倏逝波光纤传感器快速检测诺氟沙星

卓雨欣,徐文娟,程 源,宋 丹,韩向峙,龙 峰

倏逝波光纤传感器快速检测诺氟沙星

卓雨欣,徐文娟,程 源,宋 丹,韩向峙,龙 峰*

(中国人民大学环境学院,北京 100872)

基于间接竞争免疫分析原理,利用倏逝波光纤生物传感平台研发了一种诺氟沙星检测方法,实现了水中诺氟沙星的快速､灵敏检测.研究表明,诺氟沙星检测的优化条件为:抗体浓度为1μg/mL､预反应时间为1min,反应时间为4min.优化条件下,诺氟沙星检测限可达1.89μg/L.包被抗原修饰的光纤探头与荧光标记诺氟沙星抗体具有良好的特异性和稳定性,可重复使用400次以上.自来水､景观水､二沉池出水等水样的加标回收实验结果表明,该传感器具有良好的精密度和准确性,受环境基质的影响较小,能够用于实际水样中诺氟沙星的快速检测.

诺氟沙星；抗生素；倏逝波生物传感器；免疫分析；环境监测

诺氟沙星(norfloxacin, NOR)为第三代喹诺酮类抗生素,在临床医学、畜禽养殖、水产养殖等领域被广泛应用.地表水、地下水、饮用水、河流底泥及土壤等环境介质中都频繁地检出NOR[1-3].环境中的NOR除了会诱导“超级细菌”的产生,导致抗药性[4],还具有“三致效应”等危害,其生态毒理效应正在逐渐凸显[5-7].研究显示,ppb级的NOR就可能对生态环境产生显著影响.高灵敏检测NOR是实现其有效处理处置的前提条件[8].目前NOR的主要检测技术包括色谱-质谱检测法[9-10]、微生物测定法[11]及免疫测定法[12]等.然而,各种方法都存在不同的局限性,如预处理复杂、检测成本高、耗时长、存在假阳性、无法实现原位检测等.因此,发展适用于NOR现场高灵敏快速检测的新方法势在必行.

近年来,生物传感器因具有高特异性、高灵敏度、快速、可适用现场检测等优势,已成为环境监测、食品安全、医疗诊断等领域的发展前沿[13-14],其中,倏逝波光纤生物传感器是结合生物亲和反应原理,利用光波在光纤中以全内反射方式进行传播时形成的倏逝波可激发结合到其表面的荧光分子标记生物分子,根据荧光强度与待测物浓度的线性关系来实现其定量检测[15].倏逝波光纤生物传感器因具有检测速度快,灵敏度高、体积小、质量轻、抗电磁干扰、可重复利用等特点[16],已被广泛应用于小分子有机污染物[17]、病原菌[18]、重金属污染物[19]等的检测,但应用于抗生素检测还比较少见.本研究基于倏逝波荧光原理和间接竞争免疫分析原理,利用课题组研发的倏逝波光纤生物传感平台,研发了用于NOR现场快速检测的新方法,并分析了NOR在环境水样中的检测效果,其具有灵敏度高、特异性强、操作简单等显著优点.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3-巯丙基三甲氧基硅烷(MPTS)、NOR标准品、30%氢氟酸、牛血清蛋白(BSA)均购自Sigma中国公司,NOR单克隆抗体购自北京维德维康生物技术有限公司,浓硫酸、盐酸、30%过氧化氢、甲苯、4-马来酰亚胺基丁酸 N-羟基琥珀酰亚胺酯(GMBS)、乙醇、氯化钠、氯化钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均购自北京化学试剂公司,试剂纯度均为分析纯. pH=1.9的0.5%十二烷基硫酸钠(SDS)溶液、pH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)、抗体稀释液均由本实验室自行配制.NOR包被抗原(OVA-NOR)和Cy5.5荧光染料标记的NOR抗体(Cy5.5-NOR抗体)均为本实验室自行制备.

1.2 样品前处理

二沉池污水采集于中国人民大学低碳水环境中心污水处理中试装置,景观水采集于圆明园景观水,矿泉水为农夫山泉瓶装水,自来水样为中国人民大学自来水,以上水样采集后均于4℃保存,保存期限为30d.

取100mL容量瓶,加入1mL 1000mg/L NOR标准溶液,用所取水样定容至100mL.得到浓度为10mg/L的加标水样作为储备液.随后使用储备液及空白水样配制得到所需的加标浓度水样.

1.3 光纤探头的制备

将5.5cm长、芯径600μm的石英光纤(北京首量)去除3cm长的涂覆层,放入30%氢氟酸中腐蚀适当时间,得到锥角度为0.37,锥形部分长约0.5cm,芯径为220μm的组合锥型光纤探头.配制Piraha溶液(浓H2SO4/H2O2=3/1),将光纤探头浸入其中30min,以使光纤探头表面羟基化.然后用超纯水进行充分清洗至清洗液的pH值为中性,在室温下用氮气吹干或者在105℃的干燥箱中干燥3h.将光纤探头放入含2% MPTS的甲苯溶液中反应2h使光纤探头表面硅烷化,然后用甲苯清洗光纤3次,氮吹至干;将光纤探头放入0.002mol/L GMBS的乙醇溶液里反应1h,取出后用10mM PBS清洗干净,在光纤探头表面引入偶联基团;将连接了偶联基团的光纤探头浸入0.5μg/L的OVA-NOR中过夜,使光纤探头表面连接上OVA-NOR,用超纯水冲洗后,放入2μg/L的BSA溶液中反应2h以封闭非特异性吸附位点,制备好的光纤探头放在4℃冰箱保存备用.

1.4 倏逝波光纤生物传感平台及其检测原理

倏逝波光纤生物传感平台如图1所示.半导体激光器产生的激发光经由单多模光纤耦合器进入光纤探头,激发光在光纤探头以全内反射的方式传播,并在表面形成有效渗入深度为数十纳米的倏逝波场.当荧光标记的生物分子结合到光纤探头表面,其被倏逝波激发产生荧光,部分荧光耦合回光纤探头,经单多模光纤耦合器的多模光纤收集与传输,然后由光电探测器将光信号转换成电信号.通过软件系统的处理,最终的检测信号显示在用户界面[20-21].由于倏逝波场渗入深度有限,因此仅有通过因免疫反应结合到光纤探头的荧光标记生物分子被激发,而样品中游离的荧光染料标记抗体贡献极少,可以忽略不计.

图1 倏逝波光纤生物传感平台

1.5 NOR生物传感检测机制

基于间接竞争免疫反应原理的NOR生物传感机制如图2所示.首先,将表面修饰OVA-NOR的光纤探头置入样品检测池.然后将一定浓度的Cy5.5- NOR抗体和含不同浓度NOR的样品预反应一定时间,使NOR与抗体充分结合.再将此混合物通入到样品池,未结合NOR的游离抗体与光纤探头上修饰的OVA-NOR结合.光纤探头表面形成的倏逝波激发荧光分子发出荧光,部分荧光耦合回光纤探头,经单多模光纤耦合器的收集与传输,由光电探测器探测并转换成电信号.经软件处理后,荧光信号值显示在用户界面.样品中NOR 浓度越高,结合到光纤探头的荧光标记抗体越少,检测到的荧光信号越弱.利用荧光信号值与样品浓度的反比关系,即可实现NOR的定量检测.

图2 倏逝波光纤生物传感器检测原理

2 结果与讨论

2.1 NOR的免疫分析

为了验证样品中的NOR与光纤探头的OVA- NOR存在对特异性抗体结合位点的竞争关系,设计了在相同抗体浓度下不同NOR浓度的对比实验.将1μg/mL抗体分别与10mM PBS(NOR浓度为0)、5μg/L NOR、10μg/L NOR等比例混合,预反应1min,然后将混合液通入样品池中,在样品池反应240s,随后通入SDS溶液对光纤探头进行再生.记录检测信号值随反应时间的变化,数据采集间隔为1s.对不同NOR浓度下的反应动力学曲线进行对比分析.

图3 不同NOR浓度下传感系统检测的信号曲线

从图3中可以看出,当样品中不含有NOR时,荧光标记的NOR抗体以最大的速度与OVA-NOR修饰的光纤探头结合,荧光信号值增长最快.但是,增长速度随反应时间的延长而降低,符合抗原抗体结合的反应动力学规律.当样品含有5μg/L NOR时,NOR抗体与光纤探头的结合受到了明显影响,信号增长速度明显放缓,约为空白样品的二分之一.但是,增长规律与前一个样品基本一致,可以认为检测信号的主要来源仍然是抗原抗体的特异性结合.而当样品中NOR浓度提高到10μg/L时,抗体与光纤探头的结合基本被抑制,荧光信号增长缓慢,信号值仅为空白样品的10%左右.荧光信号轨迹线性增长,符合伪一级反应动力学规律,可以推测该样品中的荧光信号主要来自游离的荧光标记抗体及其在光纤探针上的非特异性吸附.由此可以得知,随着样品中NOR浓度的增加,更多的荧光标记抗体与游离的NOR结合,导致结合到光纤探针的荧光标记抗体量减少,从而使得检测到的荧光信号值减少,符合间接竞争免疫原理的反应动力学现象.因此,本研究提出的方法可以用于NOR的定量检测.为实现光纤探针的重复使用,使用SDS溶液对光纤探头表面进行再生,再生后的信号均可回落到初始水平,且再生后光纤探头可以再次与荧光标记抗体结合,证明SDS溶液能够定向解离结合到光纤探头上的Cy5.5-NOR抗体,且不会降低光纤探头表面修饰的OVA-NOR反应活性.

2.2 传感器的选择性

对物质的选择性体现了特异性抗体识别抗生素的能力,是方法可行性的基础,为了验证抗体的选择性:在农药中选取氟虫腈;在生物毒素中选取黄曲霉毒素;在抗生素中选取硫酸卡那霉素、氨卡西林、培氟沙星和莫西沙星,设计选择性实验,验证抗体对环境中常见的小分子痕量污染物[22]的选择性识别能力.分别将50μL的Cy5.5-NOR抗体与50μL 10μg/ L的PBS、NOR、氟虫腈、黄曲霉毒素、硫酸卡那霉素、氨卡西林、培氟沙星、莫西沙星标准品混合并静置10min使其充分预反应后通入样品池,反应4min,收集信号值.将加入不同种类物质时检测到的信号与加入NOR时的检测信号对照,分析特异性抗体对不同种类物质的识别能力.每组实验平行测定2次.

如图4所示,样品中加入不同种类抗生素及农药、生物毒素等物质不影响Cy5.5-NOR抗体与光纤探头上OVA-NOR的结合,其检测信号值与仅通入Cy5.5-NOR抗体时基本持平.培氟沙星和莫西沙星的加入会使检测信号有一定程度的下降,这是因为这两种抗生素与NOR同属于喹诺酮类抗生素,具有类似结构.但是,其信号下降值小于NOR的下降值,这表明NOR抗体对NOR具有较好的特异性.

图4 抗体的选择性

2.3 NOR检测标准曲线

经预实验获得最优的检测条件为预反应1min、反应4min、抗体浓度在1～2μg/mL之间.在最优反应条件下,将不同浓度的NOR标准品与1和2μg/mL的Cy5.5-NOR抗体预反应1min后通入光纤反应槽检测荧光信号.由于样品中的NOR与光纤探头上的包被NOR存在对Cy5.5-NOR抗体结合位点的竞争关系,因此NOR浓度低时检测信号高;反之,当NOR浓度低时,检测到的荧光信号小.根据反应动力学分析,检测信号随NOR浓度的变化趋势反映在坐标系中应呈倒S形曲线[23].将不同的抗体浓度下获得的检测信号做归一化处理(ε/ε0,为梯度浓度的检测信号值,0为空白样品的检测信号值),经Logistic方程拟合获得不同抗体浓度下的NOR标准曲线.

式中:为归一化信号值0;为待测物的浓度;0为曲线的中点;为拐点的斜率;1为测量上限的信号值;2为测量下限的信号值.

如图5所示,在抗体浓度为1μg/mL的NOR检测标准曲线中,误差小于8%,稳定性较好.荧光信号标准化值与标准品浓度的对数曲线显示出了良好的相关关系,曲线拟合度2值大于0.99.NOR的检测限(LOD)为1.89μg/L,线性区间为4.50～7.78μg/L.在抗体浓度为2μg/mL的NOR检测标准曲线中,误差小于20%,稳定性欠佳.曲线拟合度2值大于0.99.NOR检测的检测限(LOD)为2.00μg/L,线性区间为3.40～7.00μg/L.不同浓度抗体下的检测线性范围十分接近,因此,出于降低检测成本的考虑,选择1.0μg/mL的抗体会更合适.表1比较了目前常用方法的特点,从中可以看出,本方法无需预处理,同时在检测时间、灵敏度、成本等方面也具有明显优势.

图5 0.5和1 μg/mL抗体的NOR标准曲线

表1 常见检测方法对比

2.4 传感器的可再生性

光纤探头的可再生性是影响倏逝波生物传感器检测成本的一个重要因素.光纤探头的可再生次数越多则检测成本越低.如图6可见,在通入pH=1.9的SDS溶液再生后,仪器的检测信号回落到检测基线水平,这证明光纤探头上的NOR抗体能够被完全洗脱,结合位点重新被释放,其检测性能未受到影响.如图6所示,随着光纤探头使用次数的增加,检测不含NOR样本的信号值(仅通入Cy5.5-NOR抗体时仪器收集到的荧光信号)几乎没有变化.结果表明,光纤探头上的NOR抗体结合位点在超过400次再生后仍然没有被破坏,该光纤探头至少能够使用400次以上并且保持良好的检测性能.同时,这也证明了本检测方法具有突出的稳定性和可重复性.

图6 OVA-NOR修饰的光纤探头检测信号值随使用次数的变化

2.5 实际水样加标回收

为了验证本研究建立的检测方法在实际应用中的可行性,有必要对不同环境基质中的NOR进行加标回收实验.选取了二沉池出水、景观水、矿泉水、自来水等4种典型环境水样,4种水样均未进行预处理.对4种水样分别进行了3个不同浓度的NOR的加标回收实验,平行测定2次.

表2 不同环境基质中NOR的回收率

加标回收结果如表2.可以看出,不同环境基质下NOR的回收率变化不大,在92%至116%之间.同时,检测结果的相对标准偏差在7%以下.结果证明本检测方法具有良好的准确性,抗环境干扰能力较强,在成分复杂的环境基质中仍具有突出的检测性能.

3 结论

3.1 建立了倏逝波光纤免疫传感平台上的NOR检测方法,并优化了检测条件,结果表明在Cy5.5标记的NOR抗体浓度为1μg/mL、预反应时间为1min,光纤反应时间为240s时,NOR检测的条件最优,该条件下能够得到有效的信号值同时检测效率高.

3.2 选择性实验结果显示, Cy5.5-NOR抗体对硫酸卡那霉素、氨卡西林、氟虫腈、黄曲霉毒素等物质的信号响应程度远低于NOR,表明该传感器具有良好的选择性.光纤探头重复使用400次仍保持90%以上的信号水平,传感器稳定性和可重复性良好.

3.3 通过对自来水、景观水、二沉池出水等不同基质进行不同浓度加标回收实验,证明该传感器具有良好的精密度和准确性,受环境基质的影响较小,能够用于环境中实际水样NOR的快速检测.

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Rapid detection of norfloxacin in water by evanescent wave fiber optic biosensor.

ZHUO Yu-xin, XU Wen-juan, CHENG Yuan, SONG Dan, HAN Xiang-zhi, LONG Feng*

(School of Environment and Natural Resources, Renmin University of China, Beijing 100872, China), 2022,42(5)：2283～2288

Norfloxacin (NOR), a widely used antibiotic, is becoming a major threat to ecological security. The existing detection methods have either high cost and pretreatment requirements or long detection time and poor sensitivity. Based on indirect competitive immunoassay principle, a new detection method of norfloxacin was developed using the evanescent wave fiber optic bio sensing platform. The rapid and sensitive detection of norfloxacin in water was achieved. The optimal detection conditions of norfloxacin were as follows: antibody concentration was 1μg/mL, pre-reaction time was 1min, and reaction time was 4min. Under the optimal conditions, the detection limit of norfloxacin was 1.89μg/L. The coating-antigen modified fiber optic probe showed good specificity for fluorescence-labeled anti-norfloxacin antibody and stability, and could be reused more than 400 times. The recovery results of the spiked water samples, such as tap water, landscape water, and effluent of secondary sedimentation tank, demonstrated that the proposed biosensor had good precision and accuracy, and was less affected by the environmental matrix. The presented biosensor can be used for the rapid detection of NOR in actual water samples.

norfloxacin；antibiotics；evanescent wave biosensor；immunoassay；environmental monitoring

X83

A

1000-6923(2022)05-2283-06

卓雨欣(1996-),女,福建宁德人,硕士研究生,主要研究方向为环境监测与生物传感器.发表论文2篇.

2021-09-22

国家自然科学基金资助项目(21675171)和北京市自然科学基金-海淀原始创新联合基金资助项目(L182045)

* 责任作者, 教授, longf04@ruc.edu.cn