIX 液相悬浮芯片检测仪。试剂：上海伯杰核酸提取及纯化试剂,美国Luminex GPP 试剂盒。

1.3 标本采集和处理 腹泻患者留取粪便,-80℃分装保存。取约2 g 标本加入离心管中,每管加入1 ml 完全PBS、10 μl MS2、100 μl 氯仿和2 g 玻璃珠机械震荡器剧烈震荡20 min,4℃,3000 r/min 离心30 min,吸取200 μl 上清用于核酸提取。

1.4 核酸扩增和病原体检测方法 根据试剂说明书进行,第一步PCR 扩增体系25 μl,扩增程序为：53℃逆转录20 min,95℃变性15 min,38 次循环(95℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s),最后72℃延长20 min。第二步杂交：依次加入20 μl xTAG GPP Bead MiX、5 μl PCR产物和75 μl SA-PE reporter solution 混匀,65℃ 30 min和45℃ 45 min 杂交。液相悬浮芯片仪进行检测,检测到内标MS2 和阴性对照成立表示检测结果有效。

1.5 统计学方法 采用SPSS17.0 统计学软件进行统计分析。计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 腹泻病原体检出情况 共检出94 例阳性病例(13 种病原体),其中,细菌54 例(7 种病原体,检出率为21.51%、54/251),分别为沙门菌、艰难梭菌毒素A/B型、空肠弯曲菌、肠毒素性大肠埃希菌 (ETEC) LT/ST 型、产志贺毒素大肠埃希菌(STEC)stx1/stx2 型、大肠埃希菌O157 型、霍乱弧菌。志贺菌和小肠结肠炎耶尔森菌未检出。检出最多的3 种细菌为：沙门菌(13.94%、35/251)、艰难梭菌毒素A/B(7.97%、20/251)和空肠弯曲菌(3.98%、10/251)。病毒52 例(3 种病原体,检出率为20.72%、52/251),分别为轮状病毒A 型(13.15%、33/251)、诺如病毒GⅡ型(8.37%、21/251)和GⅠ型(3.59%、9/251)、腺病毒40/41 型(1.20%、3/251)。寄生虫16 例(3 种病原体,检出率为6.37%、16/251),分别为隐孢子虫(5.18%、13/251)、贾第鞭毛虫(1.60%、4/251)和痢疾阿米巴(0.40%、1/251)。

2.2 混合感染情况 94 例(37.45%、94/251)阳性病例中,至少检出1 种病原体。其中,单一感染61 例(64.89%、61/94),同时检出2 种病原体19 例(20.21%、19/94),同时检出3 种病原体6 例(6.38%、6/94),同时检出4 种以上病原体8 例(8.51%、8/94)。混合感染的33 例分别为：细菌多重感染7 例(7.45%、7/94),病毒多重感染7 例(7.45%、7/94),寄生虫多重感染1 例(1.06%、1/94),细菌合并病毒感染6 例(6.38%、6/94),细菌合并寄生虫感染2 例(2.13%、2/94),病毒合并寄生虫感染2 例(2.13%、2/94),细菌病毒寄生虫混合感染8 例(8.51%、8/94)。33 例混合感染的病原体检出情况,见表1。

表1 33 例混合感染的病原体检出情况(n,%)

2.3 病原体季节分布 根据广东的气候特征,各季节的检出率分别为：春季44.90%(22/49),夏季22.39%(15/67),秋季41.67%(25/60),冬季42.67%(32/75)。不同季节的病原体检出率比较,差异具有统计学意义(χ2=8.976,P<0.05),全年以夏季的检出率最低。全年沙门菌(35 例)、轮状病毒A 型(33 例)和诺如病毒GⅡ(21 例)/GⅠ型(9 例)最常见。沙门菌全年均可检出,感染高峰期在春-夏-秋季(3～11 月)；轮状病毒A 型感染高峰期为冬-春季(12～次年3 月),夏天没有检出；诺如病毒GⅡ型和GⅠ型感染全年均可检出,高峰期为秋-冬季(9～次年2 月)。见表2。

表2 不同季节病原体检出结果

2.4 年龄特异的病原体分布 年龄特异分为婴儿(<1 岁),幼儿(1～3 岁),儿童(4～17 岁),成人(≥18 岁)。沙门菌、轮状病毒A 型、艰难梭菌毒素A/B 型婴幼儿最常见。见表3。

表3 年龄特异的病原体检出结果(n,%)

3 讨论

采用液相芯片技术可同时检测的腹泻病原体多达15 种,可同时检测空肠弯曲菌、沙门菌、艰难梭菌毒素A/B 型、肠毒性大肠埃希菌LT/ST 型、产志贺毒素大肠埃希菌stx1/stx2、大肠埃希菌O157 型、志贺菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌、诺如病毒GⅡ/GⅠ型、轮状病毒A 型、腺病毒40/41 型、隐孢子虫、贾第鞭毛虫、痢疾阿米巴,整个实验大概用时6 h。同时检测15 种病原体,为病原谱调查提供了丰富信息,为患者的临床治疗和流行病学监测提供了更加准确的数据。

本研究对251 例腹泻患者进行多重病原体检测,共检出94 例阳性13 种病原体,阳性率为37.45%,与其他地区情况差别不大［5,6］。细菌性病原中检出率最高的是沙门菌,该结论与国内部分研究结论吻合,提示夏季需要重点关注食品卫生问题,特别是沙门菌污染的食物外观没有明显的改变［7］。有研究显示,细菌性腹泻的主要病原体已由过去的志贺菌变成沙门菌和副溶血性弧菌［8］,原因可能是随着社会的发展,人们生活水平提高,饮食习惯改变,蛋、肉类食物占比增多。有报道显示,在沙门菌感染的病例中,超过80%的患儿年龄<1 岁［9］,而本研究结果显示,1～3 岁儿童是易感人群,沙门菌阳性病例中该人群阳性率最高48.57%(17/35),1 岁以下婴儿次之,阳性率为45.71%(16/35)。沙门菌感染季节性明显,因此,夏季的腹泻聚集性疫情查因可以重点考虑检测沙门菌。

病毒性病原体中,轮状病毒A 型和诺如病毒GⅡ型和GⅠ型是引起我市感染性腹泻的主要原因,该结果与珠三角的情况相似［6］。其中轮状病毒A 型引起的轮状病毒肠炎是婴幼儿腹泻最常见的病因［9］,因轮状病毒的强致病性,又没有特效药,因此推广轮状病毒疫苗是目前最经济和有效的控制感染措施。本研究结果显示,轮状病毒A 型感染主要发生在3 岁以下儿童,87.88%(29/33)的感染发生在0～3 岁婴幼儿。轮状病毒A 型感染具有明显的时间分布特征,冬春季高发。

诺如病毒感染全年可见,秋季检出率最高,为24.1%。目前最常见的诺如病毒感染为诺如病毒GⅡ型和GⅠ型。本研究结果显示,诺如病毒感染主要以GⅡ型为主,偶尔发生GⅠ、GⅡ型混合感染。混合感染是否会导致腹泻或呕吐症状加剧尚待进一步研究。

本研究发现,94 例阳性病例中35.11%受到混合感染。过去由于检测方法的限制,不容易发现混合感染的情况。本研究发现多种共同感染的情况,从19 例双病原体感染的结果看,没有发现比例很高的固定组合,出现最多的组合为沙门菌+艰难梭菌毒素A/B 型3 例(15.79%、3/19),其次是轮状病毒A 型+诺如病毒GⅠ型2 例(10.53%、2/19)。3 重感染的病原体组合均不相同,没发现优势组合。有报道提出艰难梭菌毒素与另外的病原体一同被检出的情况下,不一定是真正意义的混合感染。艰难梭菌毒素被认为是人类肠道的正常菌群,若产毒素艰难梭菌由于抗菌药物使用不当等原因导致过度繁殖,引起腹泻的发生［10］。叶鸿雁等［11］研究显示混合感染患儿的临床症状多于单一感染群体。腹泻重症患者是否与共同感染有关有待进一步的研究。

近年来,腹泻引起的暴发疫情不断出现,病原体种类繁多,并且每年的流行种类和周期也不断变化。液相芯片技术经研究与常规方法符合度高,总体的灵敏度和特异性分别>94%和98%,时间上明显优于传统方法,有利于应急事件的早发现、早诊断和早治疗［12］。液相芯片技术既可以使用已发售的商品化试剂,也可按照不同需求进行自行定制。根据本地区出现的腹泻疫情病原体情况,接下来可设计副溶血性弧菌、扎如病毒等更多病原体加入到腹泻多重试剂盒,便于今后快速筛查工作全覆盖。