一株传统牦牛酸乳源醋酸杆菌鉴定及产酸条件优化

李咪咪，龙虎，陈炼红

(西南民族大学 食品科学与技术学院，成都 610041)

牦牛乳营养价值高，乳中含有丰富的脂肪、蛋白质、非脂乳固体、矿物质等，其含量均比其他牛乳高[1]。牦牛乳发酵制得的牦牛酸乳因其特有的风味而受到欢迎，酸乳中富含乳酸、氨基酸、不饱和脂肪酸等物质，具有调节人体肠道菌群、促进肠道蠕动、调节血压、降低胆固醇等功能[2]。酸乳中的微生物具有多样性，其中以乳酸菌为优势菌群，同时还存在酵母菌和醋酸杆菌，丁武蓉[3]、张和平[4]均在自然发酵乳制品的研究中发现并分离得到醋酸杆菌。

醋酸菌(acetic acid bacteria)是食醋发酵生产过程中的主要产酸菌，是一种革兰氏阴性细菌，能够将乙醇氧化成乙酸，该菌最初来源于传统发酵酿醋中[5-6]。若使醋酸菌生长繁殖良好，除了提供所需的营养物质即六大营养素之外，还要提供合适的培养条件，如培养温度、乙醇浓度和pH等[7-8]，改变这些培养条件，会导致醋酸菌发生变形甚至死亡。利用菌株形态观察和生理生化特性的鉴定方法不能准确地鉴定醋酸菌，其原因是醋酸菌各种属间菌株的菌落形态和生理生化特性区别较不明显，因此若要准确鉴定醋酸菌到菌种，还需对菌株进行基因测序相结合。

本研究以从牦牛乳中分离得到的一株疑似醋酸菌的菌株为试验材料，根据其形成菌膜的特性，通过形态学观察、生理生化特征鉴定和16S rRNA序列分析方法，鉴定其归属。再对其培养条件进行优化，以乙醇浓度、培养温度、pH值和培养基为影响因素，利用正交试验寻找该菌株最佳的产酸培养条件,为新醋研发提供了理论支持。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基

1.1.1 菌株来源

从高原牦牛乳中分离出一株菌，编号CS-63，保存于西南民族大学生命科学与技术学院102实验室。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 基础培养基

1%酵母浸提物、1%葡萄糖、0.05% MgSO4、0.01% ZnSO4、0.1% K2HPO4。

1.1.2.2 YPG培养基

0.5%酵母浸提物、0.3%葡萄糖、0.2%蛋白胨、pH 6.8。

1.1.2.3 发酵液体培养基

1%酵母浸提物、1%葡萄糖、0.3%蛋白胨。

1.1.2.4 平板培养基

1%酵母浸提物、1%葡萄糖、1%碳酸钙、2%琼脂、pH 4.5，使用前加3%无水乙醇。

1.2 常用试剂与仪器

NaOH、HCl、酚酞试剂、无水乙醇、FeCl3：成都康迪生物技术有限公司。

PL-303型分析天平 梅特勒-托利多仪器有限公司；SW-CJ-IF型单人双面净化工作台 苏州净化设备有限公司；UV-6100型分光光度计 上海美谱达公司；凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司；TC-512 PCR型扩增仪 英国Techne公司；804R型冷冻离心机 德国Eppendorf公司；LX-B35L型高压灭菌锅 深圳市佳博特实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 醋酸菌菌落形态观察

在无菌条件下，取1 mL样品在9 mL质量分数为0.9%的NaCl溶液中稀释10倍，充分混匀，以10倍稀释法对其进行梯度稀释。待培养基冷却至50 ℃左右，向直径9 cm的培养皿内倒入20～25 mL，待冷凝后，吸取1 mL的 10-5,10-6,10-7稀释液涂布于无菌培养皿中，倒置于30～37 ℃温箱内，使之干燥以便于单菌落的出现。取单菌落，在上述无冷凝水的平板一侧边缘处，涂抹在直径约为1 cm大小的面积上；反复操作以划满整个平板为宜，倒置平板，于30 ℃培养1～2 d，出现单菌落。观察其菌落形态，记录包括形状、大小、表面、隆起形状、菌落及培养基的颜色等指标。

1.3.2 醋酸菌理化鉴定

将菌株CS-63在YPG培养基上培养3 d后，对菌株进行革兰氏染色试验、接触酶试验、乙醇氧化试验、氧化酶试验、淀粉水解试验及葡萄糖氧化试验，具体操作方法参照《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》[9-10]。

产酸定性试验：检测方法参照李素燕的测定方法[11]。

1.3.3 醋酸菌的16S rRNA鉴定

1.3.3.1 醋酸菌基因组DNA的提取

采用天根生化细菌基因组DNA提取试剂盒提取单个菌株的基因组DNA。提取的基因组DNA可用紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测纯度和浓度。

1.3.3.2 醋酸菌16S rRNA基因的PCR扩增

PCR扩增16S rRNA基因引物为细菌通用引物FA-27F(5′-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)与RA-1495R(5′-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)。

16S rRNA基因的PCR反应条件：预变性94 ℃，5 min；变性94 ℃，1 min；退火58 ℃，1 min；延伸72 ℃，2 min；循环30次，末端延伸72 ℃，10 min；4 ℃保温。

1.3.3.3 16S rRNA PCR产物测序分析

扩增结束后，取约5 μL的PCR扩增产物加1 μL 6×Loading Buffer，使用质量分数为1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，电压5 V/cm，电泳液为1×TAE。如果扩增条带在1500 bp处清晰并且没有拖尾、弥散现象，说明PCR扩增成功。将PCR 扩增产物送往生工生物工程(上海)股份有限公司成都测序部进行双向测序。

1.3.3.4 16S rRNA基因同源性比对

使用DNA Star 5.01 软件中的SeqMan模块对测序得到的两条16S rRNA基因序列进行整理、拼接、校准，得到1450 bp左右的有效序列。然后将拼接后的序列运用NCBI(National Center for Biotechnology Information)中的同源性比对工具BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)将所得测序结果与GenBank上已知地位的醋酸菌株进行对比，并结合形态学特征确定待测菌株种属。

1.3.3.5 系统发育树的构建

将与菌株CS-63对应的16S rRNA基因序列从GenBank中下载下来，然后运用Clustal W多重比对得到菌株间的同源性相似百分比。再使用MEGA 5.2软件构建系统发育树，通过邻接法(Neighbor-Joining)进行系统发育分析，并进行1000次重复的Boot-straps统计检验。

1.3.4 醋酸菌培养条件优化

1.3.4.1 不同培养基对菌株产酸量的影响

配制好培养基，在121 ℃下灭菌15 min，冷却后将菌株分别接种于基础培养基、发酵培养基和YPG培养基中，于30 ℃下静置培养5 d，取2 mL发酵液，测定产酸量，每组设置3个平行。

醋酸菌株产酸量的测定与计算：检测方法参照李文等的测定方法[12]。

1.3.4.2 不同乙醇浓度对菌株产酸量的影响

将发酵培养基在121 ℃下灭菌15 min，无菌条件下冷却到室温，向培养基中加入无水乙醇，使培养基乙醇的终浓度为 3%、4%、5%、6%、7%，将菌株CS-63分别接种于不同乙醇浓度的培养基中，每个乙醇浓度设定3组平行试验，在30 ℃下静置培养 5 d，取2 mL发酵液，测定产酸量。

1.3.4.3 不同培养温度对菌株产酸量的影响

设定培养温度梯度分别为 4，25，30，37，41 ℃，其他条件不变，静置培养5 d，每个温度设定3组平行，取2 mL发酵液，测定产酸量。

1.3.4.4 不同pH对菌株产酸量的影响

用0.1 mol/L NaOH溶液和0.1 mol/L HCl溶液将培养基的pH分别调成3，4.5，5.5，6.5，7.5，其他条件不变,在30 ℃条件下静置培养5 d，取2 mL发酵液，测定产酸量，每个pH设置3组平行。

1.3.4.5 正交试验分析表

在上述单因素试验的基础上，将培养基、pH、温度和乙醇浓度设为试验因素，利用L9(34)正交试验，根据菌株产酸量的多少，分析各因素对醋酸产量的影响，优化菌株CS-63的培养条件。正交试验因素水平表见表1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 The factors and levels of orthogonal test

2 结果与分析

2.1 菌珠的鉴定

2.1.1 理化鉴定

菌株CS-63的生理生化试验结果见表2。

表2 醋酸菌理化鉴定结果Table 2 The physicochemical identification results of Acetobacter

由表2可知，菌株CS-63革兰氏染色为阴性，能够产酸，能够利用乙醇；氧化酶、接触酶和葡萄糖氧化试验为阳性，不能使淀粉水解，由此初步鉴定结果可以判定其为醋酸杆菌属。

2.1.2 16S rRNA鉴定

2.1.2.1 菌种DNA提取及16S rRNA扩增结果

DNA浓度和OD260/280的测定：纯DNA样品的OD260/280值在1.8～2.0之间。经过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测见图1。

图1 PCR反应结果图Fig.1 PCR reaction results

由图1可知，疑似醋酸菌菌株的PCR扩增后在大约1500 bp处有一条清晰明亮的条带，并且没有弥散现象和明显非特异扩增现象，说明菌株的16S rRNA基因扩增产物可以满足测序的要求。

2.1.2.2 系统发育树的构建与分析

为了鉴定待测菌株，通过BLAST在NCBI中分析所有待测菌株的16S rRNA基因的核苷酸序列，以与模式菌株序列同源性大于99%为种的鉴定阈值，通过MEGA 5.2构建醋酸菌模式株和分离株系统发育关系研究和系统进化树，见图2和图3。

图2 菌株CS-63同源性分析Fig.2 Homology analysis of CS-63 strain

图3 菌株CS-63系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of CS-63 strain

通过序列对比、系统发育树及同源性分析发现，菌株CS-63与模式菌株Acetobactersyzygii(HM217935.1/HM218259.1)聚为一类，且同源性达到99.9%，与它们亲缘关系最近，因此可以将菌株CS-63归为蒲桃醋酸杆菌(Acetobactersyzygii)。

2.2 醋酸菌培养条件的优化

2.2.1 不同培养基对菌株产酸量的影响

图4 不同培养基对菌株产酸量的影响Fig.4 Effects of different culture media on the acid yield of the strain

由图4可知，YPG培养基中产量最低，为0.45 g/L。发酵培养基和基础培养基中都含有酵母浸提物和葡萄糖两种共同成分，且比例相同，但发酵培养基中含有蛋白胨，而基础培养基中不含有，由此可推测发酵培养基中的蛋白胨对该菌株的产酸可能具有促进作用；YPG培养基和发酵培养基含有共同的成分：酵母浸提物、葡萄糖和蛋白胨，但这3种营养物质的比例不同，在发酵培养基中这3种物质的比例是10∶10∶3，在YPG培养基中的比例是5∶3∶2，由此可推测培养基中营养物质的比例不同也可能影响菌株CS-63的产酸特性。

2.2.2 不同乙醇浓度对产酸量的影响

图5 不同乙醇浓度对菌株产酸量的影响Fig.5 Effects of different ethanol concentrations on the acid yield of the strain

由图5可知，随着乙醇浓度的增大，菌株CS-63的产酸量呈先上升后下降的趋势。菌株在乙醇体积分数为起始浓度3%时，醋酸菌产酸量为3.45 g/L；当乙醇浓度增大到4%时，菌株产酸量达到峰值，为4.65 g/L；当培养基的乙醇浓度达到5%后菌株产酸量开始下降，当乙醇体积分数达到6%时产酸量下降明显，这可能是由于酒精有抑制细菌生长的作用，无水乙醇含量过高会抑制醋酸菌的繁殖代谢，导致菌株CS-63产酸量下降，因此菌株CS-63产酸的最佳乙醇体积分数为4%。谭才邓等[13]、孙万里[14]对腐烂水果中醋酸菌的产酸量进行分析，结果发现当乙醇浓度为4%时菌株产酸量最大，与本研究结论一致；李华敏等[15]对苹果醋中醋酸菌的产酸量进行分析，结果发现菌株产酸的最佳乙醇浓度为6%，与本研究的结论有所出入，这可能是由于不同的菌株生长有不同的营养需求。

2.2.3 不同培养温度对产酸量的影响

图6 不同培养温度对菌株产酸量的影响Fig.6 Effects of different culture temperatures on the acid yield of the strain

由图6可知，菌株CS-63的产酸量随着温度的升高呈现先上升后下降的趋势。该菌株在4 ℃时几乎不产酸，这可能是由于在该温度下，醋酸菌几乎不能生长；在30 ℃时产酸量达到峰值，为2.48 g/L；当温度超过30 ℃，产酸量出现下降趋势；当温度升高到41 ℃时，产酸量只有0.75 g/L，这可能是由于过高的温度抑制了醋酸菌的生长，且高温也会对酶的活性产生影响，因此可得知该菌株产酸的最佳温度是30 ℃。武斌等[16]研究了巴氏醋杆菌在不同温度下的产酸特性，结果表明30 ℃是该菌株的最适培养温度；卢梦瑶等[17]研究了酵素中醋酸菌对不同温度的适应性，结果表明在30 ℃时产酸量最高，均与本研究结论相一致。

2.2.4 不同pH值对产酸量的影响

图7 不同pH对菌株产酸量的影响Fig.7 Effects of different pH values on the acid yield of the strain

由图7可知，菌株CS-63的产酸量随着pH的升高呈现先上升后下降的趋势，pH为3时产酸量最少，为2.55 g/L；当pH升高到5.5时，产酸量达到峰值，为18.45 g/L；当pH达到6.5后，产酸量急剧下降，当pH继续升高达到7.5时，产酸量只有7.95 g/L。该菌株在pH过高或过低时产酸量均很低，说明该菌株在过酸、过碱环境下不宜生长繁殖和代谢，且机体中的大多数反应与酶有关，过酸、过碱都会导致酶活力降低，从而导致产酸速率和产酸量下降，由此可知菌株CS-63产酸的最佳pH为5.5．刘晓栋等[18]研究了醋酸菌As1.41在不同pH条件下的最高产酸量，结果发现当pH为5.5时菌株产酸量达到最大，均与本研究结论相一致。

2.3 正交试验结果分析

表3 以醋酸菌产量为检测指标的正交试验结果表Table 3 The orthogonal test results with acetic bacteria yield as the detection index

由表3可知，各因素影响菌株CS-63产酸的主次顺序为pH>乙醇浓度>培养基>培养温度，得出最佳工艺条件为A3B1C1D3。由正交表得到的最佳工艺参数为A3B1C1D3，与试验中产酸量最高的第7组A3B1C2D3不相符，因此需要验证试验A3B1C1D3和A3B1C2D3。

验证试验结果：组合A3B1C1D3的产酸量为15.4 g/L，组合A3B1C2D3的产酸量为14.7 g/L，即A3B1C1D3组优于A3B1C2D3组。因此可得醋酸菌CS-63的最佳产酸条件为：25 ℃下在乙醇浓度为5%，pH 4.5的发酵培养基中培养。

3 结论

本研究以菌株CS-63为对象，采用生理生化特征与16S rRNA保守序列分析相结合的方法对其进行鉴定，最终确定其为蒲桃醋酸杆菌(Acetobactersyzygii)；对该菌株的培养条件进行优化，分别研究了菌株CS-63在不同培养基、乙醇浓度、培养温度和pH下的产酸量，并以不同培养基、乙醇浓度、培养温度和pH为试验因素进行正交分析，最终得出该菌株的最佳产酸培养条件为：25 ℃下在乙醇浓度为5%，pH 4.5的发酵培养基(葡萄糖1%，蛋白胨0.3%，酵母提取物1%)中培养。

目前对蒲桃醋酸杆菌的研究鲜少，本文对该菌株的鉴定及最适产酸条件的研究，可为后续该菌株在实际应用中提供数据支撑，同时也为工艺上采用纯菌发酵奠定基础，但本研究只选取了4个影响因素来研究该菌株的产酸特性，具有一定局限性，为更好地将其应用到实际生活中，日后还可对该菌株进行更加全面的研究，探索其他影响因素对其生长繁殖和产酸的影响，比如接种量、不同碳源、初始乙酸浓度、矿化度等；或研究该菌株的酒精转换率、遗传稳定性等；或经诱变得到耐高温、耐高乙醇、耐高乙酸的菌种。