枸杞低聚糖体外抗氧化活性及增殖益生菌能力研究

刘 昊 崔 波 于 滨

(1. 齐鲁工业大学〔山东省科学院〕生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，山东 济南 250353;2. 齐鲁工业大学〔山东省科学院〕食品科学与工程学院，山东 济南 250353)

作为中国传统的“药食同源”植物，枸杞中含有丰富的活性物质[1]，其中枸杞多糖具有增强免疫力[2]、抗氧化[3]、平衡肠道菌群[4-5]等生物功能，可有效预防糖尿病等慢性代谢疾病的发生[6-7]。有学者[8-10]指出，植物多糖所表现出的生理活性与其结构和空间构象密切相关。枸杞多糖分子结构复杂、水溶性差，从而导致其在食品、农业和医药等领域的应用受到限制。但枸杞多糖降解后得到的低聚糖不仅分子量小、水溶性强，还具有刺激肠道中某些有益菌生长的生理功能[11]。Zhang等[12]研究了枸杞多糖—蛋白质复合物的聚糖部分的体外免疫性能，发现该部分对脾细胞、T细胞、B细胞和巨噬细胞有免疫刺激作用。Jiang等[13]使用H2O2水解制备了枸杞低聚糖，在100 mg/mL的质量浓度下枸杞低聚糖对羟基自由基清除活性达86.46%。

黄河三角洲区域内有大面积中低产盐碱地，生长在此区域盐碱地的枸杞整体表现出较强的抗盐性，如宁夏枸杞和黑果枸杞均为高抗品种[14]。耐盐碱枸杞不仅在盐碱地治理方面表现良好[15]，还具有独特的药理活性[16]，因此具有很大的研究价值。目前，利用多糖降解的方法制备耐盐碱枸杞低聚糖，研究其生理活性尚未见诸于报道。

研究拟以黄河三角洲盐碱地的枸杞作为研究对象，通过酸和酶联合降解法制备枸杞低聚糖，分别测定其DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基的清除能力和对肠道益生菌的增殖能力，从而评估低聚糖的体外抗氧化活性和维持肠道菌群平衡的能力，旨在实现黄河三角洲盐碱地枸杞的高效利用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枸杞：采摘于黄河三角洲盐碱地；

枸杞低聚糖(LBO)、枸杞多糖(LBP)：齐鲁工业大学生物基材料与绿色造纸国家重点实验室；

抗坏血酸(VC)：上海源叶生物科技有限公司；

2,2-联苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-二氮-双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)铵盐(ABTS+)、三氟乙酸(TFA)、石油醚：上海麦克林生化科技有限公司；

氯仿、正丁醇、碳酸钠(Na2CO3)、水杨酸、过硫酸钾(K2S2O8)、硫酸亚铁(FeSO4)、过氧化氢(H2O2)、铁氰化钾(K3[Fe(CN)6])、无水乙醇、95%乙醇、磷酸盐缓冲液(PBS)、三氯乙酸(TCA)、三氯化铁(FeCl3)、生理盐水：国药集团化学试剂有限公司；

Tris-盐酸缓冲液：Sigma-Aldrich(上海)贸易有限公司；

硫酸(H2SO4)：烟台远东精细化工有限公司；

链霉蛋白酶(Pronase E)：北京索莱宝科技有限公司；

青春双歧杆菌(BifidobacteriumadolescentisCGMCC.1.2190)、培养基CM0233：中国共同微生物收集与管理中心；

所有溶剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

分析天平：FA2004型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

小型粉碎机：FSJ-A05N6型，广东小熊电器有限公司；

离心机：TDL-40B型，上海安亭科学仪器厂；

旋转蒸发器：RE2000A型，上海贤德实验仪器有限公司；

集热式恒温加热磁力搅拌器：DF-101S型，郑州科泰实验设备有限公司；

电热恒温水浴锅：HH-21-8型，常州诺基仪器有限公司；

真空冷冻干燥机：JXDG-10型，上海净信实业发展有限公司；

涡旋振荡器：MixTable型，合肥艾本森科学仪器有限公司；

厌氧培养箱：LAI-3T型，上海龙跃仪器设备有限公司；

pH计：FE28型，梅特勒—托力多仪器(上海)有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-6100型，上海元析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞多糖的制备 参照Ding等[17]的方法并稍作修改。枸杞洗净后烘干，用粉碎机粉碎，过筛备用。定量称取枸杞粉，经石油醚加热回流重复脱脂3次，烘干，按料液比(m枸杞粉∶V蒸馏水)为1∶3的比例混匀后置于90 ℃水浴提取2 h，过滤，取上清液，以3 000 r/min离心2次，合并上清液。采用旋转蒸发器真空浓缩至1/4体积，冷却至室温。加入1/5体积Sevag试剂(V氯仿∶V正丁醇=4∶1)，剧烈振摇，使其充分混匀，3 000 r/min离心，倾出上清液，除去中间变性蛋白和下层氯仿，重复以上操作直至中间层无变性蛋白，收集上清液加入4倍体积的95%乙醇沉淀，静置24 h，滤布过滤，冷冻干燥后得到枸杞多糖(LBP)。

1.3.2 枸杞低聚糖的制备 参照Zhang等[12]的方法并稍作修改。定量称取LBP、Pronase E (mLBP∶mPronase E=1∶2)，加入0.1 mol/L的Tris-盐酸缓冲液混合均匀，将混合液置于60 ℃水浴体系中以灭活可能存在的酶。根据原始LBO样品的重量，依次向样品体系液中加入1.0% 和0.5%(质量分数)的Pronase E，体系pH调至8.0左右，室温下消化24～48 h。消化结束后对所得样品体系依次进行Sephadex G-100纯化和Sephadex G-25除盐，取部分样品加入40 mmol/L H2SO4，80 ℃搅拌反应，10 h后取样，滴加0.25 mol/L Na2CO3溶液对反应进行中和，然后用蒸馏水透析72 h，收集袋内浓缩液，加入0.5 mol/L TFA，80 ℃反应4 h，蒸馏水浓缩数次，直至浓缩液pH为中性，冷冻干燥后得到枸杞低聚糖(LBO)。

1.3.3 DPPH自由基清除能力测定 参照文献[18]并稍作修改，定量称取LBO，分别配制成质量浓度为0.1，0.2，0.3，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 mg/mL的待测溶液，每次测定均取LBO溶液2 mL，加入同等体积的0.08 mmol/L DPPH溶液，充分振荡，避光于室温下反应30 min，反应结束后测定517 nm处的吸光度。用无水乙醇设置空白对照。按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

P——自由基清除率，%；

A0——空白溶液的吸光度；

A1——样品溶液的吸光度。

1.3.4 ABTS自由基清除能力测定 参照文献[19]并稍作修改。按照1.3.2中的方法配制LBO样品待测液。ABTS+工作液配制方法：等体积混合现配制的7.4 mmol/L ABTS+溶液及2.6 mmol/L K2S2O8溶液，置于2～6 ℃下避光12 h后备用。每次试验开始前，用0.2 mol/L，pH=7.4的PBS溶液对ABTS+工作液进行稀释处理，将734 nm吸光度控制在(0.70±0.02)方可使用。取LBO溶液1 mL，加入2倍体积的ABTS+工作液，充分振荡，避光于室温下反应6 min，反应结束后测定734 nm处的吸光度。用蒸馏水设置空白对照。按式(1)计算ABTS自由基清除率。

1.3.5 羟基自由基清除能力测定 参照文献[20]并稍作修改。按照1.3.2中的方法配制LBO样品待测液，分别取LBO待测溶液1 mL，先后加入同等体积的9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L的水杨酸—乙醇溶液和8.8 mmol/L 的H2O2溶液，充分振荡，避光于室温下水浴30 min，反应结束后测定510 nm处的吸光度。用蒸馏水设置空白对照。按式(1)计算羟基自由基清除率。

1.3.6 总还原能力测定 参照文献[21]并稍作修改。按照1.3.2中的方法配制LBO样品待测液，分别取不同浓度的LBO溶液1 mL，先后加入1 mL 0.2 mol/L PBS缓冲液(pH 6.6)和0.125 mL 体积分数为1%的K3[Fe(CN)6] 溶液，充分震荡，避光于50 ℃下水浴20 min后，先后加入体积分数为10%的TCA和0.1%的FeCl3溶液以终止反应，充分振荡，测定700 nm处的吸光度。用蒸馏水设置空白对照。

1.3.7 对益生菌的增殖效应

(1) 菌种的活化：试验在无菌环境下进行，定量称取少量青春双歧杆菌制剂胶囊中的冻干菌粉，加入无菌生理盐水，重悬菌体。以0.1%的接菌量接种于10 mL活化培养基中，振荡均匀，37 ℃厌氧环境下培养，进行2次传代，重悬菌体并进行接种，18 h后得菌种母液。

(2) 生长曲线的测定：参照文献[22]并稍作修改。以相同质量浓度的LBO代替基础培养基中的葡萄糖作为试验培养基，113 ℃湿热灭菌20 min，取菌种母液以0.1% 的接菌量接种于试验培养基中。37 ℃厌氧培养48 h，分别在第0，2，4，6，8，10，12，16，18，20，24，48 h时取样，测定600 nm处的菌体浓度和pH值。同时以LBP代替相同体积的葡萄糖作为对照组以培养时间和对应的OD600 nm吸光度绘得生长曲线。

1.4 数据统计分析

所有试验均重复3次，数据以平均值±标准误差表示。数据采用Excel 2010进行统计分析，SPSS 20.0软件进行处理，并用Origin Pro 8.5进行绘图。

2 结果与分析

2.1 DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一种含有单一电子的含氮有机自由基，它会使乙醇溶液呈现较深的暗紫色，在517 nm波长处表现出明显的吸收峰[23]。抗氧化剂的加入能够与DPPH自由基相结合，溶液的颜色则会由最初的紫色向黄色发生明显的变化，抗氧化剂的DPPH自由基清除能力可以通过紫外光吸收的弱化程度来判定，通常DPPH自由基清除率与氧化剂的抗氧化能力呈正比。由图1可知，LBO有一定的DPPH自由基清除能力，LBO的抗氧化能力随LBO浓度先升高后下降。就平均抗氧化能力而言，LBO抗氧化水平不及LBP和VC。综上，过高浓度的LBO不易向DPPH自由基提供电子或者质子，与DPPH自由基的结合率降低。

图1 不同质量浓度LBO的DPPH自由基清除能力Figure 1 DPPH radical scavenging ability of LBO with different mass concentrations

2.2 ABTS自由基清除能力

ABTS+溶剂本身呈现蓝绿色，在734 nm处有明显的吸收峰。抗氧化剂的加入会使ABTS+在此波长处的吸光度降低，同时，溶剂的蓝绿色会明显褪去，褪色程度越高，则表示氧化剂的抗氧化性越强[24]。由图2可知，在0.1～1.0 mg/mL质量浓度范围内，ABTS自由基清除率随着LBO质量浓度增加而升高，当LBO的质量浓度为2.0 mg/mL时，ABTS自由基清除率最高，达(99.93±0.05)%，此后ABTS自由基清除率维持在最高值左右。LBP的ABTS自由基清除率达到最高值后随着LBP质量浓度的增加而略微下降，这一现象可能与多糖分子量大小和聚合度相关，LBO表现出比LBP更稳定的抗氧化性。

图2 不同质量浓度LBO的ABTS自由基清除能力Figure 2 ABTS+ scavenging capacity of LBO with different mass concentrations

2.3 清除羟基自由基的能力

羟基自由基是人体中自由基的主要来源，由多态性反应产生。过量的羟基自由基会对体内的生物大分子造成损害[25]。清除羟基自由基是抗氧化防护过程中极其重要的一环。由图3可知，LBO有显著的羟基自由基清除能力，随着LBO质量浓度的升高其清除羟基自由基的能力增强，当质量浓度为2 mg/mL时，LBO和LBP的羟基自由基清除率均达到最高值，但低于VC对羟基自由基的清除率。这3种物质抗氧化性的大小顺序为：VC>LBO>LBP。

图3 不同质量浓度LBO的羟基自由基清除能力Figure 3 Hydroxyl radical scavenging ability of LBO with different mass concentrations

2.4 总还原能力

抗氧化剂的总还原能力是衡量机体抗氧化性能的一项重要指标。K3Fe(CN)6能够被抗氧化剂还原成K4Fe(CN)6，使之与Fe3+发生反应得到普鲁士蓝，并在700 nm处出现了强吸收峰，通过吸光度可以测定出Fe3+被还原成Fe2+的程度，从而根据最终产物生成量来判断抗氧化剂的抗氧化能力[26]。由图4可知，VC的总还原能力与其质量浓度呈正相关，与VC还原力相比，LBO与LBP整体的总还原力较低，最大总还原力基本达到VC的25%。当LBO的质量浓度为0.1～0.5 mg/mL时，总还原力随其浓度的增加而上升，继续增加质量浓度还原力不再升高。当样品质量浓度为3.0 mg/mL时，LBO与LBP的总还原力相当，吸光度为(0.191±0.010)。

图4 LBO的总还原力评价Figure 4 Evaluation of total reducing activity of LBO

2.5 LBO对益生菌的增殖效应

由图5可知，在相同的质量浓度下，LBO比LBP更有利于青春双歧杆菌的增殖。双歧杆菌经LBO培养6 h后进入对数生长期，在此期间双歧杆菌迅速繁殖。而葡萄糖培养基中双歧杆菌停滞期较长，培养10 h后才进入对数生长期。培养18 h后，葡萄糖培养基的双歧杆菌生长达到稳定期，6 h后LBO培养基的菌体也进入稳定期。此后菌体进入衰亡期，菌体浓度不再变化。结果表明，LBO培养基的双歧杆菌进入对数期速率比LBP和葡萄糖培养基中的双歧杆菌快，并且最终LBO培养基的菌体浓度比LBP培养基的高。LBP与空白的培养基相比，双歧杆菌的生长速率更高，传代时间更短。此外，由图6可知，除空白组外，其他3组菌液pH值均呈显著下降趋势，且随着双歧杆菌菌体浓度的提高，pH值不断降低，在培养16 h后pH值趋于稳定。培养2 h后，LBO与葡萄糖培养基菌液的pH值下降速度最快，可能是由于双歧杆菌在LBO培养基中进行增殖代谢，产生了短链脂肪酸，在这一时期内产酸量要高于以LBP和无碳源的基础培养基，这与OD值相对应，表明LBO可促进双歧杆菌较快进入对数生长期，表现出较好的增殖效应。

图5 青春双歧杆菌生长曲线Figure 5 Growth curve of Bifidobacterium adolescentis

图6 青春双歧杆菌生长过程中pH的变化Figure 6 Changes of pH during the growth of Bifidobacterium adolescentis

3 结论

研究表明枸杞低聚糖有较强的DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基清除能力和总还原力，由此可知枸杞低聚糖具有良好的体外抗氧化活性。同时，以青春双歧杆菌益生菌作为考察对象，发现枸杞低聚糖能促进青春双歧杆菌益生菌增殖。基于上述研究结果，从饮食营养干预的角度考虑，枸杞低聚糖有助于提高机体的抗氧化和抗炎能力，这为其发展成为功能性食品提供了重要的理论依据，有助于研究者更好地发掘黄河三角洲盐碱地枸杞的利用价值和经济效益。后续可进一步通过动物试验探究枸杞低聚糖对机体内部的作用机理及干预路径。