瑞香狼毒根提取物对荞麦桃蚜的毒力及其作用机制

高玉莲，王贻卉，常 静，康 鹏，马崇勇，韩志勇, 李海平*

(1. 内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古 呼和浩特 010019； 2. 内蒙古自治区草原工作站，内蒙古 呼和浩特 010020；3. 内蒙古自治区乌拉特前旗林业和草原局草原工作站，内蒙古 乌拉特前旗 014400)

瑞香狼毒(StellerachamaejasmeL.)属于瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒属(Stellera)，民间又称红狼毒、馒头花、断肠草等，是一种多年生草本植物[1]。瑞香狼毒因其强竞争性而成为优势种，在草原上扩散蔓延，是影响草原退化的主要植物种群之一[2]。该植物全株有毒，以根的毒性最大，据《中国土农药志》记载，我国民间常将其根粉用于害虫防治[3]。近些年的研究表明，瑞香狼毒对菜粉蝶(Pierisrapae)、蚜虫、螨等多种害虫都具有较强的杀虫活性[4]。

荞麦(FagopyrumesculentumMoench)起源于中国，栽培历史悠久，是全世界重要的杂粮作物之一，主要种植于中国、俄罗斯、日本、波兰等国。荞麦具有抗旱、耐瘠、适应性强、生育期短等特点，是我国生态脆弱地区重要的粮食、饲草饲料及救荒作物[5]。荞麦全身是宝，其中苦荞具有降血脂、降血糖、降尿糖、疗胃疾和改善便秘的营养保健功能，其预防和治疗高血压的功能是其他作物不可比拟的，因此被认为是21世纪人类重要的健康食物资源[6-8]。

荞麦抗逆性很强，病虫草害较其它作物相对较少、较轻。近年来随着人们生活水平的提高和对荞麦保健功能的进一步认知，荞麦种植面积不断扩大，部分地区连年耕作，规模化生产，病虫害也有逐渐加重的趋势[8]。荞麦上的害虫主要有螨(二斑叶螨Tetranychusurticae、截形叶螨Tetranychustruncatus)，蚜虫(桃蚜Myzuspersicae、棉蚜Aphisgossypii)，花蓟马(Frankliniellaintonsa)，西伯利亚龟象(Rhinoncussibiricus)以及草地螟(Loxostegesticticalis)等[9-10]。其中蚜虫和花蓟马是荞麦花期的主要害虫，而荞麦花期占荞麦整个生长期的2/3左右，对荞麦产量影响很大[11-12]。近年内蒙古地区荞麦上蚜虫灾害发生较重，其中桃蚜危害最重。为保证荞麦的产量，同时兼顾荞麦的绿色保健功能，对蚜虫进行绿色有效防控是非常重要的。因此，本论文研究了瑞香狼毒根提取物对荞麦桃蚜的毒力及其作用机制，为未来利用瑞香狼毒防治荞麦桃蚜提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

瑞香狼毒根于2018年8月采自内蒙古乌兰察布四子王旗草原，将采集到的瑞香狼毒根清洗干净并充分阴干，用粉碎机粉碎，置于阴凉干燥处保存备用。

供试蚜虫为实验室荞麦上饲养的桃蚜。

1.2 试验方法

1.2.1瑞香狼毒根石油醚提取物的制备 采用常温浸泡法，用小型粉碎机(永康红太阳机电有限公司，浙江)将阴干的瑞香狼毒根粉末过40目筛，按照料液比为1∶8(g∶mL)加入石油醚，浸泡72 h后过滤，将提取液置旋转蒸发仪(上海比朗仪器有限公司，上海)上进行旋转蒸发，蒸掉大部分石油醚后，将剩余提取物取出自然挥干至膏状，保存在4℃冰箱备用。

1.2.2瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜的毒力测定 将提取物溶解于少量95%乙醇并用水溶液稀释成5个不同的浓度(500，1 000，2 000，4 000，8 000 mg·L-1)，以不加提取物的相应溶液为对照。参考张炳宗[13]的方法，用浸虫浸叶法测定毒力。采集虫口密度大的荞麦叶，仔细挑选健康的无翅成蚜(50头左右)留在叶面上，将带虫的荞麦叶浸入待测溶液6～7 s后取出，沥干，置于铺有滤纸的培养皿(直径9 cm)中，放置于(25±1)℃的光照培养箱内饲养，每一浓度重复3次，24 h后记录死亡情况。以解剖针轻触虫体无任何反应记为死亡，计算死亡率和校正死亡率。用POLO Plus软件计算致死中浓度LC50值及95%置信区间。

1.2.3瑞香狼毒根石油醚提取物处理桃蚜后其体内靶标酶活性的测定 乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是昆虫体内重要的神经传递物质乙酰胆碱的裂解酶，也是很多杀虫剂的重要靶标酶。采用高希武[14]的方法对乙酰胆碱酯酶(AChE)活性进行测定。

腺苷三磷酸酶(Adenosine triphosphatase，ATPase)是一类膜结合酶，该酶系参与释放能量供细胞使用的同时，还参与细胞基本代谢和生理活动，特别是对于维持细胞膜内外离子浓度梯度有着非常重要的作用，被认为细胞毒性的敏感指标。腺苷三磷酸酶活性测定按照ATPase测试盒说明进行。

1.2.4瑞香狼毒根石油醚提取物处理后桃蚜解毒酶活性的测定 昆虫在受到外界各种有毒物质的伤害时，解毒酶系会发挥其解毒作用。谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione-S-transferase，GSTs)、细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP450)和羧酸酯酶(Carboxylesterase，CarE)被认为是昆虫体内的主要解毒酶。谷胱甘肽-S-转移酶活性测定参照Habig等方法[15]；细胞色素P450活性的测定参照Brogdon等和Tiwari等的方法[16-17]；羧酸酯酶活性测定参照Van Aspern的方法测定并略有改动[18]。

1.2.5酶源蛋白含量测定 为计算靶标酶和解毒酶的活性，需要测定酶原蛋白质含量。采用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白含量[19]。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel 2010软件对数据进行处理和绘图，采用SPSS 20.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)和差异显著性检验(LSD)，其显著水平设为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜的毒杀活性

由表1可知，随着瑞香狼毒根石油醚提取物浓度增大，桃蚜的死亡率和校正死亡率逐渐增加。24 h瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜致死中浓度为1 243.7 mg·L-1。

表1 瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜的毒力Table 1 Toxicity of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root to Myzus persicae

2.2 瑞香狼毒根石油醚提取物处理对桃蚜体内靶标酶活性的影响

2.2.1对乙酰胆碱酯酶(AChE)的影响 如图1所示，桃蚜经瑞香狼毒根石油醚提取物处理24 h后，其体内的AChE活性与对照相比均显著降低(P<0.05)，抑制程度与处理浓度没有直接的相关性。浓度为1 000 mg·L-1时，AChE活性最低，与对照相比降低了21.7%。

图1 瑞香狼毒根石油醚提取物处理对桃蚜乙酰胆碱酯酶活性的影响Fig.1 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on AChE activity of Myzus persicae注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。下图同Note:Different letters mean significant difference at the 0.05 level. The same as below

2.2.2对腺苷三磷酸酶(ATPase)的影响 图2显示瑞香狼毒根石油醚提取物处理对桃蚜ATPase活性的影响。如图所示，随瑞香狼毒根石油醚提取物浓度的增大，桃蚜体内Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性上升，在浓度为4 000 mg·L-1时达到最大值，分别为0.01和0.006 2 μmolPi·mg-1·h-1，其活性分别是对照的12.0，1.8倍，显著高于对照(P<0.05)。之后随着提取物浓度的增加活性下降，但仍显著高于对照。

图2 瑞香狼毒根石油醚提取物处理对桃蚜ATPase活性的影响Fig.2 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on ATPase activity of Myzus persicae

2.3 瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜解毒酶活性的影响

2.3.1对谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)的影响 如图3所示，瑞香狼毒根石油醚提取物处理桃蚜后，对桃蚜体内GSTs活性有明显的诱导作用，不同浓度与对照相比均有显著增加。在浓度为500 mg·L-1时，GSTs的活性最高，为2.4 mOD·mg Pro-1·min-1，是对照的1.4倍。

图3 瑞香狼毒根石油醚提取物处理对桃蚜谷胱甘肽-S-转移酶活性的影响Fig.3 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on GSTs activity of Myzus persicae

2.3.2对细胞色素P450的影响 图4是瑞香狼毒根石油醚提取物处理对桃蚜细胞色素P450活性的影响。随着瑞香狼毒根石油醚提取物浓度的增大，细胞色素P450活性逐渐增大，不同浓度与对照相比均有显著增加(P<0.05)。在浓度为8 000 mg·L-1时，细胞色素P450活性最大，是对照的1.3倍。

图4 瑞香狼毒根石油醚提取物处理对桃蚜细胞色素P450活性的影响Fig.4 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on cytochrome P450 activity of Myzus persicae

2.3.3对羧酸酯酶(CarE)的影响 在瑞香狼毒根石油醚提取物的影响下，桃蚜体内羧酸酯酶活性下降，除最大浓度8 000 mg·L-1外，CarE活性与对照均有显著差异(P<0.05)(图5)。

3 讨论与结论

近年来，随着人们生活水平和对食品安全要求的提高，病虫害的绿色防控技术越来越受到重视，绿色农药的概念被提出并在实践中不断发展应用。植物源农药是直接利用具有生物活性的植物或提取其有效成分制成的，已成为病虫害绿色防控技术中绿色农药的重要组成部分[20]。

图5 瑞香狼毒根石油醚提取物处理对桃蚜羧酸酯酶活性的影响Fig.5 Effect of petroleum ether extract from Stellera chamaejasme root on the CarE activity of Myzus persicae

很早以前人们就发现瑞香狼毒的杀虫作用，并在生产中加以应用。随着科技的进步，瑞香狼毒的杀虫作用进一步得到研究证实。陈梅等[21]研究发现瑞香狼毒根石油醚提取物对朱砂叶螨(Tetranychuscinnabarinus)有很好的触杀活性，当瑞香狼毒根石油醚提取物浓度为2 mg·mL-1时，朱砂叶螨的校正死亡率为83.9%。陈琼等[22]的研究表明，瑞香狼毒Ⅰ段粗分物对东亚飞蝗(Locustamigratoria)具有较强的毒杀作用，在粗分物浓度为10 mg·mL-1，72 h时对东亚飞蝗的校正死亡率为92.5%。进一步研究发现，瑞香狼毒不同溶剂提取物杀虫程度不同。熊纳纳等[23]研究了狼毒石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及水等4种不同溶剂提取物的杀烟蚜活性，其中，石油醚提取物的杀烟蚜活性最好，在浓度为0.5 mg·mL-1，12 h时蚜虫全部死亡。本试验采用瑞香狼毒根石油醚提取物对荞麦上的桃蚜进行毒力测定，其LC50为1 243.7 mg·L-1。相对于他人研究结果，本试验对昆虫的致死中浓度较大。高漫璐等[24]研究瑞香狼毒根石油醚提取物对东亚飞蝗毒力，结果显示对东亚飞蝗有拒食、胃毒、触杀等作用，其中拒食作用较大，而48 h的触杀和胃毒作用分别为2 599.9，11 770 mg·mL-1。这些研究结果说明，瑞香狼毒根石油醚提取物可能含有多种杀虫成分，对不同昆虫的杀灭成分及效果不同，必须分离其主要杀虫成分，才能进一步开发作为杀虫剂使用。

众多研究表明，大量的天然产物和植物提取物具有抑制昆虫AChE活性的作用。匡传富等[25]研究发现，八角茴香(Illiciumverum)提取物抑制了桃蚜的AChE活性，梁为等[26]研究发现瑞香狼毒超临界CO2萃取物对朱砂叶螨AChE有较好的抑制作用，抑制率最高达50.1%。本试验研究结果表明，用瑞香狼毒石油醚提取物处理桃蚜后，桃蚜体内AChE的活性降低，与陈义娟[27]研究香樟(Cinnamomumcamphora)叶提取物中杀螨活性物质的作用机理结果相似；但和有机化学杀虫剂如有机磷、氨基甲酸酯类杀虫剂对AChE的绝对抑制作用不同，对AChE的抑制率较低。本结果表明瑞香狼毒根石油醚提取物处理桃蚜后，对桃蚜体内AChE活性有一定的抑制。

ATPase是菊酯类杀虫剂的主要作用靶标之一[28]。张丛等[29]研究发现4种菊酯类杀虫剂对枸杞蚜虫2种ATPase活性均有抑制作用，Li等[30]研究发现，3种除虫菊酯类杀虫剂对拟水狼蛛(Piratasubpiraticus)和二化螟(Chilosuppressalis)体内Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均表现出抑制作用，但抑制率最高均不超过50%。梁为等[26,31]研究瑞香狼毒对朱砂叶螨的毒理机制，瑞香狼毒超临界CO2萃取物和天然化合物东莨菪素都能够显著抑制朱砂叶螨Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase的活性，其中瑞香狼毒超临界CO2萃取物对两者的抑制率高达44.5%和67.1%。本文研究表明，用瑞香狼毒根石油醚提取物处理桃蚜后，对桃蚜体内的Na+-K+-ATPase和Ca2+-Mg2+-ATPase活性均表现为诱导作用。由此推测，ATPase可能不是瑞香狼毒对桃蚜作用的靶标酶，但还需要进一步研究证实。

杀虫剂一方面作用于昆虫的靶标系统，杀死昆虫；另一方面，昆虫也会对这些有毒物质进行代谢，降低杀虫剂对昆虫的作用。谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs)、细胞色素P450酶和羧酸酯酶(CarE)是昆虫体内3种重要的解毒酶，在昆虫对外源有毒物质的解毒代谢中发挥重要作用。陈德霞等[32]研究发现，亚洲小车蝗(Oedaleusasiaticus)取食次生代谢物质如黄酮、单宁、生物碱等含量低的牧草，体内解毒酶活性也低，反之亦然。有研究表明4种植物源化合物处理亚洲小车蝗后，亚洲小车蝗体内GSTs,CYP450和CarE活性较对照均明显增加[33]；棉铃虫(Helicoverpaarmigera)取食棉酚含量高的寄主植物后，CYP450活性显著升高[34]。现有的研究已经发现，瑞香狼毒体内含有多种植物次生代谢物质，如：黄酮类、萜类、香豆素类等。本试验中，瑞香狼毒根石油醚提取物不同浓度处理桃蚜后，桃蚜体内GSTs和细胞色素P450活性均显著高于对照，且桃蚜体内细胞色素P450活性与瑞香狼毒根石油醚提取物的浓度呈显著正相关关系。说明瑞香狼毒根石油醚提取物进入桃蚜体内，诱导桃蚜体内解毒酶特别是细胞色素P450和GSTs的活性增加，增强对瑞香狼毒提取物的代谢，从而降低了瑞香狼毒对桃蚜的毒性。

奚广生和李海涛[35]研究表明，人参(Panaxginseng)茎叶、根部皂苷对桃蚜体内的CarE有明显的抑制作用；吴德东等[36]研究北乌头(Aconitumkusnezoffii)乙酸乙酯萃取物亚致死剂量对舞毒蛾(Lymantriadispar)幼虫的影响，舞毒蛾幼虫CarE活性受到抑制，抑制程度随处理时间延长逐渐加强。本文研究结果表明，瑞香狼毒根石油醚提取物抑制了桃蚜体内的CarE活性。曹威[37]研究发现瑞香狼毒素对棉蚜CarE活性有一定的抑制作用，但不明显，与本文研究结果相似。CarE活性受到抑制后，其解毒能力降低，可延长外源毒物在体内的存留时间，并发挥其毒效而致昆虫中毒死亡，因此CarE活性受到抑制可能是瑞香狼毒提取物导致桃蚜死亡的原因之一。但在瑞香狼毒提取物浓度为8 000 mg·L-1时，桃蚜CarE活性的变化与其它浓度不同，活性和对照没有显著差异。从瑞香狼毒根石油醚提取物对桃蚜的毒力结果看，当提取物浓度为8 000 mg·L-1时桃蚜的死亡率为97.5%，在死亡率如此高的情况下存活的桃蚜可能有抗性基因或某些基因发生突变。植物源化合物是否和其他有毒化合物一样影响昆虫的基因表达或改变昆虫信号转导，还需要通过研究提取物对桃蚜CarE的体外抑制和基因表达，才能进一步了解。

植物源杀虫剂由于其体内次生代谢物质种类繁多、性质多样，对不同昆虫的作用程度和机理也不尽相同。同时害虫对外源性有害物质侵入的反应机制也是多样的，昆虫通过各种生物功能的酶系及解毒、代谢系统相互交织联系、补充而起到解毒作用[38]。瑞香狼毒对多种昆虫具有毒杀作用，但可能对每种昆虫的主要杀虫成份不同，因而杀虫机理也各不相同。未来应进一步明确瑞香狼毒对桃蚜的主要杀虫成份，在此基础上才能研究其杀虫机理，为未来开发瑞香狼毒作为杀虫剂防治荞麦桃蚜提供更好的科学依据。