调味香料桂丁中黄酮类化合物的提取、纯化及抗氧化活性研究

杜丽霞，姜子涛,2*，肖建军，白甜甜

(1.天津天狮学院 食品工程学院，天津 301700；2.天津商业大学 生物技术与食品科学学院，天津 300134)

桂丁(Fructuscinnamomi)是一种常被用于辣味火锅底料及卤料中的调味香辛料，往往与其他香辛料配合使用，起到去腥、增香的作用。桂丁，别名桂丁香、肉桂子、桂子，为樟科植物肉桂树10—11月份采摘未成熟的果实晒干而成，主要产地为中国福建、台湾、海南、广东、广西、云南等地的热带及亚热带地区，其中尤以广西栽培为多，大多为人工纯林。桂丁具有温里散寒、止痛、止呃之功效，常用于治疗心胸疼痛、胃腹冷痛、恶心、嗳气、呃逆、呕吐以及肺寒咳喘。目前，国内外对桂丁的研究主要集中在挥发油的分析[1-4]以及醇提物的抗氧化活性[5-6]方面，而对其他活性成分的研究较少，尤其是提取和纯化桂丁黄酮类化合物的研究鲜有报道。因此，本研究以桂丁为原料，探究其中黄酮类化合物的提取条件、纯化条件以及清除DPPH自由基的能力，为调味香料桂丁的进一步开发利用提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

桂丁：广西壮族自治区玉林市；DPPH：美国Sigma-Aldrich公司；芦丁标准品：上海源叶生物科技有限公司；无水乙醇：廊坊市拓迪化工有限公司；5种类型大孔树脂：天津南大树脂科技有限公司，使用前按照文献[7]进行预处理；所用试剂均为分析纯，试验用水均为去离子水。

CW-2000超声-微波协同萃取/反应仪 上海新拓分析仪器科技有限公司；N-1100V-WD旋转蒸发仪 日本东京理化器械株式会社；UV1000单光束紫外可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 桂丁黄酮提取工艺条件的优化方法

按照参考文献[8]中的方法绘制芦丁标准曲线，提取和测定桂丁中黄酮类物质的含量[9]。通过设计四因素五水平的单因素试验，分别探究了提取时间(20，40，60，80，100 min)、提取温度(40，50，60，70，80 ℃)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g/mL)以及乙醇浓度(40%、50%、60%、70%、80%)对桂丁黄酮得率的影响，得到各因素下的优水平，然后通过L9(34)正交试验进一步优化，得到桂丁黄酮的最佳提取工艺条件。

1.2.2 桂丁黄酮纯化工艺条件的优化方法

用最佳提取工艺条件得到桂丁黄酮粗提液，经冷冻干燥后，用少量乙醇溶解，用水配制成浓度为1 mg/mL的工作液，用于后续纯化条件的优化。通过静态吸附和解吸试验[10]从5种不同型号的大孔树脂(HPD-100、HPD-600、AB-8、DM130、D101)中筛选出适合桂丁黄酮纯化的大孔树脂，采用静态法优化了上样液pH(2，4，6，8)及洗脱液乙醇浓度(30%、40%、50%、60%、70%)，采用动态法[11]优化了上样流速(1.0，1.5，2.0 BV/h)及洗脱流速(1.0，1.5，2.0 BV/h)，最终得到桂丁黄酮的最佳纯化工艺方案。

1.2.3 评价桂丁黄酮抗氧化活性的方法

对参考文献[12]中的方法略作修改，配制不同浓度梯度经最佳条件纯化后的桂丁黄酮溶液，各取0.6 mL与6 mL 0.6 mmol/L DPPH溶液混匀后，在避光条件下反应30 min，在517 nm下测定吸光度值，计算各浓度桂丁黄酮的清除率，得到清除率曲线，最后计算IC50值，同法测定天然抗氧化剂维生素C(Vc)的IC50值，通过比较两者大小，评价桂丁黄酮的抗氧化活性。

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线

按照1.2.1中的方法绘制芦丁标准曲线，得到回归方程为y=0.4374x+0.0038，R2=0.9993，桂丁黄酮提取液的浓度均用以上方程进行计算。

2.2 提取桂丁黄酮的单因素试验结果

桂丁黄酮的单因素试验结果见图1。

图1 单因素对桂丁黄酮得率的影响Fig.1 Effect of various factors on the extraction rate of Fructus cinnamomi flavonoids

由图1中a可知，在一定时间内，提取时间越长，越有利于黄酮类物质的充分溶出，得率随之提高，但当提取时间超过80 min时，桂丁黄酮得率反而下降，这是因为超声波作用时间过长，导致不稳定的黄酮类化合物开始快速分解，而使得率下降，因此选择80 min为最佳提取时间。由图1中b可知，当提取温度由40 ℃升高至70 ℃时，黄酮得率随之快速提高，这是由于提高提取温度，能加速分子运动，促进黄酮物质从细胞中溶出，但当提取温度升至80 ℃时，过高的温度会加速黄酮物质的氧化分解，得率降低，因此选择70 ℃为最佳提取温度。由图1中c可知，料液比为1∶40(g/mL)时，桂丁黄酮得率达到最高，当料液比过小时，提取溶剂量过少，黄酮物质在溶剂中饱和后便不再溶出，而当料液比过高时，提取溶剂量过多，反而不利于超声波的传导，使黄酮得率降低，因此选择1∶40(g/mL)为最佳料液比。由图1中d可知，乙醇浓度为50%时，桂丁黄酮得率最高，当乙醇浓度过低时，醇溶性黄酮无法被充分溶出，而当乙醇浓度过高时，水溶性黄酮又无法被充分溶出，因此选择50%为最佳乙醇浓度。

2.3 提取桂丁黄酮的正交试验结果

表1 正交试验结果Table 1 The results of orthogonal test

由表1正交试验结果可知，对桂丁黄酮得率影响最大的提取因素是提取时间，然后是乙醇浓度和提取温度，影响最小的是料液比。桂丁黄酮的最佳提取工艺条件为：乙醇浓度50%、料液比1∶50(g/mL)、提取时间60 min、提取温度60 ℃。在此条件下平行提取3次，得到的桂丁黄酮得率分别为10.50%、10.59%、10.56%，平均值为10.55%。

2.4 优化桂丁黄酮纯化工艺条件的试验结果

2.4.1 大孔树脂的筛选结果

5种大孔树脂的筛选结果见表2。

表2 大孔树脂的筛选结果Table 2 The screening results of macroporous resins

由表2可知，型号为AB-8的大孔树脂对桂丁黄酮的吸附和解吸效果均最佳，因此选择大孔树脂AB-8来分离纯化桂丁中的黄酮类化合物。大孔树脂法由于溶剂消耗量小、设备简单、能再生利用、成本低廉而早已被广泛地应用于植物类黄酮的分离纯化中，其中AB-8型号大孔树脂在许多种植物类黄酮中均表现出较好的纯化效果[13-15]。

2.4.2 最佳上样液pH值的确定

图2 上样液pH值对树脂吸附桂丁黄酮效果的影响Fig.2 Effect of pH value of loading solution on adsorption of Fructus cinnamomi flavonoids by resins

由图2可知，上样液pH为4时，吸附后上清液中残留的黄酮吸光度值最低，说明大孔树脂在pH为4时对桂丁黄酮的吸附能力最强。当pH低于4时，桂丁黄酮以分子状态存在，极性大大降低，而AB-8大孔树脂为弱极性，具有一定亲水性，因此吸附效果降低；而当pH高于4时，随着pH的升高，桂丁黄酮的存在形式逐渐向盐转变，极性过大，树脂的吸附效果逐渐降低。

2.4.3 最佳洗脱液乙醇浓度的确定

图3 洗脱液乙醇浓度对桂丁黄酮洗脱效果的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration of eluent on the elution effect of Fructus cinnamomi flavonoids

洗脱液的乙醇浓度是影响洗脱效果的主要因素。由图3可知，随着洗脱液乙醇浓度的增大，从大孔树脂解吸下来的桂丁黄酮吸光度值先增大后减小，当乙醇浓度为50%时吸光度值最高，说明此条件下解吸效果最好。洗脱液乙醇浓度过小时，极性过大，乙醇浓度过大时，极性又过小，均不能充分地将桂丁黄酮从大孔树脂上洗脱下来。

2.4.4 最佳上样流速的确定

图4 上样流速对桂丁黄酮吸附效果的影响Fig.4 Effect of loading flow rate on the adsorption effect ofFructus cinnamomi flavonoids

由图4可知，当上样流速为1.0 BV/h时，样液流经大孔树脂内部的速度过慢，接触面积减小，降低黄酮吸附率，因此最先达到泄漏点。当上样流速为2.0 BV/h时，由于流速过快，导致黄酮与大孔树脂的作用时间较短而吸附不完全，泄漏点出现较快。当上样流速为1.5 BV/h时，泄漏点出现的最晚，说明此流速下，黄酮能充分地吸附在树脂上，上样效果最佳。

2.4.5 最佳洗脱流速的确定

图5 洗脱流速对桂丁黄酮洗脱效果的影响Fig.5 Effect of elution flow rate on the elution effect ofFructus cinnamomi flavonoids

由图5可知，当洗脱流速为1.5 BV/h时，洗脱下来的桂丁黄酮所呈现的峰形较窄，峰值较高，洗脱效果最佳。当洗脱流速过快时，洗脱液与树脂作用不充分，洗脱效果不佳。当洗脱流速过慢时，虽洗脱充分，但黄酮容易扩散，导致峰形较宽，峰高降低，纯化效果不佳。

2.5 桂丁黄酮抗氧化活性的评价

图6 桂丁黄酮及Vc的清除率曲线Fig.6 The curves of scavenging rates of Fructus cinnamomi flavonoids and Vc

由图6可知不同浓度下桂丁黄酮及Vc对DPPH自由基的清除率结果。分别对其进行多变量拟合，得到桂丁黄酮及Vc的清除率曲线，并据此计算出桂丁黄酮和Vc的IC50值分别为82.11 μg/mL和45.55 μg/mL。可见桂丁黄酮在一定浓度具有较强的抗氧化作用，但其抗氧化活性比Vc差；与文献[5]比对发现，其抗氧化活性高于生姜、中药茴香籽、陈皮、砂仁和山奈等调味香料。

3 结论

采用超声波辅助提取法提取调味香料桂丁中的黄酮类化合物，得到的最佳提取条件是：乙醇浓度50%、料液比1∶50(g/mL)、提取时间60 min、提取温度60 ℃，桂丁黄酮的得率为10.55%。用大孔树脂法分离纯化桂丁中的黄酮类化合物，得到的最佳纯化条件是：上样流速1.5 BV/h、洗脱流速1.5 BV/h、上样液pH值4、洗脱液乙醇浓度50%，在此条件下，其纯度由30.1%提高至62.6%。同时，通过清除DPPH自由基试验，以天然抗氧化剂Vc作参比，评价桂丁黄酮的抗氧化活性，结果显示：桂丁黄酮的抗氧化活性虽然比Vc弱，但仍表现出一定的抗氧化作用，且活性比部分天然香辛料强。