对WHO预防传染病mRNA疫苗设计和开发评估要点的分析和探究

佟乐

中国食品药品检定研究院

孙巍

中国食品药品检定研究院

杨亚莉

中国食品药品检定研究院

王佑春

中国食品药品检定研究院

杨振＊

中国食品药品检定研究院

新型冠状病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）的流行不仅严重威胁了公众健康，同时对生物制品的发展产生了深远影响。当前，新冠病毒疫苗临床试验进展迅速，多项产品已获批上市后广泛使用，现有的技术平台主要包括灭活疫苗、蛋白亚单位疫苗、蛋白亚单位佐剂疫苗、非复制性载体疫苗、多肽疫苗、脂质颗粒的mRNA 疫苗等。在众多技术平台中，mRNA 疫苗凭借其平台化的生产方式，通常编码不同抗原的mRNA 具有相似理化性质，新mRNA 疫苗的配方设计和生产过程遵循相同的步骤，具有易于开发且生产工艺相对稳定等特性[1]，受到各方面的广泛关注。本文基于mRNA 技术特点，结合WHO 最新发布的《关于预防传染病mRNA 疫苗质量、安全性及有效性评估的法规考虑》[2]（Evaluation of the Quality,Safety and Efficacy of Messenger RNA Vaccines for the Prevention of Infectious Diseases:Regulatory Considerations），对mRNA疫苗产品设计和开发中需要着重考虑的关键点进行分析和探究。

1 mRNA 技术的主要特点及设计要点

目前处于临床开发最前沿的mRNA 疫苗或广泛用于预防新冠病毒的mRNA 疫苗是通过酶的方式制备，这种方式不同于其他多数生物制品[3-4]，其产生免疫原性的mRNA 是通过体外转录技术合成的，并利用合适的递送系统将mRNA 运输进入人体，依靠细胞自身的翻译系统将mRNA 翻译成目标蛋白，从而达到临床治疗或预防的目的[5-6]。

1.1 mRNA 的合成和修饰

目前，mRNA 的合成方式主要有2种[2]：一种类似于DNA 疫苗的生产方法，由细菌扩增的线性化DNA 质粒制备；另一种方式是通过聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）或其他合成方法以酶的方式制备线性DNA 分子。无论是源于质粒DNA 产生的线性化分子，还是线性DNA 序列，均是通过DNA 依赖性的RNA 聚合酶在体外以酶的方式将线性DNA 模板转录成mRNA 分子的。

在mRNA 合成中使用的是天然存在的核苷或修饰核苷[7-8]。修饰核苷主要包括使用假尿苷或N1-甲基假尿苷来代替尿苷[7，9-10]，其可以引发mRNA 二级结构的整体变化，从而达到更高水平的蛋白质表达。此外，通过对目的抗原序列进行修饰或优化，可以改进mRNA 的体内稳定性，调节蛋白的翻译能力。例如，可根据临床提示，通过适当修饰减少固有免疫应答，减少体内炎症反应[7，9-10]。或者，对于某些预防性疫苗，一些固有免疫应答可能有助于增强所需的获得性免疫应答，mRNA 也可以相应地设计。编码目的抗原的基因序列一般应包含起始和终止密码子的开放阅读框（open reading frame，ORF），两侧有5'和3'的非翻译区（untranslated region，UTR），通常还包括一个5'帽子和3' poly（A）尾。帽子可通过酶添加到mRNA 上或在体外转录中使用适当的帽子类似物，同样，3' poly（A）尾也可编码在DNA 模板中或在体外转录后通过酶的方式添加。

目前处于临床开发最前沿的mRNA 疫苗或广泛用于预防新冠病毒的mRNA 疫苗是通过酶的方式制备，这种方式不同于其他多数生物制品，其产生免疫原性的mRNA 是通过体外转录技术合成的，并利用合适的递送系统将mRNA 运输进入人体，依靠细胞自身的翻译系统将mRNA翻译成目标蛋白，从而达到临床治疗或预防的目的。

1.2 mRNA 的结构元件

如上所述，体外转录合成的mRNA 一般包括帽子结构、UTR、编码抗原蛋白的ORF 和poly（A）尾等结构元件，这些结构元件对于维持mRNA 的稳定性和调控翻译能力均至关重要。帽子结构类似于真核细胞中的帽子，包含一个7-甲基鸟苷，通过三磷酸桥接到mRNA 的5'端。其作用是阻止mRNA 被细胞中识别病毒RNA 的传感器识别，避免不必要的免疫应答，并保护mRNA 不被核酸外切酶降解[11]。poly（A）尾可以间接影响mRNA 翻译和半衰期，其通常与帽子、poly（A）结合蛋白和翻译起始因子蛋白协作，使mRNA 环化，并招募核糖体启动翻译[11-12]。在该过程中，poly（A）尾的长度（100～150bp）至关重要，其长度需要确保能够与poly（A）结合蛋白相互作用，形成必要复合物，从而启动翻译[12-13]和保护帽子不被脱帽酶降解[14]。编码区两侧的UTR 用于调控mRNA 的翻译、半衰期和亚细胞定位[11，15]，通常来源于高表达基因中的UTR，如α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因，是合成mRNAs 的首选[16]。但UTR 的作用因细胞类型而异，需要结合预期用途和细胞类型对UTR 进行有针对性的修饰[17-19]，以减少mRNA 的降解，这些修饰包括去除miRNA 的结合位点[17-19]和3' UTR中富含腺苷酸和尿苷酸的区域[20]。ORF 作为最重要的结构元件，其主要功能是编码翻译蛋白质的序列。对于自扩增mRNA（self-amplifying mRNA，samRNA），其编码区除能编码目的抗原外，还能编码特定病毒（如甲病毒）的非结构性蛋白，其可与抗原在同一分子上，也可在单独分子上。当细胞内表达时，这些ORFs 将合成具有病毒复制机制的蛋白，使细胞产生多个编码抗原蛋白的mRNA，从而潜在地增加疫苗的效力[21]。

1.3 递送mRNA 疫苗载体

为确保不被核酸酶降解，mRNA 被整合到具有保护性脂质，并在进入目的细胞后及时释放。目前，脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles，LNPs）是临床进展最快的mRNA 递送技术，所有获得授权使用的新冠mRNA 疫苗均采用LNPs 作为载体。LNPs 由多种脂质组成，其成份包括但不限于可电离/阳离子脂质、辅助脂质（如磷脂和/或胆固醇）和通过聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）修饰的脂质。阳离子脂质通常携带正电荷，可以促使与带有负电荷的mRNA 结合，易于递送，但其明显的缺点是会诱发毒性促细胞凋亡和促炎症反应[22-23]，而后续开发的可电离脂质则完美地解决了这些问题，并在mRNA 的包封和递送中发挥了重要作用。可电离脂质在生理pH 时呈中性，避免阳离子脂质所存在的安全性问题，同时延长了在血液循环中的驻留时间[24]。当转变为酸性环境时，可电离脂质又转为正电性，可以促使其与mRNA 结合生成LNPs。同时，当被细胞摄取进入内体后，内体的酸性环境会让其重新携带正电荷，从而促进与内体细胞膜的融合，将mRNA 释放到细胞质中[22-23]。胆固醇是一种天然形成的脂质，通过填补脂质间的空隙来增强纳米颗粒的稳定性，并在细胞摄取时帮助脂质体与内体细胞膜的融合[25]。辅助脂质分子调节纳米颗粒的流动性，并且辅助与内体的细胞膜融合[26-27]。PEG 修饰的脂质成份提高LNPs 的稳定性，而且通过限制脂质融合调节纳米颗粒的大小[28]，并通过减少与巨噬细胞的非特异性相互作用来提高纳米颗粒的半衰期[29]。

2 WHO 评价mRNA 疫苗设计和开发的指导性文件

随着新冠候选疫苗的临床试验进展迅速，已有多个mRNA 疫苗产品获批上市并广泛使用，这迫切需要世界卫生组织（World Health Organization，WHO）出具指南对人用预防传染病mRNA 疫苗的质量、安全性和有效性进行评估。为此，WHO 经过多次修订和征求意见，于2021年10月22日在生物制品标准化专家委员会（Expert Committee Biological Standardization，ECBS）第74 届会议上审议通过了《关于预防传染病mRNA 疫苗质量、安全性及有效性评估的法规考虑》[2]，该指导性文件不仅为mRNA 疫苗设计和开发提供了指导，还明确了mRNA 疫苗生产和质量控制、临床和非临床中安全性和有效性评价的相关考虑要点，同时也促进了该类疫苗全球采购和流通使用。

鉴于目前对mRNA 技术的作用机制了解尚少，各企业的生产工艺、质量标准甚至检测方法等还没有完全公开，临床前和临床试验数据还有限，而且该项技术发展和更新也非常迅速，安全性和有效性也需要较长时间的观察等因素，并考虑到当前新冠肺炎疫情大流行以及新冠mRNA 疫苗的研发速度，此次WHO 制定的“法规考虑”不同于以往的“指导原则”，其仅针对LNPs 包封mRNA 和sa-mRNA 在体内递送与传染病预防主动免疫相关目的抗原编码序列的情形，并以新冠mRNA 疫苗作为示例，旨在尽快为此类疫苗研发提供指导，同时还兼顾了需要开发的多价mRNA 疫苗或针对某些病原体（如流感病毒或SARS-CoV-2）改变现有疫苗株的考虑要点。同时，作为一项新兴的技术，WHO 建议每种mRNA 疫苗都要从其收益和风险角度进行评估，并结合现行WHO 关于疫苗非临床评价[30]、临床评价[31]、疫苗佐剂和含佐剂疫苗非临床评价[32]、药品生产质量管理规范[33]和生物制品生产质量管理规范[34]等多个指导原则共同考虑。

3 WHO 评价mRNA 疫苗设计中的考虑要点

ICH Q8 提出质量源于设计（quality by design，QbD）的药品质量管理理念，即药物开发的目的是设计出高质量的产品[35]。因此，WHO认为评估mRNA 疫苗设计是否合理，应从其质量、安全性和有效性等方面考虑，并结合mRNA 技术的特性，着重关注以下方面：mRNA 固有免疫、理化和结构特性；递送系统的适宜性，即能否确保mRNA 的体内稳定性和递送效率；新型无细胞的酶工艺生产特点，如对线性DNA 模板和杂质的控制。这些要点对于mRNA 疫苗的质量、安全性和有效性至关重要。

3.1 对mRNA 固有免疫、理化和结构特性的考虑要点

免疫原性是由mRNA 所编码的目的抗原所引起的，这是mRNA 疫苗极为重要的一项特征。因此，应首先关注mRNA 的相关生物学特性，包括mRNA 触发固有免疫应答以及目的抗原特异性应答的能力，免疫应答的质量、数量和偏差[如1 型辅助性T 细胞（Th1）或Th2 细胞表型]和体内稳定性，同时并获悉与特定病原体和疾病相关的免疫类型的信息（保护性和免疫致病性），以验证疫苗设计的合理性。

其次，对目的抗原的选择是评价mRNA 疫苗开发的基础，应明确目的抗原的选择依据、抗原序列元件结构及其表达蛋白对疫苗作用机制的贡献，包括所有ORF（预期外ORF）和其他序列元件的完整序列和注释，对特定的或特别设计的非编码序列[poly（A）尾]和结构元件（如5'帽子或替代物）应提供合理理由。对于sa-mRNA，应详细说明所有编码在疫苗结构中用于mRNA 递送后在人体细胞中扩增的病毒复制子基因。应指出编码在mRNA中的每段基因序列和特定的非编码和结构元件的预期功能和目的，说明其对整体作用机制的贡献。

结构特征方面，RNA 通常以单链存在，但在体外转录中也可能形成由短双链片段和中间各种单链环组成的双链RNA(dsRNA)，这类dsRNA 作为某些RNA 病毒基因组的一种呈现形式，能够被细胞内的受体感知，诱导细胞激发免疫应答作为对病毒感染的固有反应。对于此类免疫应答，需要在疫苗设计、非临床研究和临床试验中进行定性。此外，不同的mRNA 会导致所形成的LNPsmRNA 的颗粒大小、形态、表面性质（如电荷）和包封率的不同，这取决于mRNA 的长度、二级结构和LNPs中的脂质成份。因此，有必要同时对mRNA 和LNPs 的关键质量属性和理化特性进行考虑，以便人们更加了解成品制剂所期待的特性。

3.2 对LNPs 的考虑要点

对于LNPs，应明确所有可能影响疫苗安全性、免疫原性和有效性的特征。首先，脂质来源和质量信息应足够详细，特别是在LNPs中含有未开展过非临床或临床研究的新型脂质，以便对其安全性和质量进行有意义的评价。例如，对含有阳离子脂质的LNPs，在可行的情况下，应提供其生产工艺和检定的详细信息，包括起始材料和任何中间产物的信息和相关论证。如果适用，还应考虑对（阳离子）脂质进行亚硝胺风险评估。此外，由于PEG 化脂质可增强LNPs 体内稳定性和细胞相互作用[36]，应对PEG 化脂质的分子量、多分散性和分子百分比进行充分检定。其次，应对包封技术和生产工艺进行不断探索和优化，如考虑不同脂质的浓度、mRNA-脂质比、缓冲剂/溶剂的pH、mRNA 包裹效率、mRNA 和脂质的流速和混合率，以及不同成份的解冻温度，以实现对mRNA 包裹进入LNPs 的过程进行细致控制。同时，还应对LNPs-mRNA 及其在目的细胞中的摄取进行充分研究，包括了解合成LNPs-mRNA 的表面化学、大小、多分散性、形状、电荷和蛋白质结合特性，确保对mRNA 的充分保护和疫苗达到必要稳定性。此外，有些LNPs 根据其成份也可能具有免疫调节作用[37-39]，应明确其潜在的收益和不良反应的相关信息，并在关键质量属性、非临床和临床评价中加以考虑。

3.3 对线性DNA 模板的考虑要点

线性DNA 模板被认为是mRNA 合成的起始材料。应明确线性DNA 模板的来源和原材料，对于动物（包括人类）来源的成份应特别注意。对于已有证据证明或风险评估的具有潜在外源因子的起始材料应确保已去除或加以控制。此外，需要特别注意的是，尽管mRNA 疫苗生产的起始材料是线性DNA 模板，但其可能来源于上游材料，如重组细胞库中扩增的DNA 质粒。为此，应建立细胞库系统，说明微生物负荷测定和鉴别情况，并验证种子库的遗传稳定性。如果poly（A）尾编码在质粒DNA 上，则应特别测定DNA 质粒上该区域的重组率。此外，应通过纯化工艺减少DNA 质粒中的杂质。

3.4 对杂质控制的考虑要点

对于潜在杂质，如起始材料中引入的杂质，以及mRNA 纯化中产品相关或工艺相关的杂质，应进行描述和研究。这些杂质一般包括：细菌宿主细胞残留蛋白、残留RNA 和染色体DNA（如用于生产DNA 模板）、内毒素、酶（如DNA 和RNA 聚合酶和限制性内切酶）、未结合的核苷、dsRNA、不完整或不同大小的RNA，以及其他生产工艺中所用的材料。应提供mRNA 纯化后所含杂质的数据，用于验证标准设置中最大接受范围或最低能达到的水平。对于已知或具有潜在毒性作用的杂质和残余物，应开展毒理风险评估。对包封过程中所使用的脂质产生的潜在（工艺和产品相关）杂质也应进行定性分析和研究，并对设定的杂质标准的临界值进行论证，以便能够对其适当检定和达到临床接受范围。

3.5 对sa-mRNA 疫苗的考虑要点

目前，sa-mRNA 也可包封于LNPs中[21]，主要有2种形式：一种是其复制子与抗原基因在一个读码框中，另一种是其复制子在单独的读码框中。2种设计中合成的LNPs 颗粒大小和形态特征可能不同，将导致疫苗不同的安全性和有效性。此外，2种设计中的表达效率、dsRNA 含量、固有免疫应答、mRNA 和sa-mRNA 半衰期等方面的差异，会使达到相同药效水平所需的mRNA 总量可能有所不同，也可能导致疫苗安全性的不同，需要在疫苗设计和评价中加以考虑。另外，相比于病毒复制子（包装成病毒结构蛋白），sa-mRNA是通过LNPs 或其他递送系统传递的，这意味着，细胞摄取sa-mRNA 可能不同于摄取病毒复制子，因为病毒复制子是通过病毒受体进入宿主细胞的，而sa-mRNA 是依靠细胞内的递送系统，这些因素在sa-mRNA 疫苗设计中应加以考虑。

4 未来mRNA 疫苗开发中还需要考虑的问题

由于疫苗的作用机制仍未研究透彻，且病原体仍不断变异，未来还需对疫苗进行不断优化和改进，而WHO 此次颁布的《关于预防传染病mRNA 疫苗质量、安全性及有效性评估的法规考虑》中也针对进一步优化疫苗，以及开发多价mRNA 疫苗或针对某些病原体（如流感病毒或SARS-CoV-2）改变现有疫苗株，提出了相应的考虑要点。

4.1 对优化递送系统的考虑

就当前mRNA 疫苗而言，注射部位的各种细胞类型都会摄取mRNA。然而，未来的递送系统可以设计成选择性地将mRNA 靶向特定的细胞类型或组织——如使用表面修饰的LNPs，将靶向配体/基序可以附着在LNPs 表面。任何理化性质的改变，都可能导致固有免疫刺激作用的不同，进而影响mRNA 或sa-mRNA 疫苗安全性或有效性。此外，鉴于当前近乎苛刻的贮运条件要求，未来应考虑开发耐热性更强的疫苗递送系统，以促进全球使用。

4.2 对疫苗更新的考虑

由于病毒的不断变异，如何更新疫苗株，确保疫苗持续达到对变异株的最佳保护效果是研发者需要考虑的问题，通常来说，所选择的疫苗株应在抗原性和基因进化方面与流行的毒株相近。对于mRNA 技术平台，当选定适合的目的抗原序列后，其开发的优势在于如果本质上未改变疫苗的生产工艺、检测项目或技术参数，则此前mRNA 候选疫苗或已获批产品的数据将支持新的mRNA 候选疫苗。例如，某些情况下仅序列的变化，既不影响新mRNA 的大小或二级结构，也不改变其与LNPs的相互作用，新候选疫苗仍可视为是由平台技术生产的产品。但需要注意的是，对每种疫苗的质量控制、非临床和临床研究以及产品的所有特性均应分别考虑[2]。在此过程中，与监管当局的早期咨询是确保快速研发候选疫苗的关键。

4.3 对多价/联合疫苗的考虑

自新冠肺炎疫情暴发以来，先后有Alpha,Beta,Gamma,Delta 和Omicron 5种变异株在全球扩散，通常疫苗更新速度往往无法跟上病毒变异的节奏。为了更有效地保护病毒的感染以降低其传播，同时诱导更广谱、更强、持续时间更长的免疫应答，未来可能需要开发含有多个mRNA 编码不同变异株抗原的多价疫苗或联合疫苗。在多价疫苗设计中，应注意每种目的抗原中的mRNA 含量、表达效率和所产生的免疫应答与其他目的抗原的平衡，避免干扰对所有目的抗原的表达（进而影响免疫应答），并确保整个疫苗的必要菌毒株或抗原的特异性免疫应答。同时，为确保每个目的抗原适宜的mRNA 剂量，还应考虑开展适当的非临床毒性研究，评价mRNA 和LNPs 最高可耐受总剂量，如果适用，应结合过往临床经验进行论证。

5 结语

新冠病毒的流行对生物制品的发展产生了深远影响，mRNA 候选疫苗具有构建和生产速度快等特点，获得全球科研机构、监管机构和工业界的广泛关注。然而，mRNA 疫苗作为全新的技术路线，目前对其作用机制的了解尚不全面，且安全性尚需较长时间观察，特别是近期的两项研究分别发现mRNA 可能导致罕见自身免疫性肝炎的不良反应[40]以及存在整合到宿主基因组的遗传风险[41]，引发了人们对其安全性的忧虑。因此，未来随着更多科学和临床数据的出现，还需不断优化和改进疫苗的开发和设计方案。现有 WHO发布的《关于预防传染病mRNA 疫苗质量、安全性及有效性评估的法规考虑》是首个全球性的预防传染病mRNA 疫苗的指导性文件，对评价mRNA 疫苗质量、安全性及有效性具有重要意义。本文结合mRNA 技术特点、WHO 法规，梳理了现阶段评价mRNA 疫苗设计以及未来疫苗开发中需要关注的法规要点，以期为疫苗研发企业和监管机构评价提供参考。

致谢：感谢中国食品药品检定研究院的王军志院士、李玉华主任对本研究的贡献。

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