红鳍东方鲀IgM重组表达及多克隆抗体制备

王 森 黄宇希 彭 欢 苏 鹏 黎睿君 *

（1大连海洋大学辽宁省海洋动物免疫学与疫病防控重点实验室，辽宁大连116023；2大连市海珍品疾病防控重点实验室，辽宁大连116023；3大连海洋大学水产与生命学院，辽宁大连116023；4大连富谷食品有限公司，辽宁庄河116400）

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes），隶属于鲀形目（Tetraodontiformers）、鲀亚目（Tetraodontoidei）、鲀科（Tetraodontidae）、东方鲀属（Takifugu），俗称河鲀，主要分布于中国、日本、朝鲜及韩国等亚洲北部沿海地区[1]。红鳍东方鲀肉质鲜美、营养丰富，享有“鱼中之王”的美誉，因其具有较高的经济价值，在我国河北、山东、辽宁大连等地均广泛养殖[2]。近年来，红鳍东方鲀养殖规模逐渐扩大，已成为我国北方重要的海水经济养殖品种[3]。然而，随着养殖规模的扩大，病害问题也日趋严重，制约其养殖业发展。关于红鳍东方鲀免疫系统及免疫机制的研究受到了人们越来越多的关注，以期通过免疫手段对病害进行预防。

免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）是由 B淋巴细胞产生，在有颌脊椎动物的适应性免疫反应中起重要作用的一类免疫活性分子。一个典型的免疫球蛋白分子由2条重（H）链和2条轻（L）链组成，每条链包含1个可变（V）区和1个或多个（在H链中）恒定（C）区。抗原结合通过H和L链V区所进行[4]。根据CH区的化学结构差异可将Ig划为多种类型，目前在哺乳动物中已鉴定出IgM、IgD、IgG、IgE和IgA等5种亚型[5]，在硬骨鱼中已发现IgM、IgD、IgT和IgZ[6]等。其中，IgM作为系统及个体发育中最早出现的免疫球蛋白，是鱼类特异性体液免疫应答中的最主要介质[7]，在抵抗病原入侵方面发挥着重要作用[8]。

抗体具有特异性高、亲和力高、半衰期长以及毒性低等特点，是脊椎动物免疫学诊断及治疗的重要工具[9]。硬骨鱼类抗体的功能与哺乳动物相似，具有调理吞噬细胞、激活补体途径、中和细菌和病毒等作用。抗体也可用来检测与纯化抗原，免疫印迹、免疫沉淀、免疫组织化学和免疫亲和层析等试验均需要抗体参与[10]。本试验克隆并表达了红鳍东方鲀IgM的CH区片段，并利用重组表达的IgM蛋白制备鼠抗血清，以期为红鳍东方鲀免疫系统、免疫机制研究及相关免疫检测提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用红鳍东方鲀来自辽宁省大连市富谷红鳍东方鲀养殖场，体长约20 cm；BALB/c小鼠购自辽宁长生生物技术股份有限公司。RNAiso Plus、反转录试剂盒均购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司；克隆载体pMD19 simple、表达载体pET28a均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；弗式完全佐剂、弗式不完全佐剂均购自Sigma公司；Tris、Glycine、AP标记的兔抗鼠IgG均购自BBI公司。

1.2 总RNA提取与cDNA合成

取红鳍东方鲀成鱼脾脏，按照RNAiso Plus试剂盒操作说明提取红鳍东方鲀脾脏总RNA，按照Prime-ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser将提取的红鳍东方鲀脾脏总RNA反转录为cDNA第一链，于-20℃保存。

1.3 红鳍东方鲀IgM重链基因克隆

根据GenBank中收录的红鳍东方鲀IgM基因序列（登录号：AB125609.1），利用 Primer Premier 5.0 设计用于IgM CH区（CH1～CH4）基因扩增的特异性引物，上游引物TrIgM-F1带有Sac I酶切识别位点：5′-CGAGCTCGCAACACCCAAAGCCCCTTCTCTG-3′，下游引物TrIgM-R1带有Xho I酶切识别位点：5′-CC GCTCGAGCTTGGCCTTGCACTTGTCGGGGAT-3′，扩增目的片段长度为1 326 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。利用特异性引物TrIgMF1和TrIgM-R1扩增红鳍东方鲀IgM H链基因，将反应后的PCR产物用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化目的片段。回收后的片段与pMD19 simple载体连接，连接后的产物pMD19-IgM转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂布于LB平板（含氨苄西林），置于37℃恒温培养箱培养12 h，挑取单菌落培养后进行菌液PCR鉴定并送样检测。

1.4 红鳍东方鲀IgM原核表达体系的构建

将鉴定正确的阳性单菌落扩培后经质粒提取试剂盒抽提质粒，用Xho I和Sac I双酶切处理pMD19-IgM与质粒pET28a，双酶切产物切胶回收后使用T4连接酶16℃连接过夜。连接获得重组质粒pET28a-IgM转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于LB平板（含卡那霉素），置于37℃恒温培养箱培养12 h，挑取单菌落培养后进行菌液PCR鉴定并送样检测，检测正确的菌液扩培后提取质粒，将pET28a-IgM转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，涂布于LB平板（含卡那霉素），再于37℃恒温培养箱培养12 h，挑取单菌落培养后进行菌液PCR检测，检测正确菌液扩培后-80℃保存。

1.5 红鳍东方鲀IgM重组蛋白表达与制备

将BL21-pET28a-IgM菌株接种到LB液体培养中（含卡那霉素），于37℃条件下振荡培养至吸光度为0.4时加入0.1 mol/L IPTG诱导剂，在37℃条件下诱导1 h后，于4℃条件下以转速12 000 r/min离心20 min。尽量去除培养上清液，用适量无菌PBS缓冲液重悬沉淀。于4℃条件下以转速12 000 r/min离心20 min，洗涤1次后置于超声波破碎装置中，在冰浴条件下进行超声波破碎。以255 Hz超声波处理5 s，暂停5 s，溶液至澄清后停止破碎。然后，于4℃条件下以转速12 000r/min离心20 min。分别收集上清液与沉淀，沉淀用与上清液相同体积的无菌PBS重悬。采用12%SDS-PAGE电泳分析上清液、沉淀与菌体中重组蛋白的表达情况。

将收集的重组蛋白沉淀依次使用浓度为0、2、4、6 mol/L尿素溶液于4℃以转速12 000 r/min离心20 min洗涤，并用8 mol/L尿素溶液溶解过夜。于4℃以转速12 000 r/min离心20 min，取上清液进行透析复性。透析液中尿素浓度依次为 4.5、3.5、2.5、1.5、0.5、0 mol/L等8个梯度，每隔8 h更换1次透析液。复性后重组蛋白进行SDS-PAGE检测，于-80℃保存。

1.6 鼠抗红鳍东方鲀IgM多克隆抗体的制备

选6只6～8周龄雌性BALB/c小鼠，采用腹腔注射方式进行免疫。将红鳍东方鲀IgM重组蛋白在冰上解冻，与等体积的弗氏佐剂充分乳化，制成疫苗。首次免疫使用弗式完全佐剂，免疫计量100 μL/只。首免2周后进行第2次免疫，加强免疫使用弗式不完全佐剂，免疫计量为100 μL/只。取IgM重组蛋白50 μg与弗氏完全佐剂等量混合乳化，于小鼠腹腔进行注射。7 d后进行第3次免疫，第3次免疫7 d后采用心脏取血方法，分离纯化多抗血清。同时设立对照组，对照组不进行注射，与免疫组同时取血并分离纯化血清。

1.7 鼠抗红鳍东方鲀IgM多克隆抗体Western Blot分析

通过尾部取血方法收集红鳍东方鲀成鱼血清，将重组蛋白与天然红鳍东方鲀血清进行SDS-PAGE电泳与Western Blot分析。Western Blot同时设立试验组与对照组，待SDS-PAGE电泳结束后，用PVDF膜（需提前使用甲醇浸泡）小心覆盖住胶体并驱赶气泡，滤纸及夹板夹紧置于转膜仪中，恒流180 mA，转膜50 min。转膜结束后，小心取出PVDF膜，将膜浸入5%的脱脂奶粉溶液中，室温封闭2 h；弃去脱脂奶粉溶液，使用PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min；试验组加入PBS缓冲液按1∶1 000比例稀释的鼠抗红鳍东方鲀IgM多克隆抗体作为一抗，对照组使用按1∶1 000比例稀释的未注射组小鼠血清，于4℃孵育过夜；使用PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min；加入PBS缓冲液按1∶3 000比例稀释的AP标记兔抗鼠二抗，室温孵育1 h；使用PBST缓冲液洗涤3次，每次5 min；根据膜的大小加入适当体积的NBT/BCIP显色试剂，避光室温孵育至显色，将膜置于去离子水中，终止显色反应并观察试验结果。

2 结果与分析

2.1 红鳍东方鲀IgM重链基因克隆与原核表达体系的构建

根据红鳍东方鲀IgM CH区（CH1～CH4）基因设计特异性引物TrIgM-F1和TrIgM-R1，对提取的红鳍东方鲀cDNA进行PCR扩增并切胶回收，扩增条带大小为1 300 bp左右，与目的基因（1 326 bp）大小相符，见图1（a）。将回收后片段与pMD19 simple载体连接并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中培养。挑取阳性克隆进行PCR鉴定并送样检测，检测正确后提取质粒。使用Xho I和Sac I双酶切处理pMD19-IgM与质粒pET28a，将目的基因插入表达载体pET-28a，并转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中培养。挑取阳性克隆进行PCR鉴定并送样检测，检测正确后提取质粒。将pET28a-IgM转化至表达菌株BL21中，挑取阳性克隆进行PCR鉴定，扩增条带大小为1 300 bp左右，与目的基因大小相符，见图2（b）。这表明BL21-pET28a-IgM表达体系构建完成。

2.2 红鳍东方鲀IgM重组蛋白诱导表达与鉴定

选取加入0.1 mol/L IPTG诱导的目的蛋白表达菌体BL21-pET28a-IgM，利用超声波破碎后离心，将pET28a空载体菌与诱导后的BL21-pET28a-IgM表达菌进行SDS-PAGE电泳，见图2（a）。结果表明，诱导后的表达菌有目的蛋白表达，蛋白分子量为62 kDa左右，与预期相符合。取表达菌总蛋白、破碎后上清和无菌PBS重悬沉淀进行SDS-PAGE电泳，见图2（b），目的蛋白只存在于沉淀中，说明IgM以包涵体形式表达。

2.3 鼠抗红鳍东方鲀IgM多克隆抗体Western Blot分析

将复性后重组蛋白与天然红鳍东方鲀血清进行SDS-PAGE电泳和Western Blot分析。SDS-PAGE结果表明，天然红鳍东方鲀血清中76kDa处有明显蛋白条带，为红鳍东方鲀分泌型IgM（sIgM）蛋白（图3）。Western Blot结果显示，试验组鼠抗红鳍东方鲀IgM多克隆抗体可以特异性识别天然红鳍东方鲀血清76 kDa处蛋白，见图 4（a），同时可以特异性识别62 kDa处重组蛋白且显色过程迅速（1 min）；对照组血清未出现条带，见图4（b），表明鼠抗红鳍东方鲀IgM多克隆抗体不仅可以特异性识别IgM重组蛋白，而且可以特异性识别天然红鳍东方鲀血清中的IgM蛋白。以上结果与预期相符合，说明鼠抗红鳍东方鲀IgM多克隆抗体已成功制备。

3 结论与讨论

本研究根据NCBI红鳍东方鲀IgM H链序列，成功克隆红鳍东方鲀IgM的CH区（CH1～CH4）1 326 bp基因。红鳍东方鲀IgM H链全长约为3 500 bp，其中sIgM约为1 900 bp，包含一个VH区和CH1～CH4这4个恒定区。其中每个VH结构域可分为3个高度可变序列的互补决定区（CDR）和4个相对恒定序列的框架区（FR）。VH结构域的多样性主要由3个CDR区域决定，CDR区域序列具有高变性，有利于识别不同种抗原，刺激机体产生免疫反应，进而增强对环境的适应性。IG亚型则可以基于CH区的性质来定义[11]，与哺乳动物sIgM五聚体的结构不同，鱼类sIgM在CH4结构域下游缺少一个额外的结构域，是由2条L链和2条H链所组成的单体通过连接链“J”将4个单体连接而成，为四聚体结构[12]。

IgM作为硬骨鱼类体内含量最多的免疫球蛋白，目前研究认为其主要分布于鱼类的肾脏、胸腺及脾脏器官中，而随着鱼类个体的生长，胸腺逐渐退化，其在免疫中发挥的功能也逐渐减小[13]。Saha等[14]研究发现红鳍东方鲀中头肾、中肾与脾脏中IgM的表达量远高于其他组织，而胸腺中IgM的表达量与其他组织并无显著性差异，表明成年红鳍东方鲀的胸腺在机体免疫中的作用可能并不如脾脏与头肾重要。对草鱼[15]、金鱼[16]等鱼类的研究也证明鱼类的肾脏与脾脏在鱼类的免疫应答中发挥重要作用。对红鳍东方鲀早期发育时期的sIgM mRNA进行检测，发现其在孵化后1 d已经产生表达，表明红鳍东方鲀可能在早期就可以识别抗原并产生相关免疫应答[14]。当细菌、寄生或者病毒刺激鱼体时，研究鱼体内的IgM的变化规律有助于病害的防治工作。Tsutsui等[17]通过亲和层析法与离子交换层析法从天然红鳍东方鲀血清中分离得到IgM蛋白，发现其对海水鱼类常见的革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌以及大肠杆菌的生长都有显著的抑制作用，表明IgM分子在抵抗鱼类细菌性疾病中发挥重要作用；在抵抗寄生虫疾病方面，红鳍东方鲀皮肤和鳃的黏膜中分泌的IgM分子同样被证实可以与单殖吸虫的纤毛表皮细胞结合，进而识别并抵抗寄生虫寄生[18]。

为研究红鳍东方鲀患病前后IgM表达量的变化规律，本研究将合成的IgM基因片段克隆到pET28a载体上进行原核表达。结果表明，pET28a-IgM蛋白大部分以包涵体的形式存在，通过尿素使蛋白变性后透析复性得到可溶蛋白TrIgM。本研究以TrIgM蛋白作为抗原制备了鼠抗红鳍东方鲀IgM多克隆抗体，为了检测制备的抗血清的结合特异性，分别与TrIgM蛋白、天然红鳍东方鲀血清进行了Western Blot检测。有研究表明，红鳍东方鲀的IgM H链约为76 kDa[19]，与本试验中Western Blot检测的红鳍东方鲀IgM的大小相符，说明所制备的TrIgM鼠抗血清可以与天然红鳍东方鲀血清中的IgM特异性结合。因此，本试验中所制备的TrIgM鼠抗血清可以用于检测红鳍东方鲀IgM在不同条件下表达量。

综上所述，本研究成功合成了红鳍东方鲀IgM CH区基因片段，表达了TrIgM H链蛋白并成功制备了鼠抗红鳍东方鲀IgM多克隆抗体，为进一步研究红鳍东方鲀IgM在不同条件下的表达规律和免疫机制奠定了基础。