深圳龙华区妊娠期高血压孕妇血清中PAPP-A水平及其基因rs7020782 A/C位点多态性分析

曾辉苑，刘国栋，林 丽，刘爱胜，梁秀文

妊娠相关血浆蛋白A（pregnancy-associated plasma protein-A，PAPP-A）是一种与胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）相关的金属螯合蛋白酶。其水平与多种慢性炎症性疾病有关，多用于冠心病和高血压的诊疗[1~3]。最近研究发现PAPP-A又是一种与妊娠相关的糖蛋白，与多种妇产科疾病有关，其中妊娠期高血压（gestational hypertension，GH）与PAPP-A水平之间的相关性中国内地已见少数报道，但其基因（PAPP-A）多态性与GH发病的易感性未见报道，且其基因多个位点呈多态性，并具有地域性差异[4，5]。笔者针对深圳龙华区GH孕妇和健康非GH孕妇PAPP-A水平及其基因rs7020782 A/C位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）进行了分析，探讨其在GH发病中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料与试剂

1.1.1 临床材料

选择2019年3月至2021年2月在深圳市龙华区人民医院确诊的GH孕妇279例（GH组），年龄24～43岁，平均年龄30.85岁（标准差6.92岁）；孕周21～35周，平均孕周28.06周（标准差7.52周）。同时选择健康非GH孕妇108例为对照组，年龄23～45岁，平均年龄31.07岁（标准差7.38岁）；孕周20～34周，平均孕周27.54周（标准差7.01周）。所有患者及家属知情并签署知情同意书，且已经笔者所在医院伦理委员会同意批准。

选择标准：①GH诊断参照《妊娠期高血压疾病诊治指南（2020）》中GH诊断标准[6]，并根据血压（blood pressure，BP）高低将GH孕妇分为轻度组[140/90 mmHg≤BP<150/100 mmHg，蛋白尿（±）]125例、中度组[150/100 mmHg≤BP<160/110 mmHg，蛋白尿（+）]93例及重度组[BP>160/110 mmHg，蛋白尿（++以上）]61例；②单胎妊娠者；③初诊者；④妊娠期未服过特殊药物者；⑤孕周>20周者；⑥自愿并积极配合者。

排除标准：①妊娠前患慢性高血压者；②多胎妊娠者；③复诊者；④使用过抗血压药物者；⑤伴有严重的心脑血管疾病及肝肾功能损害者；⑥不自愿配合者。

两组年龄、孕周等临床材料差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。

1.1.2 主要试剂与仪器

PAPP-A酶联免疫吸附分析（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（上海广锐生物科技，中国）；DNA提取试剂盒（深圳亚能，中国）；乙二胺四乙酸二钾 （ethylene diamine tetraacetic acid dipotassium salt，EDTA-K2）抗凝管（山东奥赛特医疗器械公司，中国）；PAPP-A rs7020782 A/C位点SNP分析试剂（华大基因，中国）。

1.2 方法

1.2.1 血液样品采集方法

所有患者均于就诊的第二天清晨采用一次性真空采血管抽取空腹静脉血2份，其中1份2.0～3.0 mL置于EDTA-K2抗凝管内，充分混匀，用于DNA提取；另1份3.0～4.0 mL置于无抗凝剂的干燥管内，用于PAPP-A水平测定。

1.2.2 妊娠相关血浆蛋白A水平测定

抽取3.0～4.0 mL静脉血置于无抗凝剂的干燥管内，30 min后分离血清，及时检测，否则于-20℃条件下保存；采用ELISA法进行PAPP-A水平检测，具体操作按照试剂盒及仪器操作说明书进行。

1.2.3 DNA提取

抽取2.0～3.0 mL静脉血置于EDTA-K2抗凝管内，充分混匀，用DNA提取试剂盒提取全基因组DNA，将提供的DNA样品于-70℃条件下保存备用。

1.2.4 PAPP-A rs7020782 A/C位点SNP分析

1.2.4.1 引物设计 上游引物：5′-CCCTCGTTTCTTTCCTCC-3′；下游引物：5′-ACCCAGTAAGCCTTCCCT-3′。由华大基因公司合成。

1.2.4.2 反应体系 取10×缓冲溶液5.0μL、10 mmol/L dNTPs4.0μL、25 mmol/L MgCl23.0μL、20μmol/L上下游引物各1.0μL、0.1μg/μL DNA模板1.0μL、1 U/μL Taq DNA聚合酶0.25μL，然后加双蒸水至50.0μL。

1.2.4.3 扩增 94℃预变性5 min，然后以94℃变性60 s→62℃退火48 s→72℃延伸48 s，循环36次，最后以72℃延伸5 min。

1.2.4.4 酶切 取聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增产物10.0μL、2.5 U限制性内切酶MOWⅠ（restriction endonuclease MOWⅠ）0.5μL、缓冲溶液2.0μL及去离子水7.5μL，60℃酶切1 h。

1.2.4.5 电泳 于30 g/L琼脂糖凝胶上加入PCR扩增酶切产物，电泳40 min，分析其基因型。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件。计量资料以均数±标准差表示，组间比较运用t/F检验；计数资料以率（%）表示，组间比较运用χ2检验；遗传平衡运用Hardy-Weinberg平衡检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组妊娠相关血浆蛋白A水平比较

GH组PAPP-A水平为（8.92±3.15）mIU/L，明显高于对照组[（5.41±1.73）mIU/L]；差异有统计学意义（t=6.054 8，P<0.05）。

2.2 不同组GH孕妇妊娠相关血浆蛋白A水平比较

重度组PAPP-A水平为（13.23±4.15）mIU/L，明显高于中度组[（9.24±2.51）mIU/L]，而中度组明显高于轻度组[（6.58±2.07）mIU/L]；不同组别差异有统计学意义（F=10.514 3，P<0.05）。

2.3 Hardy-Weinberg平衡检验

GH组和对照组PAPP-A rs7020782 A/C位点SNP均检出AA、AC和CC 3种基因型，经Hardy-Weinberg检验，两组PAPP-A rs7020782 A/C位点差异无统计学意义（χ2=1.320 7，P>0.05）。说明抽样具有样本代表性。

2.4 两组PAPP-A rs7020782 A/C位点SNP比较

GH组PAPP-A rs7020782 A/C位点CC基因型和C等位基因频率分别为30.47%和48.75%，高于对照组（9.26%和28.24%）；差异有统计学意义（P<0.05），且CC基因型和C等位基因患GH的相对风险增加[比值比（odds ratio，OR）=2.836，95%可信区间（confidence interval，CI）1.725～4.713和OR=2.016，95%CI 1.632～3.548]。见表1。

表1 GH组与对照组PAPP-A rs7020782 A/C位点SNP比较Tab.1 Comparison of SNPat rs7020782 A/Clocus of PAPP-A between GH group and control group

2.5 两组电泳结果

于30 g/L的琼脂糖凝胶上加入PCR扩增酶切产物进行电泳，两组标本的PAPP-A rs7020782 A/C位点SNP均可见AA、AC及CC 3条电泳带（图1）。

图1 PAPP-A rs7020782 A/C位点SNP电泳图Fig.1 SNPelectrophoresisof PAPP-A rs7020782 A/Clocus

2.6 测序结果

抽取部分PAPP-A rs7020782 A/C位点SNP PCR扩增产物样本进行基因直接测序，符合PAPP-A基因序列（图2）。

图2 PAPP-A rs7020782 A/C位点PCR扩增产物基因测序图Fig.2 Sequencing map of PCR product at rs7020782 A/Clocus of PAPP-A

2.7 不同基因型GH孕妇妊娠相关血浆蛋白A水平比较

PAPP-A rs7020782 A/C位点CC基因型GH孕妇PAPP-A水平为（11.98±3.76）mIU/L，明显高于AA和AC基因型[（7.31±2.30）mIU/L和（7.80±2.54）mIU/L]，差异有统计学意义（t=6.705 2～7.164 0，P<0.05）；而AA和AC基因型之间差异无统计学意义（t=1.105 3，P>0.05）。

3 讨论

GH是妇女妊娠期特有的一种常见疾病，可导致多脏器功能损害，严重者可引起抽搐、昏迷及脑血管出血，甚至可引起弥散性血管内凝血，是导致孕产妇、围产儿患病及死亡的主要原因之一[7]。GH发病率全球约为7%~12%；中国内地约为9.4%，且随人们生活水平不断提高、饮食结构的改变及环境不断恶化，其发病率逐年上升，且症状常于妊娠20周后才出现，此时孕妇和胎儿已受到不同程度损伤[8，9]。GH的病因和发病机制仍不明，给临床诊断、治疗带来很大困难。因此，寻找新的诊断标记物，并探讨其作用机制，对GH早期诊断、治疗及预防具有重要的意义。

PAPP-A是由胎盘蜕膜细胞和/或合体滋养细胞生成的一种分泌金属蛋白酶，其主要通过切割IGF结合蛋白，对代谢及免疫调节发挥重要作用[10~12]。GH由于全身微小动脉痉挛，引起组织灌注不足、细胞缺血及缺氧，导致胎盘局部发生氧化应激反应、自由基大量释放及脂质过度氧化，同时促使炎性因子大量释放，进而引发血管内皮损伤，导致PAPP-A分泌增加[13，14]。笔者研究结果显示，GH孕妇血清中PAPP-A水平明显升高，且随GH病情加重而升高（P<0.05），与中国国内有关研究结果基本一致[10，13，14]。这说明在排除其他可引起PAPP-A水平升高疾病外，PAPP-A水平监测对GH早期诊断及病情判断具有一定的应用价值。

有研究表明，GH是一种多遗传性疾病，其发病与多种基因位点突变有关[15~17]。PAPP-A位于人类第9号常染色体上，其基因rs7020782 A/C位点易发生多态性突变，可能影响其水平表达和/或导致其结构和功能的异常，而与多种疾病的发生有密切关系[4，5]。笔者研究结果显示，深圳地区GH孕妇PAPP-A rs7020782 A/C位点CC基因型及C等位基因频率比对照组明显升高，且携带CC基因型孕妇患GH的相关风险明显增加。这表明PAPP-A rs7020782 A/C位点多态性可能与GH发生有密切关系，其中CC基因型可能是该地区GH发病的遗传危险易感基因。此外，PAPP-A rs7020782 A/C位点不同基因型GH孕妇血清中PAPP-A水平存在很大差异，其中CC基因型孕妇最高。这表明PAPP-A水平与其基因位点多态性突变有密切关系，同时也说明PAPP-A在GH发病中的作用机制可能是通过其基因位点突变影响其水平表达来实现的，但具体作用机制有待进一步深入研究。

综上所述，GH孕妇PAPP-A水平明显升高，且随病情加重而升高，在排除其他可引起其水平升高疾病外，PAPP-A水平监测对GH早期诊断及病情判断具有一定的应用价值。同时PAPP-A rs7020782 A/C位点呈多态性，且与PAPP-A水平有关，有利于GH发病机制的研究。