基于DNA条码技术的高通量食品中动物源性成分的快速检测方法

张先茂 颜庭林

摘 要：本文应用DNA条码技术，研究通用引物，扩增动物源性加工食品中线粒体基因COI，开发检验快速、准确、低成本和高通量的食品中动物源性成分的快速检测方法。结果表明，该方法有很好的特异性，最低检出限为0.10 ng/µL，可以对未知、已知动物源性成分的食品进行快速、准确的定性、定量检测。

关键词：DNA条码技术;高通量快速检测;动物源性成分;通用引物

Rapid Detection of Animal Derived Ingredients in High Throughput Food Based on DNA Barcode Technology

ZHANG Xianmao， YAN Tinglin

（Gansu Province Product Quality Supervision and Inspection Research Institute， Lanzhou 730050， China）

Abstract： In this paper， DNA barcode technology is used to study universal primers to amplify the COI of mitochondrial genes in animal-derived processed foods， and to develop a rapid， accurate， low-cost and high-throughput rapid detection method for animal-derived components in food. The results show that the method has good specificity， the minimum detection limit is 0.10 ng/µL， and it can perform rapid and accurate qualitative and quantitative detection of food with unknown and known animal-derived components.

Keywords： DNA bar code technology; high throughput rapid detection; animal derived ingredients; universal primers

DNA条形码技术是近年来新兴的DNA分子检测技术[1]。不同于传统的分子检测技术，DNA条形码以一对通用引物扩增物质的线粒体基因COI标准序列，通过序列内碱基的多样性对已知和未知的成分进行识别，且这种技术已逐渐应用于食品领域[2]。在动物源性食品中，线粒体基因COI已成为动物物种鉴定中公认的理想DNA条形码片段。由于DNA分子的热稳定性，DNA条码技术在加工肉类食品中鉴定动物源性成分、标签符合性查验等方面被广泛应用[3-5]。

目前对肉类加工食品中未知动物源性成分的检验还处于空白阶段，传统的Sanger测序技术仅能对已知动物源性成分进行检验，在对多种未知动物源性成分的检验方面还存在不足。本实验应用DNA条码技术，结合纳米技术，开发能快速、准确检测食品中动物源性成分的检验方法。

1 材料与方法

1.1 材料

动物源性食品来源：熟制牛肉、熟制羊肉、熟制鸭肉、熟制鸡肉、熟制猪肉和熟制牦牛肉购自兰州某大型超市，-18 ℃保存;熟制马肉购自甘南藏区。

1.2 试剂

动物源性成分DNA提取试剂盒（天根生物科技有限公司，包括DNA裂解液;PCR緩冲液 10X;dNTP 10X;Tap酶5 U/µL）;琼脂糖（Sigma）;GEL-Red（碧云天生物科技有限公司，

10000X）。

1.3 设备

PCR仪（美国伯乐，T100）;水平电泳仪（美国伯乐，PowrpacBasic）;凝胶成像系统（美国伯乐，GEL DOCXR）;荧光定量PCR仪（美国赛默飞，QuantStudio）;核酸蛋白测定仪（美国赛默飞，Nanodrop one）;组织破碎仪（格兰迪森，GD-IN）。

1.4 实验方法

1.4.1 引物探针设计

应用PrimerBank，结合VALENTINI等[6]的方法，设计牛肉、羊肉、鸭肉、鸡肉和猪肉的通用引物，引物探针序列如表1所示。

1.4.2 样本DNA提取及质量检测

根据试剂盒说明书步骤提取动物源性食品样品DNA。提取纯化后的DNA溶液为10 µL，取0.2 µL到核酸蛋白测定仪中测定纯度，核酸纯度控制在70～120 ng/µL[7]。

1.4.3 高通量DNA条码技术的建立

与赛默飞生物科技有限公司合作，将设计的通用内参基因序列，F'端通用引物，R'端通用引物，探针引物固定在荧光实时定量PCR仪器配套的微流控芯片上。将纯化后浓度为70～120 ng/µL的核酸，牛、羊、鸭、鸡、猪DNA滴加在荧光实时PCR微流控芯片上[8]。通过优化实验，最终确定多重实时荧光PCR反应最优条件见表2。

1.4.4 方法特异性及检出限

取同样质量的牛、羊、鸭、鸡、猪、马和牦牛动物源性样品，用组织破碎仪打碎，混匀，按照1.4.2的方法提取DNA，对混合样品进行多重实时荧光PCR扩增，根据扩增荧光曲线，检测通用引物扩增的特异性[9]。

将牛、羊、鸭、鸡和猪的模板样品的DNA进行10倍梯度稀释，原始DNA浓度为100 ng/µL，稀释后浓度分别为10.00 ng/µL、1.00 ng/µL、0.10 ng/µL和0.01 ng/µL。多重实时荧光PCR扩增后，检测牛、羊、鸭、鸡和猪的模板样品DNA的最低检出限。

2 结果与分析

2.1 DNA提取质量及纯度检测结果

按照1.4.2实验方法提取样品中DNA，用核酸蛋白分析仪测定核酸浓度。如表3所示，所有样品DNA提取效果较好，DNA浓度在150～270 ng/µL，需要对DNA浓度进行适当稀释，控制DNA浓度在70～120 ng/µL。

2.2 多重DNA条码扩增结果

根据通用引物和探针扩增牛、羊、鸡、鸭和猪样品，通过优化PCR条件，最终被检测样品均扩增出明亮、无拖尾的特征性目的条带，说明该方法可以同时检测5种样品，且无干扰条带。扩增出的片段，牛源性样品为274 bp，羊源性样品为331 bp，鸡源性样品为227 bp，鸭源性样品为201 bp，猪源性样品为398 bp。扩增产物电泳图见图1。

2.3 特异性和检出限检测结果

在已知样品中混入马、牦牛动物源性物质，根据多重动物源性样品多重实时荧光扩增结果，马动物源性食品应用通用引物扩增，扩增不出荧光条带，说明该方法研究的通用引物具有特异性。如图2所示，1号为空白，2号为马肉，显示无扩增产物。3号、4号分别为牛、牦牛，说明该引物对同源相似性大的动物源性食品均有扩增效果。5～8号分别为羊、鸡、鸭、猪源性食品，均有很好的荧光扩增曲线。取牛、羊、鸡、鸭和猪的模板样品，混合打碎后提取纯化DNA，经梯度稀释后，混合样品DNA浓度依次为100.00 ng/µL、10.00 ng/µL、1.00 ng/µL、0.10 ng/µL和0.01 ng/µL。經多重实时荧光PCR扩增后，结果如图3所示，1号为DNA浓度100.00 ng/µL，2号为DNA浓度10.00 ng/µL，3号为DNA浓度1.00 ng/µL，4号为DNA浓度0.10 ng/µL，5号为DNA浓度0.01 ng/µL，6号为空白。DNA浓度为0.01 ng/µL时，无扩增荧光曲线，表明DNA浓度过低，不能有效扩增。最低DNA浓度为0.10 ng/µL时有荧光扩增曲线，表明该方法能检测到的最低DNA浓度为0.10 ng/µL，该方法的检出限为0.10 ng/µL。

3 结论

该方法研究应用DNA分子标记技术，开发通用引物探针，快速检测牛、羊、鸡、鸭和猪5种混合样品中每类样品的含量，该检验方法能检测DNA的最低浓度为0.10 ng/µL，方法检出限为0.10 ng/µL，该灵敏度满足国家标准检测动物源性成分标准要求。

参考文献

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