肺康颗粒对COPD大鼠miRNA-21、TGF-β/Wnt-5a信号通路的影响及机制*

张高, 黄楚栓, 褚庆民, 杨柳柳

广州中医药大学第一附属医院呼吸科(广东广州 510145)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一种可防治但发病率和病死率较高的呼吸系统疾病，以持续存在的呼吸道症状和气流受限为特征，有害颗粒或气体暴露可引起气道和肺泡异常[1]。慢性气道炎症是COPD的主要特点，气管和肺组织的炎症细胞浸润、募集和活化，会上调炎症通路蛋白的表达和抑制抗炎介质的表达。微小核糖核酸(miRNA,miR)-21的表达与转录生长因子-β(TGF-β)/无翅和整合位点生长因子5a(Wnt-5a)信号通路关系密切，在烟雾颗粒刺激COPD气道重塑中发挥重要作用。研究发现，TGF-β1可以增加肺成纤维细胞中miR-21的表达，miR-21水平升高可以增强肺成纤维细胞内的TGF-β1/Wnt-5a的促纤维化作用；反之，将miR-21进行基因沉默后就会削弱其促纤维化能力[2]。因此，研究miR-21调控TGF-β/Wnt-5a信号轴的作用机制对阐明COPD气道重塑的发病机制具有重要意义，miR-21有可能成为治疗COPD气道重塑的潜在靶标。源于中医理论“培土生金法”的肺康颗粒是广州中医药大学第一附属医院的院内制剂，具有益气补肺健脾、止咳化痰平喘之功效。在前期基础研究中，我们发现肺康颗粒可能减少大鼠炎症细胞浸润，降低肺组织炎症因子白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-17A(IL-17A)的分泌量，但实验方案不够完善，变量控制不够严谨。为进一步探索，2021年3月13日至7月31日，本研究利用现代分子生物学技术、生物信息学技术，探索miRNA-21调控COPD大鼠模型中TGF-β/Wnt-5a信号轴的分子机制，验证并阐明培土生金法发挥治疗COPD的作用机制，为探索miR-21成为COPD潜在的治疗靶点提供理论依据和实验基础。

1 材料与方法

1.1 动物 健康雄性SD大鼠90只，SPF级，4月龄，体重(200±20)g，由广东省实验动物中心提供，所有大鼠在同一动物房中饲养，温度(25±1)℃，湿度28%的环境中适应性饲养1周后进行实验。本研究免除相关伦理审查。

1.2 药物及试剂 肺康颗粒：由广州中医药大学第一附属医院院内制剂，由五指毛桃、太子参、茯苓、白术、苦杏仁、炒紫苏子等6味中药组成，每瓶250 g。大鼠TGF-β(泉州市睿信生物科技有限公司，批号：31073)、IL-8(泉州市睿信生物科技有限公司，批号：13147)、IL-17(泉州市睿信生物科技有限公司，批号：10315)、Wnt-5a(泉州市睿信生物科技有限公司，批号：12820)、miRNA-21(天根，批号cyt-716)。

1.3 分组、模型复制及给药 采用随机数字表法将90只SD大鼠分为6组，分别为：空白对照组、模型组及肺康颗粒低、中、高剂量组、地塞米松组，每组15只。

COPD大鼠造模方法：采用烟熏加气管内注入内毒素法，将空白对照组外其余各组大鼠放入自制有机玻璃熏箱(80 cm×70 cm×50 cm)内被动吸烟，熏烟1次/d，30 min/次，持续熏烟共20周；第1、14天麻醉大鼠，经气管插管注入内毒素脂多糖200 μg/200 μL(注内毒素日不熏烟)。

用蒸馏水将肺康颗粒溶解，制成低、中、高剂量肺康颗粒溶液(3.25、6.5、13 g/kg)灌胃使用。空白对照组大鼠，给予正常饲养，不加特殊干预；模型组大鼠，按照上述造模方法，连续熏烟20周；肺康颗粒低、中、高剂量组及地塞米松组大鼠，在连续熏烟4周验证造模成功后，第5周开始，每天熏烟前1 h予药物处理：肺康颗粒低、中、高剂量组大鼠分别按照等体积0.1、0.2、0.4 mL/10 g体重剂量给予灌胃肺康颗粒溶剂处理，一直持续给药16周；地塞米松组大鼠作为阳性对照组，在熏烟处理的第5周开始，每天在熏烟前30 min，按照10 μg/10 g体重的剂量腹腔注射地塞米松针剂，一直持续16周即实验结束。

1.4 取材 末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，20%乌来糖麻醉，麻醉后将大鼠仰卧固定在操作台上，打开腹腔，腹主动脉取血5 mL，入肝素抗凝管中800 r/min离心5 min，取上清，-20℃冰箱保存，用于酶联免疫吸附分析法(ELISA)测定血清相关指标。取血后纵行切开颈部皮肤，机械钝性分离皮下组织暴露气管，在环状软骨下切一个倒“T”型切口，进行气管插管。用细棉线在左肺门根部结扎左侧肺叶。摘取左肺，PBS反复清洗后共回收支气管肺泡灌洗液(BALF)共5 mL，800 r/min离心5 min后取上清液，剪切成两部分，一部分浸泡于RNA later保存液中，-80℃冰箱保存，用于qPCR检测；一部分置于1.5 mL EP管中，-80℃冰箱保存，用于ELISA检测。

1.5 检查指标 (1)呼吸功能相关参数测定：麻醉后将大鼠仰卧固定在操作台上，纵行切开颈部皮肤，机械钝性分离皮下组织暴露气管，在环状软骨下切一个倒“T”型切口，进行气管插管。上动物肺功能仪(Flex-ivent，加拿大)检测呼吸功能相关参数，包括：用力肺活量(FVC)、第0.3秒用力呼气容积(FEV0.3)、第0.3秒用力呼气容积与用力肺活量的比(FEV0.3/FVC)等。(2)气道炎症相关细胞因子的含量应用ELISA双抗体夹心法测定大鼠血清、BALF中TGF-β、IL-8、IL-17A的水平。(3)肺组织TGF-β/Wnt-5a mRNA和miR-21的表达水平：采用Real time PCR检测大鼠肺组织中Wnt-5a、TGF-β、miR-21的表达水平。提取大鼠肺组织RNA，紫外分光光度计测定OD260、OD280以检测RNA含量，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的完整性。逆转录合成cDNA。制备标准曲线样品，进行实时荧光定量PCR扩增，检测Ct值结果进行标准曲线分析。

2 结果

2.1 大鼠一般状况 空白对照组大鼠无死亡，皮毛呈正常光泽，体质量增加，呼吸平稳，无明显咳嗽、气促、纳差、便溏等症状。造模过程中，除空白对照组外，其余各组大鼠均有不同程度的毛色萎黄、逐渐出现呼吸系统症状(咳、喘、鼻中分泌物由稀薄变黏稠)、体重下降、活动度差。灌胃治疗后，肺康颗粒各剂量组、地塞米松组大鼠的毛色光泽度有所改善，咳、喘等呼吸系统症状均减轻。模型组死亡1只，肺康颗粒低剂量组死亡1只，地塞米松组死亡2只。

2.2 肺康颗粒对大鼠肺功能的影响 与空白对照组对比，模型组、肺康颗粒各剂量组、地塞米松组的FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC值均显著降低(P<0.01)；与模型组对比，肺康颗粒各剂量组、地塞米松组的FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC值均显著升高(P<0.01)，且肺康颗粒各剂量组、地塞米松组组间差异有统计学意义(P<0.05)，肺康颗粒各剂量组升高更加明显。改善作用与剂量呈现一定的依赖关系，低剂量肺康颗粒的改善作用较弱，中剂量肺康颗粒的作用次之，高剂量的肺康颗粒改善作用最强。见表1。

表1 各组大鼠肺功能对比

2.3 肺康颗粒对COPD 大鼠血浆及BALF 中TGF-β、IL-8和IL-17A 水平的影响 与空白对照组比较，模型组、肺康颗粒各剂量组、地塞米松组的血浆及BALF 中TGF-β、IL-8和IL-17A水平均显著升高(P<0.01)；与模型组对比，肺康颗粒各剂量组、地塞米松组的血浆及BALF中TGF-β、IL-8和IL-17A水平均显著降低(P<0.01)。相对于地塞米松组，肺康颗粒各剂量组炎症因子水平下降更加明显，差异有统计学意义(P<0.05)，且其调节作用呈一定程度的剂量依赖性。见表2～3。

表2 各组大鼠血浆TGF-β、IL-8和IL-17A水平对比

表3 各组大鼠BALF 中TGF-β、IL-8和IL-17A 水平对比

2.4 肺康颗粒对COPD 大鼠肺组织TGF-β/Wnt-5a mRNA和miRNA-21的表达水平的影响 与空白对照组比较，模型组肺组织中Wnt-5a mRNA、TGF-β、miRNA-21的表达量均明显升高(P<0.01)。与模型组比较，肺康颗粒各剂量组、地塞米松组肺组织中Wnt-5a mRNA、TGF-β、miR-21的表达量均明显下调(P<0.01)，且肺康颗粒各剂量组的下降更加明显(P<0.01)。见表4。

表4 各组大鼠肺组织中Wnt-5a mRNA、TGF-β、miRNA-21水平对比

3 讨论

COPD作为临床上常见的呼吸系统疾病，目前临床治疗大多以化痰解痉平喘类西药为主，可以有效缓解患者的症状，但效果相对局限，患者肺功能逐年的下降导致生活质量低下。中医学理论认为COPD稳定期本质是肺虚及脾、及肾，而肺脾受损最为多见，稳定期应积极治本为主，兼顾病理因素。故临床上采用培土生金治法多能切中病机，获得佳效[3-7]。本项目课题组前期临床研究发现肺康颗粒对COPD稳定期患者咳嗽、咯痰、喘息、气短症状有明显的改善作用，同时可使患者CAT评分、mMRC分级显著降低，并可明显减少急性加重发作次数[8]。动物实验方面，肺康颗粒可抑制COPD大鼠肺泡病理结构的破坏，并减少大鼠血清中炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6的含量，且肺组织中TNF-α、IL-6 mRNA的表达量均明显下调，而Toll样受体4(TLR4)、核因子-κB(NF-κB)的蛋白表达及胞核蛋白p65表达亦显著下调[9]。因此，肺康颗粒可能通过抑制TLR4/NF-κB信号通路进而抑制炎症反应，从而减轻COPD大鼠的病理结构改变。

Wnt-5a是一种分泌性糖蛋白，为Wnt家族中非经典通路的代表，通过活化非经典Wnt/Ca2+通路抑制经典Wnt/β-catenin通路[10]。Wnt-5a作为TGF-β的靶基因可刺激肺成纤维细胞诱导胶原和蛋白多糖的沉积、气道平滑肌增生，使成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型改变，这些COPD气道重塑过程中发挥重要作用[11-13]。近期一项研究指出，TGF-β/Wnt-5a非经典信号通路与COPD发病机制有关。香烟烟雾、TGF-β等刺激可使COPD患者肺成纤维细胞中Wnt分泌增加，通过非经典途径抑制肺泡上皮细胞中的Wnt/β-catenin经典通路传导，破坏肺泡上皮细胞修复，诱导成纤维细胞增殖，导致肺修复受损。肺中Wnt-5a过度表达可加剧弹性蛋白酶诱导的肺气肿扩大，抑制Wnt-5a信号传导能恢复肺泡功能减缓肺损伤，改善弹性回缩力、顺应性和肺功能，这可能是治疗COPD的一种新方法[14]。有研究显示，Wnt-5a能够促进炎症细胞因子分泌，抑制体内Wnt-5a的表达，下调TGF-β、TNF-α、IL-1β、IL-8等细胞因子的表达水平，可以阻断急剧的炎症反应[15-16]。以上研究表明，肺成纤维细胞中TGF-β/Wnt-5a分泌增加在COPD气道重塑中发挥关键作用，是阻断COPD气道重塑病理机制的潜在靶标。

miRNA是一类存在于多种生物体中调控基因表达的内源性非编码RNA，可与3′-UTR结合降解mRNA或抑制mRNA的翻译而抑制靶基因的表达，参与调节正常生理过程及病理过程，如器官的发育、创伤的愈合以及肿瘤的发生和转移等[17-19]。研究发现，miR-21是一种非常典型的基因编码区域内的miRNA，与COPD密切相关，在COPD气道重塑的调控中发挥重要作用[20]。研究发现miR-21在烟雾颗粒诱导的COPD小鼠组织中呈高表达，miR-21反义探针可以显著减轻COPD小鼠的肺组织病理改变，提示miR-21可能成为治疗COPD气道重塑的潜在靶点。

TGF-β/Wnt-5a信号通路与miR-21的表达互相影响，miR-21水平升高可以增加肺内TGF-β1/Wnt-5a的促纤维化作用，而TGF-β1也可以促进miR-21的表达[2]。本实验研究发现，COPD大鼠血浆及BALF中TGF-β、IL-8、IL-17A等炎症细胞因子的含量，肺组织中Wnt-5a mRNA、TGF-β、miRNA-21的表达量比正常组高，而经过肺康颗粒灌胃干预后，COPD大鼠的血浆及BALF炎症因子含量、肺组织Wnt-5a mRNA、TGF-β、miRNA-21的表达量均明显下降，表明肺康颗粒治疗COPD大鼠的机制可能与降低TGF-β、IL-8、IL-17A等炎症因子相关，可以下调肺脏组织TGF-β及Wnt-5a mRNA的表达，抑制miRNA-21的表达水平。

综上所述，本课题组经过多年临床观察认为COPD稳定期的基本病机是肺脾两虚，因此肺康颗粒以此为指导原则，以健脾益肺为治法，临床可以有效缓解患者呼吸道症状，延缓肺功能下降改善患者肺功能，调节炎症因子，改善膈肌疲劳等作用。本研究表明肺康颗粒可能通过TGF-β/Wnt-5a信号通路干预miR-21基因的表达，降低血清及肺泡灌洗液TGF-β、IL-8、IL-17A等炎症因子，改善大鼠FEV0.3、FVC、FEV0.3/FVC肺功能指标，进而减轻COPD大鼠气道慢性炎症反应，但其相关的生物学效应机制仍有待进一步的研究。

利益相关声明：论文内容不涉及相关利益冲突。

作者贡献说明：实验设计为张高和杨柳柳，实验实施为张高，黄楚栓、褚庆民进行实验评估，张高执笔，杨柳柳审校。