基于网络稳健性的和血明目片潜在适应证预测

席玉婕 高锦成 郭非非 杨洪军

摘要 目的：基于藥物干扰疾病网络稳健性的方法来预测和血明目片潜在的适应证。方法：使用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）、中医药综合数据库（TCMID）等数据库搜集和血明目片中的活性成分，利用BATMAN-TCM预测成分的潜在靶点;通过DisGeNET和HPO数据库获取相应的疾病蛋白靶标，基于靶点移除前后整体网络拓扑特征的变化评价药物靶点对于网络稳定性的影响，实现和血明目片干预不同疾病药效的预测。通过建立“中药成分-药物靶点-疾病蛋白”关联网络，从中筛选出潜在药物作用靶点并对其进行富集分析，考察和血明目片干预疾病可能的生物学过程和信号通路，最终从体外细胞实验的角度初步对药效进行验证。结果：搜集整理后得到和血明目片所含化学成分946个，预测高可信度靶点761个。通过考察药物扰动疾病网络稳健性，发现和血明目片对翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜新生血管化的疾病网络有较强的扰动作用。通过构建和血明目片干预不同疾病的“中药成分-药物靶点-疾病蛋白”异质网络，获得相应的潜在药物作用靶点，多项富集分析结果显示和血明目片可能通过干预血管新生、白细胞迁移、脂多糖（LPS）应答、核因子κB转录调控、凋亡通路、氧化应激通路等过程来发挥作用。以上4种疾病潜在作用通路与和血明目片的潜在作用通路具有一致性，且体外细胞实验很好地证明了和血明目片对于治疗视网膜损伤具有一定的药效。结论：和血明目片具有“多组成、多靶标、多通路”的特点，对翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜新生血管化等4种适应证存在潜在的治疗作用。

关键词 和血明目片;网络稳健性;富集分析;潜在适应证

Prediction of Potential Indications of Hexuemingmu Tablets Based on Network Robustness

XI Yujie1，2，GAO Jincheng3，GUO Feifei1，YANG Hongjun2，4

（1 Institute of Chinese Materia Medica，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China; 2 Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 301617，China; 3 Shaanxi Provincial Hospital of Chinese Medicine，Xi′an 710003，China; 4 Experimental Research Center，China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100700，China）

Abstract Objective：To predict the potential indications of Hexuemingmu tablets（HXMM tablets） based on the method of medicinal interfering on the network robustness of disease.Methods：The active components of HXMM tablets were collected by Traditional Chinese Medicine Integrated Database（TCMID） and Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform（TCMSP），and the potential targets of components were predicted by Bioinformatics Analysis Tool for Molecular Mechanism of Traditional Chinese Medicine（BATMAN-TCM）.The corresponding protein targets of diseases were obtained from DisGeNET and Human Phenotype Ontology（HPO） databases.The effects of medicine targets on the network robustness were evaluated based on the changes of topological characteristics of the whole network after targets were removed，and the pharmacological effect of HXMM tablets interfering on different diseases were predicted.The correlation network of “Chinese medicine chemical component-medicine target-disease protein” was established，and the potential medicine action targets were screened out to conduct enrichment analysis.The possible biological processes and signal pathways of HXMM tablets interfering on diseases were investigated，and the pharmacological effect was eventually verified by in vitro cell experiments.Results：A total of 946 chemical components of HXMM tablets were obtained and 761 highly credible targets were predicted after collection.By investigating the medicinal interference on the network robustness of disease，this study found that HXMM tablets had a strong interfering effect on the disease networks of the four indications（pterygium，keratitis，ocular hypertension，and corneal neovascularization）.The potential medicine active targets were obtained from the heterogeneous network of “Chinese medicine chemical component-medicine target-disease protein” of different diseases intervened by HXMM tablets.The results of multiple enrichment analyses showed that HXMM tablets may play a role by interfering on angiogenesis，leukocyte traffic，lipopolysaccharide（LPS） response，nuclear factor kappa B（NF-κB） transcriptional regulation，apoptosis pathway，oxidative stress pathway，and so on.The potential action pathways of the four indications and HXMM tablets were consistent.Conclusion：HXMM tablet has potential pharmacological effects on treating the four indications（pterygium，keratitis，ocular hypertension，and corneal neovascularization） with “multi-composition，multi-target，and multi-pathway” characteristics.

Keywords Hexuemingmu tablets; Network robustness; Enrichment analysis; Potential indications

中图分类号：R285;R285.5文献标识码：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.07.004

和血明目片由蒲黄、丹参、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩（炭）、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归、川芎共计19味药组成。全方根据四物汤和二至丸加减[1-2]，其中君药生地黄、当归、赤芍、川芎补散结合，发挥活血化瘀、补血之功，补而不滞，行而不破，药专力宏，墨旱莲、女贞子以滋补肝肾，生精止血为主，为平补虚之良剂;臣药中蒲黄、牡丹皮、丹参、茺蔚子既凉血止血又化瘀利水，和血效佳，山楂、郁金偏于行气导滞，可消积散瘀;黄芩、菊花、龙胆、夏枯草、木贼为佐药，上能疏散风热清利头目，下可清热燥湿泻肝胆火;使药决明子、车前子協同发挥清肝明目、利水通便之效。因此和血明目片具有凉血止血、滋阴化瘀、养肝明目的功效，用于阴虚肝旺，热伤络脉所引起的眼底出血[3]。

和血明目片目前收录在2020版《中华人民共和国药典》中，在年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞等疾病中得到广泛应用[4-6]。现代药理学研究表明该药在早期止血，中后期促进瘀血吸收，改善微循环，扩张血管、抗血栓形成等方面疗效较好[7-8]。基于本课题组开发的药效预测平台调研翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜新生血管化、角膜不透明、锥形杆状肌营养不良症、结膜炎、睑板腺炎、干燥性角膜结膜炎、色素性视网膜炎等相关数据。结果发现和血明目片干预翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜新生血管化的扰动评分大于零，提示和血明目片可能对于以上4种适应证具有潜在治疗作用。

1 资料与方法

1.1 和血明目潜在药物靶点预测 利用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP）和中医药综合数据库（Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID）等数据库获取和血明目片中蒲黄、丹参、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩（炭）、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归、川芎等中药的化学成分信息[9-10]，通过BATMAN-TCM数据库[11]（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）获得药物成分可能发生相互作用的靶标蛋白，并选择其中高可信度（打分值大于30）的蛋白作为药物的潜在靶点。

1.2 疾病数据的搜集 翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜新生血管化、角膜不透明、锥形杆状肌营养不良症、结膜炎、睑板腺炎、干燥性角膜结膜炎、色素性视网膜炎等10种疾病靶标均来源于Human Phenotype Ontology数据库（http：//humanphenotype-ontology.github.io/）和DisGeNET（http：//www.disgenet.org）数据库[12-13]。

1.3 靶标的功能富集分析 药物、疾病的靶标功能分析中涉及的基因本体（Gene Ontology，GO）功能条目的富集分析是由Metascape软件来实现的[14]，具体的原理是基于超几何分布设计的算法，而多重检验校正则使用Benjamini-Hochberg校正方法。

1.4 基于网络稳健性的药物干预疾病能力预测

1.4.1 眼科疾病网络的模 疾病网络由疾病相关的基因之间的相互作用组成。采用来自于STRING[15]（version 10）数据库的置信度大于0.4的蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction，PPI）网络构建（下载于2020年1月26日）。利用Cytoscape（version 3.4.0）对网络进行可视化[16]，计算药物干预前后反映网络稳健性的拓扑特征，包括整体网络的平均最短路径、平均连接度、连接度中心性和紧密度中心性[17]。

1.4.2 药物干预网络稳健性的评价方法 药物干预前后疾病网络拓扑特征的变化[18]，即药物对疾病的扰动作用，可以通过在疾病网络中删除药物靶点来表示。经过R的iGraph包[19]进行计算后，平均最短路径、网络平均连接度、网络连接度中心性和网络紧密度中心性等4个指标可用来作为评价干预前后疾病网络的稳健性。其中，网络的平均连接度是网络中所有节点连接度的平均值;网络的连接度中心性为网络中的所有节点的连接度计算而来;网络的紧密度中心性也是由网络中所有节点的紧密度计算得出，以上3个数值大小均与网络稳健性正相关，数值越大网络越稳定，药物对疾病网络的干预作用相对越弱。而平均最短路径代表网络当中所有最短路径长度的平均值，数值越小网络越稳定，正扰动率说明药物对网络稳定性破坏能力强。根据以上指标相互作用关系，扰动率计算公式可表示为：校正前扰动率=（药物干预后拓扑特征值-药物干预前拓扑特征值）/药物干预前拓扑特征值。而该扰动率通过零分布（Null distribution）校正后才可用于不同药物的扰动率比较，校正方法见1.4.3部分。药物扰动总分计算公式如下，公式中的扰动率均利用Null distribution校正：扰动总分=校正后的平均最短路径扰动率-校正后平均连接度扰动率-校正后连接度中心性扰动率-校正后紧密度中心性扰动率。

1.4.3 利用药物干预随机网络的Null distribution作为总体分布校正药物对于真实网络的扰动率 由于药物作用靶点大多属于总体分布未知的小样本数据，因此在进行显著性考察时常使用置换检验（Permutation test）。疾病网络零分布（Null distribution）的实质是在保留真实网络节点数和边数后生成随机的网络的拓扑特征值。随机网络构成的Null distribution可作为基准，与真实疾病网络的药物作用进行比较，考察在相同的药物扰动后，其扰动率的总体分布以及真实网络和随机网络之间的网络稳健性是否存在显著差异。通过与100个随机网络产生的Null distribution比较，真实网络的扰动率能比较客观地评价药物在实际疾病网络中引起显著影响的干扰程度。此外，利用药物在真实网络扰动率在Null distribution中对应的Z-score可用于评价校正后的网络稳健性的扰动率。Z-score越大，表明药物干预后网络稳健性越差，药物对疾病网络的影响越大。

1.5 “中药成分-药物靶点-疾病蛋白”异质网络的构建 基于网络稳健性原理，将前期预测到的潜在药物靶点及疾病数据导入中药药效预测平台开展相关研究[10]，得到相应的扰动总分及“中药成分-药物靶点-疾病蛋白”的异质网络，该网络呈现了中药成分与疾病之间以及疾病蛋白与药物靶点之间的关联关系，为中药干预疾病的机制探索提供线索。该网络包含了3种类型的节点，不同类型的结果分别使用不同的颜色和形状来表示。其中粉色三角形表示中药组成成分，蓝色菱形表示药物的潜在靶标，紫色圆形表示与适应证相关的疾病蛋白。网络还包含了2种联系（边），分别为化合物与靶标的联系（通过BATMAN-TCM来预测，打分大于30）、药物靶点与疾病蛋白的PPI关系（来源于STRING数据库中打分大于0.4的PPI）。为了考察和血明目片干预潜在适应证可能参与的生物学过程，通过计算红色矩形中药物作用的潜在靶标（疾病蛋白与药物靶点的交集）的网络拓扑特征值，筛选连接度（Degree）大于中位数的值进行GO生物学富集分析。

1.6 和血明目片干预潜在适应证的作用特点探索  根据上述和血明目片干预潜在适应证的疾病蛋白富集分析结果，整理显著性排名前5位的生物学过程。进行和血明目片作用于适应证的环节探索。基于前期预测的潜在适应证药物的潜在作用靶标，通过计算其网络拓扑特征值，筛选大于二倍Degree的靶标，认为可能是疾病核心作用靶标。将所有潜在适应证的疾病核心作用靶标取交集，并进行作用特点探索。

1.7 分子生物学实验验证

1.7.1 细胞 人视网膜上皮细胞ARPE-19（ATCC，美国，批号：20210603），培养条件为1640培养基添加10%胎牛血清（Fetal Bovine Serum，FBS）和1%青霉素-链霉素（Penicillin-Streptomycin，PS），二氧化碳培养箱内培养（温度：37 ℃，湿度：100%，5% CO2和95% O2）。

1.7.2 药物 和血明目片药粉（西安碑林药业股份有限公司，生产批号：20210428）。

1.7.3 试剂与仪器 RPMI-1640培养基（货号：11875093）、胎牛血清（货号：1600044）、青-链霉素混合液（货号：15070063）、胰蛋白酶-乙二胺四乙酸消化液（货号：25200072）、磷酸盐缓冲液（货号：10010023）以上均购美国GIBCO公司;细胞冻存液（苏州新赛美生物科技有限公司，货号：C40100），CCK-8检测试剂盒（Dojindo公司，日本，货号：CK04），贝伐单抗（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：B303060），氯化钠（NaCl，北京化工厂，批号：20160223），氯化钾（KCl，批号：20130612）、碳酸氢钠（NaHCO3，批号：20150326）、磷酸二氢钠（NaHPO3，批号：20090727）、氯化镁（MgCl2，批号：F20080103）、氯化钙（CaCl2，批号：F20090602）、葡萄糖（C6H12O6，批号：20150303）、以上均购自国药集团化学试剂北京有限公司。CO2培养箱（SANYO公司，日本，型号：MCO-18AIC），超净工作台（苏州净化设备厂，型号：SW-CF-2FD），倒置显微镜（OLYMPUS公司，日本，型号：CKX41），酶联免疫检测仪（Thermo Fisher Scientific公司，美国，型号：MμltiskanTM FC），-86 ℃超低温冰箱（青岛海尔特种电器有限公司，型号：DW-86L728），离体肠灌流系统（上海奥尔科特生物科技有限公司，型号：ALC-M），电子天平（METTLER TOLEDO公司，瑞士，型号：ME54），台式循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司，型号：SHB-Ⅲ），96孔板（型号：3599）、T25细胞培养瓶（型号：430639）以上购于美国Corning公司。

1.7.4 含药肠吸收液的制备

1.7.4.1 台式缓冲液的配制 NaCl 8.0 g，NaHCO3 1.0 g，KCl 0.28 g，MgCl20.1 g，NaH2PO4 0.05 g溶于500 mL蒸馏水中，密闭冷藏;CaCl2 0.2 g溶于500 mL蒸馏水中密闭冷藏;使用将前二者均匀搅拌，最后加入葡萄糖1.0 g混合即可。

1.7.4.2 含药肠吸收液的制备 将实验前禁食12 h的大鼠称重后，断颈椎处死，沿腹中线和腹白线分别剪开皮肤与肌肉。迅速取出小肠，自胃幽门以下10 cm开始向下为空肠段，自胃幽门以下10 cm开始向下量取14 cm为肠段1;间隔10 cm量取14 cm为肠段2;再间隔10 cm量取14 cm为肠段3;从回盲瓣以上5 cm开始向上取14 cm为肠段4。将剪下的肠管放入0 ℃台氏液中冲洗至无肠内容物为止。将自制硅胶套管软端插入肠管用丝线结扎，小心将肠道翻转。用0 ℃台氏液冲洗内表面，将另一端用丝线结扎成囊状。麦氏浴管中预先加入含药供试药液25 mL，通入混合气体（95% O2，5% CO2），保持37 ℃恒温。在肠管中注入台氏液2 mL，放入麦氏浴管中，120 min后收取样品。样品放入干净的离心管中，于-80 ℃密封直立保存，待用[20]。

1.7.5 方法

1.7.5.1 分組与模型制备 取人视网膜上皮细胞正常复苏，使用含10%胎牛血清的1640培养基，于37 ℃，5% CO2，95%O2条件下进行正常培养。将细胞分为正常对照组、模型组、贝伐单抗-阳性药组（1 mg/mL）、和血明目肠吸收液低浓度组（600 μg/mL）、中浓度组（300 μg/mL）、低浓度组（150 μg/mL）。待ARPE-19细胞密度达到70%～80%时，倾倒原培养液，改用无血清培养基饥饿处理12 h，不同浓度过氧化氢（80、100、150、200、300 μmol/L）处理2 h后终止培养，每孔小心加入10 μL CCK-8溶液，尽量避免气泡的产生，放入培养箱内避光孵育1～4 h，酶标仪于450 nm下测量孔板的吸光度（A）值，计算细胞存活率，公式为细胞成活率=（A观察组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%。

1.7.5.2 给药方法 常规培养ARPE-19细胞，待ARPE-19细胞密度达到对数成长期时配制成混悬液，接种在96孔板，接种密度为2×104个细胞/孔。过夜培养细胞后进行饥饿处理12 h，正常组与模型组加入无血清培养基，给药组加入高中低不同浓度的和血明目肠吸收液，作用细胞24 h，随后造模2 h，最后使用CCK-8法测定其细胞成活率。

1.7.6 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.3.0统计软件进行数据分析，计量资料均以均数±标准差（±s）表示，多组间均数比较采用Kruskal-Wallis H检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 和血明目片潜在药物靶点及潜在机制分析   基于上述方法得到和血明目片所含化学成分226个，高可信度靶标854个。富集分析结果表明和血明目片的潜在靶标富集的GO生物学功能条目包括血液循环（Blood Circulation）、脂质生物合成（Lipid Biosynthetic Process）、氧化应激（Response to Oxidative Stress，Reactive Oxygen Species Metabolic Process）、血管收缩（Positive Regulation of Vasoconstriction）等。见图1。

图1 药物潜在作用靶标GO功能富集分析气泡图  注：横坐标代表Enrichment，纵坐标代表-Log（q-value），节点大小与之匹配的靶标的数目有关

2.2 和血明目片干预疾病网络稳健性分析 按照扰动总分对搜集获得的9类适应证由大至小进行排序。结果显示，和血明目片干预9个潜在适应证后，扰动总分大于0的共有4个，分别为翼状胬肉、角膜炎、高眼压症和角膜新生血管化，扰动总分小于0的共有5个。见表2。

2.3 和血明目片干预翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜血管新生化的机制预测 和血明目片干预翼状胬肉的“中药成分-药物靶点-疾病蛋白”异质网络，包含了221个和血明目片的组成化合物、64个和血明目片的潜在靶标以及122个与药物关联的疾病蛋白。其中，节点的Degree值排名前列的关键靶点有TP53、AKT1、EGFR、EGF、FN1等。见图2A。和血明目片干预角膜炎的“中药成分-药物靶标-疾病蛋白”异质网络，包含了216个和血明目片的组成化合物、41个和血明目片的潜在靶标以及95个与药物关联的疾病蛋白。其中，节点的Degree值排名前列的关键靶点有IL-10、IL-6、APOE及CAT等。见图2B。和血明目片干预高眼压症的“中药成分-药物靶标-疾病蛋白”异质网络，包含了236个和血明目片的组成化合物、33个和血明目片的潜在靶标以及47个与药物关联的疾病蛋白。其中，节点的Degree值排名前列的关键靶点有NR3C1、FAS、JUN、SHH及IL-1β等。见图2C。和血明目片干预角膜新生血管化的“中药成分-药物靶标-疾病蛋白”异质网络，包含了189个和血明目片的组成化合物、32个和血明目片的潜在靶标以及59个与药物关联的疾病蛋白。其中，节点的Degree值排名前列的关键靶点有CTNNB1、FGF2、IL-6、APOE及AKT1等。見图2D。

和血明目片干预翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜血管新生化等适应证中与药物作用相关的疾病靶标功能富集分析。其中，和血明目片干预翼状胬肉显著富集排名前5的生物学过程分别为血管新生（Blood Vessel Development，Angiogenesis）、细胞外基质（Extracellular Matrix）、氧化损伤（Response to Wounding，Response to Oxygen Levels）、细胞增殖（Muscle Cell Proliferation）及转移酶活性调节（Positive Regulation of Transferase activity）等。见图3A。和血明目片干预角膜炎中位居前列显著富集的生物学过程分别为炎症反应（Inflammation Response）、脂多糖反应（Response to Lipopolysaccharide）、白细胞迁移（Leukocyte Migration）、核因子κB转录因子活性调节（Positive Regulation of NF-kappa B Transcription Factor Activity）及MAPK级联的正向调节（Positive Regulation of MAPK Cascade）等。见图3B。和血明目片干预高眼压症中位居前列显著富集的生物学过程分别为凋亡信号通路（Apoptotic Signaling Pathway）、MAPK级联的正向调节（Positive regulation of MAPK Cascade）、上皮细胞增殖（Epithlial Cell Proliferation）、血管新生（Blood Vessel Development）及细胞损伤（Response to Wounding）等。见图3C。和血明目片干预角膜新生血管化中位居前列显著富集的生物学过程分别为血管新生（Blood Vessel Development，Vasculature Development）、细胞迁移（Positive Regulation of Cell Migration）、炎症反应（Inflammation Response）、上皮细胞增殖（Epithlial Cell Proliferation）及MAPK级联调节（Regulation of MAPK Cascade）等。见图3D。

2.4 和血明目干预4个潜在适应证靶点作用特点  血管新生和细胞增殖可能是和血明目片作用于翼状胬肉，高眼压症和角膜血管新生化共有的2个环节;MAPK级联调节可能是角膜炎，高眼压症和角膜血管新生化的共有环节;炎症反应可能是角膜炎和角膜血管新生化的共有环节。见表3。通过筛选疾病核心作用靶标的网络拓扑特征值，得到治疗翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜新生血管化疾病核心作用靶点分别为64、41、33、32个。见图4。其中出现次数最多的共同核心靶点有MMP9、CXCR4、IL6和IL1B。翼状胬肉与高眼压症的共有靶点有TP53、JUN，角膜炎和高眼压症共有靶点有核因子κB1，高眼压症与角膜血管新生化共有靶点有ALB，角膜炎与角膜血管新生化特异性共有靶标有4个，分别是APOE、CCL2、IKBKB、TSPO。

2.5 实验验证

2.5.1 过氧化氢诱导ARPE-19细胞损伤 与正常组比较，过氧化氢浓度在150～300 μmol/L范围内的细胞成活率均有统计学意义（P<0.05），后续实验均选择接近半数抑制浓度的200 μmol/L的过氧化氢进行造模。见表4。

2.5.2 和血明目方对ARPE-19细胞的保护作用   相较于模型组，预防给药24 h后，浓度为600 μg/mL的和血明目方高剂量组的细胞活力较为显著（P<0.01），300 μg/mL的和血明目中剂量组和1 mg/mL的贝伐单抗阳性药的细胞活力差异有统计学意义（P<0.05）。见图5。

3 讨论

作为中华民族的文明瑰宝，中医药以其独有的自身优势保持着强大的生命力，然而随着现代科学飞速发展，国民健康意识的不断提高，中药的活性成分辨识、药效物质基础研究、作用机制科学阐释等复杂体系解析已成为当代重大前沿科学问题。本研究通过构建“中药成分-药物靶点-疾病蛋白”的关联网络，考察和血明目片对于多种眼科疾病网络的扰动作用，预测和血明目片潜在的适应证，为中药复杂机制阐释提供了一定线索。

根据和血明目片潜在药物靶点富集分析结果显示，其生物学功能主要与血液循环、氧化应激应答、血管收缩等调控密切相关，这与和血明目片临床应用一致，说明该药可能通过调控血液循环或氧化应激等生物过程来干预眼科相关疾病。基于中药药效预测平台分析结果推测和血明目片对于翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜新生血管化等4种疾病存在一定干预作用。表皮生长因子受体在抗血管生成、细胞增殖及细胞凋亡方面已取得公认的疗效[21]，提示这些蛋白可能是HXMM治疗翼状胬肉的重要效应蛋白。研究表明翼状胬肉的形成受环境因素的影响，同时与细胞凋亡、血管新生、基质金属蛋白酶以及病毒感染有关[22]。因此和血明目可能通过调控氧化应激等过程来影响细胞凋亡，同时也通过调控血管形成来干预疾病的发生。和血明目片还可能通过干预炎症反应白细胞迁移、脂多糖（LPS）应答、核因子κB转录调控等功能来发挥作用。前人研究证实角膜炎的发生主要与免疫炎症，细菌感染相关结论一致，由此预测和血明目可能通过调控免疫炎症等过程来干预角膜炎的发生[23]。研究表明高眼压症的发病因素与全身系统相关，主要涉及糖尿病、高血压，以及阻塞性睡眠呼吸暂停综合征等[24]。因此，和血明目片可能通过调控以上环节来干预高眼压症发生。在不同的疾病中，导致角膜新生血管形成的主要因素不同，例如角膜移植中的宿主免疫反应、角膜缘干细胞缺乏中干细胞的维持和分化、接触镜相关眼病中的缺氧、单纯疱疹角膜炎中的病毒感染[25]。因此，和血明目可能通过调控血管新生、炎症反应、氧化应激以及凋亡等过程来干预疾病的发生。本研究得到4个共同核心靶点基质金属蛋白酶P9、趋化因子CXC亚家族受体4、白细胞介素6和白细胞介素-1β，这些靶点通常参与炎症反应、趋化因子表达等环节，提示和血明目可能主要通过改善炎症反应治疗其潜在适应证;翼状胬肉与高眼压症的共有靶点有肿瘤蛋白53、Jun，这些靶点的相关通路常与凋亡相关[26-27];角膜炎和高眼压症共有靶点有核因子κB1，提示这2种疾病的特异性环节可能与免疫调节介导的核因子κB信号通路密切相关[28];而白蛋白作为高眼压症与角膜血管新生化共有靶标与凝血功能异常以及体液免疫密切相关[29-30];角膜炎与角膜血管新生化特异性共有靶标有4个，分别是载脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）、C-C基序趋化因子配体2（C-C Motif Chemokine Ligand2，CCL2）、核因子κB激酶亚基B抑制剂（Inhibitor of Nuclear Factor Kappa B Kinase Subunit B，IKKbeta）、转运体蛋白（Translocator Protein，TSPO），主要参与脂质代谢、免疫应答等[31-32]。而在得到和血明目干预4种适应证的特异性靶标后，通过文献分析发现。翼状胬肉代表性环节集中在血管新生、凋亡（表皮生長因子受体、FOS、JUN）[33];角膜炎则为炎症反应为主（IL10、胰岛素样生长因子、TAT）[34];干预高眼压症以凝血、氧化应激为主要特点（载脂蛋白1、C3、超氧化物歧化酶1、β型转化生长因子1）[35];角膜血管新生化以血管新生为药效环节代表（血管紧张肽原、血纤蛋白溶解酶原、过氧化物酶体增殖物激活受体）[36-37]。以上结果进一步表明和血明目片可能针对血管新生、炎症反应、氧化应激等环节进行潜在适应证的干预。

中医学中认为翼状胬肉多因心肺二经风热壅盛导致虚火上炎、气滞血瘀[38-39]，和血明目片可以清热泻火、理气活血为主发挥药效;角膜炎大多属于外感风热或热毒上攻[40-41]，和血明目片可通过祛风解表、清肝泻火进行治疗;高眼压症常与心火旺盛、肝肾阴虚导致的机体失调密切相关[24，42]，临床可利用和血明目片活血化瘀、清肝明目及滋补肝肾等功效进行治疗;角膜血管新生化则属于“血翳包睛”等范畴[43-44]，系体内脏腑热毒壅盛，瘀血凝结所致，因此和血明目可以泻火解毒、活血破瘀、滋补肝肾等为用药依据。此外，和血明目片针对阴虚肝旺，热伤络脉等证型所引起的眼部病变的疗效已经得到临床证实，与翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜新生血管化的治则存在一定的关联，进一步提示和血明目片对于上述适应证的潜在治疗作用。本研究虽然不能直接确定其潜在适应证，但为前期临床探索指明了方向，提供了线索，在体外实验的基础上初步说明和血明目方对于视网膜损伤具有一定的保护作用，一定程度上快速确定实验验证的范围，减少实验验证的工作量，节约时间和成本。后期计划围绕其潜在适应证的作用机制对其中的具体作用环节进行精细化分析，寻找临床中具有相似作用机制的西药进行比较，针对疾病共有环节及特殊环节的作用靶标进行相关的体内外实验验证，其中和血明目片干预4种适应证的共有环节为炎症反应，可以重点关注其相关指标白细胞介素6、白细胞介素1β、肿瘤坏死因子等指标进行验证，而翼状胬肉、高眼压症、角膜血管新生化的特有环节为氧化应激，则可以通过检测超氧化物歧化酶、活性氧等金指标进行药效验证。

綜上所述，基于整合药物和靶标预测的相互作用关系，发现和血明目片对于翼状胬肉、角膜炎、高眼压症、角膜新生血管化等疾病有较强的干预作用。随后通过文献考察相关适应证的生物学过程及通路进一步验证我们的结论。通过开发的药物对于网络稳健性扰动的评价算法，进行药物潜在适应证的预测，为药物的二次开发和精准定位提供了思路，更为中药复杂机制解析提供参考，希望未来可以应用在更多中药复方的研究当中。

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（2022-03-10收稿 本文编辑：王明）