长江口及其邻近海域表层沉积物中有机污染物复合毒性与多环芳烃毒性贡献

楚兰兰，解满俊，王茜,*，李娟英

1. 上海海洋大学海洋生态与环境学院，上海 201306 2. 上海海滨污水处理有限公司，上海 201302

长江口是我国重要的三大河口之一。近年来由于人口增多，工农业迅速发展，大量的有机污染物，通过直接排放、雨水冲刷以及大气沉降进入水体，并由于其低溶解性和疏水性，富集在沉积物中。沉积物中这些有机污染物并不是单一存在的，而是以混合物的形式存在，污染物之间又可能存在相互作用，产生相加或协同等复合效应，对人类和底栖生物造成的危害可能远大于单一污染物。多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类环境中普遍存在的持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs)，对人体具有“三致”效应(致癌、致畸和致突变)[1-2]，美国环境保护局(United States Environmental Protection Agency, US EPA)于1976年将16种PAHs列为优先控制污染物。PAHs通过工业废水排放、海上运输以及石油泄漏等途径进入长江口及其相邻水域，并富集在沉积物[3-4]。然而，PAHs及其他未知污染物在复合污染中对生物的毒性作用贡献仍不明确。2019年长江流域全面实施“长江大保护”战略，长江经济带11省市强力推进长江生态系统保护修复。因此，明确表层沉积物中复合污染的生物毒性作用，评估PAHs的毒性贡献，并确定长江流域污染物削减控制重点，了解污染物浓度、风险和毒性的变化，对确定区域特征污染物变化，进一步有针对性地制定污染控制策略有重要意义。

由于有机化合物以混合物的形式存在，很难根据它们各自的浓度来评估沉积物中有机污染物的危害。此外，可能还存在一些由于方法或技术限制而未被检测到的污染物。因此，Escher等[5-6]建立了Iceberg模型，该模型基于生物分析当量浓度(BEQ)，利用细胞毒性实验，综合评估环境样品中已检测到的或未检测到的化学物质对复合毒性效应的贡献程度。它可以评估沉积物中有机污染物的潜在危害，并广泛应用于地表水[7]、沉积物[8]和废水样品[9-11]中有机污染物的毒性贡献评估。通过比较生物分析的BEQ值(BEQbio)和化学分析的BEQ值(BEQchem)，确定已检测到或未检测到的化学物质对混合物毒性效应的贡献程度[7]，从而明确环境介质中的特征污染。

目前，对长江口沉积物中有机污染物的研究，主要集中在对其组成、分布及来源的分析[3-4,12-15]，而对其复合毒性以及各个组分贡献程度的研究却尚未有报道。因此，本研究在长江口近海海域采集表层沉积物样品，运用气相色谱-质谱联用仪测定长江口沉积物中16种PAHs的浓度。在此基础上，分析其时空分布特征、发光细菌毒性当量以及PAHs毒性贡献，并就其环境风险进行评估，以期为控制和削减该区域PAHs的污染提供理论基础及科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 仪器与试剂

仪器：冷冻干燥机(FreeZone 6，美国LABCONCO公司)、电子天平(ML104T/02，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司，中国)、微波消解仪(CEM MARS CLASSIC，美国CEM公司)、气相色谱-质谱联用仪(Agilent 8890A/5975C，安捷伦科技(中国)有限公司)、干式氮吹仪(QYN100-2，上海巧跃电子有限公司，中国)、涡旋振荡器(H-101，上海康禾光电仪器公司，中国)、立式高压灭菌器(LDZX-30KPS，上海申安医疗器械厂，中国)、马弗炉(KSL-1200X-H，合肥科晶材料技术有限公司，中国)、电热鼓风干燥箱(DHG-9070A，上海一恒科学仪器有限公司，中国)、低速大容量多管离心机(LXJ-IIB，上海安亭科学仪器厂，中国)、超声波清洗器(KQ3200DB，昆山市超声仪器有限公司，中国)、多功能微量移液器(Transferpette®S-12 Dig. 30～300 μL，普兰德(上海)贸易有限公司，中国)、纯水机(Milli-Q®Express 40，默克化工技术(上海)有限公司，中国)、医用低温保存箱(DW-86L578J，成都壹科医疗器械有限公司，中国)。

试剂：正己烷、丙酮(色谱纯，默克化工技术(上海)有限公司，中国)；二氯甲烷(色谱纯，上海阿达玛斯试剂有限公司，中国)；层析硅胶(60～100目，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)置于马弗炉中650 ℃下灼烧4 h，冷却后转移至干燥器中待用；0.7 μm玻璃纤维滤膜(GF/F，英国Whatman公司)；铜片(高纯试剂，5N，国药集团化学试剂有限公司，中国)；高纯氮气(99.99%，上海利旦工业气体有限公司，中国)；氯化钠(NaCl，分析纯，上海柯灵斯试剂有限公司，中国)；六水氯化镁(MgCl2·6H2O，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)；氯化钾(KCl，分析纯，99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)；3-N-吗啉丙烷磺酸(MOPS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)；氢氧化钠(NaOH，分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，中国)；盐酸(HCl，优级纯，上海柯灵斯试剂有限公司，中国)；二甲基亚砜(DMSO，纯度>99.5%，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司，中国)；费氏弧菌冻干粉(北京海富达科技有限公司，中国)；16种多环芳烃混合标准溶液(浓度为2 000 μg·mL-1，BePure)购自Sigma-Aldrich公司(NIST1647F)，于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2 样品采集

于2019年和2020年12月对长江口海域沉积物进行了2次调查采集(图1)。其中2019年航次共调查采集17个站点(S1～S17)，2020年航次共调查7个站点(L1～L7)。利用彼得森抓斗式采泥器(DXCN1/40，厦门登迅仪器设备有限公司)采集表层6 cm以上的沉积物，将其置于干净的铝箔袋中密封。置于加入冰袋的保温箱中，运回实验室后于-20 ℃冰箱保存。

图1 2019—2020年长江口采样点图Fig. 1 Map of sampling points in the Yangtze Estuary from 2019 to 2020

1.3 样品萃取

将沉积物样品冷冻干燥，用研钵研磨，过100目筛并存放于铝箔袋中，避光储藏待测。

1.3.1 沉积物中PAHs的萃取

称取3 g冻干并过筛的沉积物样品，用滤纸包好置于微波萃取管中，加入15 mL二氯甲烷，萃取完成后，将萃取溶液转移至10 mL玻璃离心管内，再用5 mL二氯甲烷溶液洗涤萃取管2次，转移至玻璃离心管内。再将2次萃取液浓缩并合并。每个离心管中加入1片铜片，浓缩至2 mL左右过滤。用硅胶柱净化上述溶液，二氯甲烷洗脱(10 mL)，最后用氮气吹至近干，正己烷定容至0.5 mL，待测。

1.3.2 沉积物复合污染物的萃取

称取3 g冻干并过筛的沉积物样品，用滤纸包好置于微波萃取管中，加入10 mL二氯甲烷，萃取完成后，将萃取液转移至30 mL玻璃离心管内；再向微波萃取管中加入10 mL丙酮∶正己烷(V∶V=1∶1)混合液，萃取完成后，将萃取液转移至的玻璃离心管内，用5 mL丙酮∶正己烷(V∶V=1∶1)混合液洗涤萃取管2次，转移至玻璃离心管内。然后以3 000 r·min-1离心10 min；离心结束后，用0.7 μm玻璃纤维过滤器过滤并浓缩至2 mL左右合并，再氮吹至近干，用丙酮∶正己烷(V∶V=1∶1)混合液定容至1 mL，待用。

1.4 化学分析

采用安捷伦公司气相色谱-质谱联用仪(Agilent 8890A/5975C)对样品中16种优先控制PAHs单体进行定量测定。色谱柱为HP-5-MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，载气为氦气，流速为1 mL·min-1，进样口温度260 ℃，进样量1 μL，进样方式不分流；柱温：70 ℃保持1 min，然后以10 ℃·min-1的速率升至160 ℃ ，再以5 ℃·min-1的速率升至280 ℃，保持5 min，最后以20 ℃·min-1的速率升至280 ℃，保持5 min。质谱条件：离子源类型为EI；离子源温度为280 ℃；溶剂延迟为5 min；扫描方式为选择离子；扫描类型为MS2全扫，MSM保持5 min，MS1 SIM保持36.5 min；扫描时间为107 ms。

1.5 生物分析

采用美国伯腾公司Synergy H1多功能微孔板检测仪对底泥样品总体毒性进行定量测定。向1 L纯水中加入0.3 g KCl、2.035 g MgCl2·6H2O、0.3 g MOPS、20 g NaCl和0.2 g NaOH配制缓冲液，将pH调节至7.0±0.2，高温灭菌后储存备用。取200 μL沉积物提取液转移到棕色小瓶中氮吹至干，将残留物重新溶解在DMSO中，并转移到缓冲液中。在透明96孔板中进行梯度稀释后，将100 μL缓冲液中的样品加入到白色96孔板中的50 μL的费氏弧菌(Vibriofischeri)菌液中。在加入样品之前和培养30 min后，测量细菌的发光度。

1.6 数据评估

按照ISO标准方法11348-3[16]和Escher等[17]计算生物发光抑制率的方法，用公式(1)计算效应中值浓度(EC50)，其中s为浓度-效应曲线的斜率[18]。每种化学品的EC50值以mol·L-1为单位，而环境样品的效应浓度(EC)用相对富集因子(REF)表示[19-20]。样品REF(公式(2))是生物测定法(公式(3))的稀释因子与样品富集因子(公式(4))的乘积。沉积物提取物(kgsed, dw的富集因子为以提取物最终体积提取的沉积物质量，并根据公式(4)计算。每种生物测定的稀释因子均使用公式(3)计算[21-22]。

(1)

REF=稀释因子生物测定× 富集因子沉积物

(2)

(3)

(4)

样品中化合物i的相对效应效价(REPi)用于计算不同化学物质之间的相互作用以及预测已知化学混合物的混合作用，由公式(5)获得。其中，EC50(参照化合物)指的是参照化合物效应浓度，EC50(i)指的是化合物i的效应浓度[6-7,11,23]。其中，本文中所用的参照化合物为苯酚溶液，化合物i为多环芳烃各单体，其EC50来自于相关参考文献[24]。

(5)

发光细菌毒性测试得到的生物分析当量BEQ值(BEQbio)，可以由参照化合物的EC50除以样品的EC50计算得到(公式(6))[6-7,11,23]。

(6)

化学分析得到的化学分析当量BEQ值(BEQchem)可以计算为REPi与所有被测化合物i的浓度(Ci)的乘积之和(公式(7))[5-6,11,25]。

(7)

将BEQbio和BEQchem进行比较，确定检测到的化学物质对混合物效应的贡献程度(公式(8))[5, 10]。

(8)

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 长江口表层沉积物中PAHs的时空分布及环境风险

2019年和2020年长江口表层沉积物中16种PAHs的总浓度(ΣPAHs)的时空分布如图2所示。2019年长江口表层沉积物中16种PAHs的ΣPAHs范围为32.84～283.47 ng·g-1，平均值为123.16 ng·g-1。站点S3(283.47±29.94) ng·g-1浓度最高，其次是站点S7(279.07±16.75) ng·g-1和S16(234.15±0.80) ng·g-1，其原因可能是S3和S16这2个站点都靠近渔港，它们分别紧邻吕四渔港和沈家门渔港，船只过往频繁，汇集了船舶燃油及工业排放等多来源的污染物[26-27]；而站点S7浓度较高是由于该站点ANY(30.38±1.04) ng·g-1、BkF(5.99±0.28) ng·g-1浓度较高。ANY与石油源污染有关，BkF与液体化石燃料燃烧有关[28]，很可能是船舶燃油燃烧以及燃油泄漏导致该处的多环芳烃浓度较高。站点S6(43.86±3.54) ng·g-1和S9(32.84±1.30) ng·g-1附近海域PAHs浓度最低，主要由于该区域远离陆地，受陆源影响较小，并且没有突发污染事故发生。其他采样点沉积物中浓度范围为66.64～106.59 ng·g-1(S1=(93.18±0.070) ng·g-1、S2=(83.33±5.47) ng·g-1、S4=(66.64±2.41) ng·g-1、S5=(106.59±0.35) ng·g-1、S8=(75.66±2.18) ng·g-1、S10=(102.62±6.89) ng·g-1、S14=(97.4±12.74) ng·g-1、S15=(95.96±9.03) ng·g-1和S17=(88.08±2.81) ng·g-1)，空间分布均匀，点位之间无显著差异(OneWay ANOVA,P<0.05)，说明研究区域的大部分点位受到长江口水流冲刷的影响，PAHs浓度得到一定程度的稀释。

2020年长江口表层沉积物中16种PAHs的ΣPAHs范围为66.93～132.64 ng·g-1，平均值为98.91 ng·g-1。2020年站点L6(132.64±9.95) ng·g-1和L7(130.14±8.55) ng·g-1的表层沉积物中PAHs浓度比较高，与2019年相比，2020年L6(2019年S15)附近区域PAHs浓度有所上升，可能存在某些污染源排放或突发原油泄漏。而在站点L3(68.01±5.8) ng·g-1和L5(66.93±6.22) ng·g-1处，沉积物中PAHs浓度有所降低。从时间变化来看，2020年PAHs的总体浓度有所降低。2019年的S1和S11站点分别与2020年的L1和L3站点重合。2020年的PAHs浓度在站点L1为(89.99±0.79) ng·g-1，在L3为(68.01±5.8) ng·g-1，比2019年数据S1=(93.18±0.070) ng·g-1和S11=(146.88±10.75) ng·g-1有所降低，可能与2020年新型冠状病毒疫情暴发，沿海港口受到影响，PAHs排放相对较少有关。将本研究与长江口其他年份调查研究对比，发现本研究PAHs浓度与2013年长江口及浙江省沿岸海域PAHs(31.8～384) ng·g-1[3]浓度相当，并远低于2009—2010年的调查结果[29]，呈现出一种逐年降低的趋势，可能与“长江大保护”的实施有关，长江经济带的生态环境得到逐年改善。

图2 2019—2020年长江口表层沉积物中PAHs含量时空分布注：(a) 2019年，(b) 2020年；ΣPAHs为多环芳烃总浓度。Fig. 2 Temporal and spatial distribution of PAHs in the sediments from the Yangtze River Estuary in 2019 and 2020Note: (a) In 2019, (b) In 2020; ΣPAHs stands for the total concentration of polycyclic aromatic hydrocarbons.

根据沉积物质量基准(SQGs)提出的风险效应低值(effects range low, ERL)和风险效应高值(effects range median, ERM)，本研究进一步评估了调查海域表层沉积物中PAHs的生态风险(表1)。结果表明，2019年部分点位的FLU浓度(S11～S17)和ANA浓度(S3、S10～S11、S14)以及2020年部分点位的FLU浓度(L1～L2、L6～L7)和ANA浓度(L3)处于ERL和ERM之间，说明以上站点表层沉积物中PAHs可以引发潜在生态风险。剩余站位的PAHs各单体浓度均低于ERL值，说明这些站点海域的沉积物中PAHs引发生态风险的可能性较低。2020年长江口沉积物的生态风险略低于2019年，这也与前文对PAHs总浓度的分析结果一致。对于BbF、BkF、IPY和BPF，由于没有最低安全值，因此这些物质只要存在对环境就会产生毒副作用[3, 30]。而在本次调查研究中，这些组分在各个站点(2019年S1～S17；2020年L4～L7)有部分检出，其中检出率最高的是BbF，其次是BkF，这可能是海上来往船只燃油燃烧导致的，需引起重视。

表1 长江口沉积物中PAHs的生态风险评估Table 1 Ecological risk assessment of PAHs in sediments of the Yangtze Estuary

2.2 长江口表层沉积物中疏水性有机污染物的发光细菌毒性当量(BEQbio)

本研究采用发光细菌毒性测试法评估长江口表层沉积物中有机污染物复合污染的细胞毒性效应，其量化指标为生物分析当量浓度(BEQbio)。长江口表层沉积物毒性效应的时空分布如图3所示，不同采样位点的BEQbio浓度存在一定的空间差异。在2019年采集的表层沉积物中，BEQbio值的范围在30.45～604.62 mg·kg-1之间，平均值为128.20 mg·kg-1。最大值出现在S6点，为604.62 mg·kg-1；其次是S5和S11，其BEQbio分别为427.13 mg·kg-1和267.15 mg·kg-1；最小值出现在S14处，其BEQbio为30.45 mg·kg-1；在站点S1～S4、S7～S10、S13、S15～S16处，沉积物中BEQbio含量水平相对较低，且较为接近，空间分布也较为均匀，表明该区域沉积物受外界有机污染影响较小。2019年S6处的BEQbio值最大，但其ΣPAHs浓度(43.86±3.54) ng·g-1却很低，表明PAHs并不是该站点海域主要的污染贡献者。该站点远离陆地，受陆源影响较小，污染物可能来源于洋流携带、大气沉降或某种污染物运输过程的突然泄漏，因此需要进一步筛选该区域的特征污染物。2020年采集的表层沉积物中，BEQbio值的范围在23.15～122.87 mg·kg-1之间，平均值为98.91 mg·kg-1。最大出现在L1点，为122.87 mg·kg-1；其次是L4，其BEQbio为81.06 mg·kg-1。最小值出现在L5处，其BEQbio为23.15 mg·kg-1。

2019年的S1和S11站点分别与2020年的L1和L3站点重合。二者相比，2020年的细胞毒性BEQbio在站点L1为(122.87±18.29) mg·kg-1，在L3为(37.16±3.77) mg·kg-1，与2019年数据S1=(45.30±2.62) mg·kg-1和S11=(267.15±4.60) mg·kg-1相比，L1处有所升高，L3处有所降低。这与PAHs浓度变化有所不同，说明PAHs总浓度与底泥的复合毒性不存在明显的相关性。

图3 长江口表层沉积物中有机提取物的毒性当量BEQbio的空间分布注：(a) 2019年，(b) 2020年；BEQbio为生物分析当量浓度。Fig. 3 Spatial distribution of toxic equivalent BEQbio of organic extracts in the surface sediments from the Yangtze River EstuaryNote: (a) In 2019, (b) In 2020; BEQbio stands for biological analysis equivalent concentration.

2.3 长江口表层沉积物中PAHs的化学分析毒性当量(BEQchem)及毒性贡献

本研究使用浓度加和概念将检测到的化学物质的水平转换为BEQchem，并计算了沉积物提取物中PAHs的毒性当量及毒性贡献(表2)。结果发现，BEQchem在0.39～26.51 mg·kg-1之间。其中，2019年长江口表层沉积物中PAHs的毒性当量BEQchem在0.39～26.51 mg·kg-1之间，最大值出现在S2处，该处的PAHs毒性贡献占比最高，为37.59%，其中低环芳烃ANY(BEQchem=(23.75±31.43) mg·kg-1)的毒性贡献最多，约占89.60%，表明该站点受到石油源的污染较重；最小值出现在S9处，该处的PAHs毒性贡献占比相对较低，为1.00%，表明该站点受到PAHs和有机污染物影响较小。2020年长江口表层沉积物中PAHs的毒性当量BEQchem在0.56～7.47 mg·kg-1之间，最大值出现在L3处，该处的PAHs毒性贡献占比最高，为20.10%，其中芳烃BaA(BEQchem=(0.95±0.17) mg·kg-1)贡献最多，约占12.69%，该站点附近的海上油井内喷出的天然气发生自燃，导致该处的高环芳烃浓度较高；最小值出现在L5处，该处的PAHs毒性贡献占比相对较低，为2.42%，表明该站点受PAHs及有机污染物影响较小。

在2019年长江口沉积物的细胞毒性测试中，S6点BEQbio最高，但是通过对其PAHs的BEQchem计算，可知PAHs对其贡献极少，仅为0.081%，其他未知的有机污染物占毒性贡献的99.9%，说明PAHs不是该站点的特征污染物。2020年的L1点也存在这种情况。

在长江口沉积物毒性当量浓度中PAHs所占比例较小，将本研究中PAHs的毒性贡献数据与其他研究进行了比较。Hwang等[33]的研究表明，PAHs在沉积物中的毒性贡献在Yellow Sea(韩国管辖海域)为0.02%～9.4%(1.8%)、Yellow Sea(中国管辖海域)为0.09%～246%(18.9%)、中国渤海为0.30%～1 991%(93.3%)；Jin等[34]的研究表明，PAHs在PM2.5中的毒性贡献为北京(26.5%)、广州(16.7%)；而本研究2019年和2020年PAHs的毒性贡献分别为4.46%和4.25%，与以上研究结果相比，本研究PAHs的毒性贡献偏低。该结果也表明，本研究中检测到的PAHs仅能解释所观察到的复合毒性效应的一小部分，还需要进一步对其他未检测的化学物质进行测试分析。

表2 长江口表层沉积物中有机提取物的毒性当量BEQ的质量浓度Table 2 The mass concentration of the toxic equivalent BEQ of organic extracts in surface sediments at the Yangtze River Estuary (mg·kg-1)(以干质量计 Based on dry mass)

综上所述，本研究表明：

(1) 长江口及其邻近海域表层沉积物中PAHs分析结果表明，2019年采集的表层沉积物样品中PAHs在渔港附近呈现较高浓度，2020年则在舟山岛附近呈现较高浓度；与2019年相比，2020年PAHs的总体浓度有所降低，且生态风险也略低于2019年。

(2) 2019年采集的表层沉积物中，BEQbio值在30.45～604.62 mg·kg-1之间(平均值为128.20 mg·kg-1)。其中，S6处毒性最强，S14处毒性最弱；而2020年的BEQbio值在23.15～122.87 mg·kg-1之间(平均值为66.62 mg·kg-1)，其中，L1处毒性最强，L5处毒性最弱。

(3)在采集的表层沉积物中，2019年PAHs毒性贡献占比最高的是站点S2(37.59%)，其主要贡献者是来自石油源的低环芳烃ANY，约占S2的89.60%；而2020年的是站点L3(20.10%)，其主要贡献者是来自附近海上油井内喷出的天然气发生自燃产生的芳烃BaA，约占L3的12.69%。在长江口沉积物毒性当量浓度中，2019年和2020年的PAHs所占比例较小，其平均占比分别为4.46%和4.25%，表明检测到的PAHs仅能解释所观察到的复合毒性效应的一小部分，还需要进一步对其他未检测的化学物质进行测试分析。

通讯作者简介：王茜(1987—)，女，博士，讲师，主要研究方向为有机污染物的环境行为、生物积累以及环境污染修复等。