不同品种沙棘叶茶成分及活性比较

陈雪涛，蒋秀梅，赵三虎，曹叶霞，周妍英

（1.忻州师范学院化学系，沙棘工程技术研究中心，山西忻州 034000；2.忻州师范学院生物系，山西忻州 034000）

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）属胡颓子科、沙棘属落叶多刺乔木，广泛分布于亚洲和欧洲[1]，我国是其主要产区之一。沙棘营养丰富，浆果、种子、叶子、茎皮和根是生物活性物质的重要来源[2]。沙棘叶在中国藏族和蒙古族作为食品和草药的应用历史悠久。2013 年，中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会发布将沙棘叶作为普通食品管理[3]。Saggu 等[4]研究发现，即使在亚急性（30 d）最大有效剂量给药后，沙棘叶水提取物也没有毒性。沙棘叶中富含酚类[5-6]、类黄酮（儿茶素、芦丁、槲皮素、山奈酚、异鼠李素）、精油、类胡萝卜素、生育酚、糖、脂肪酸[7]和抗坏血酸[8]等。Masoodi 等[9]研究发现从沙棘叶中提取的末端水相混合物（SKICDDL-3）在体外可抑制前列腺癌细胞的增殖并降低前列腺特异性抗原的表达。许多研究表明沙棘叶提取物在体内外均具有抗氧化、细胞保护、抗菌[10]、抑制胶质瘤细胞生长[11]、抗病毒、抗炎、抗疲劳、抗内脏肥胖等功效[12]。因此，在一些国家，沙棘叶被用于制造提取物、茶叶、动物饲料、药品和化妆品[1,12]。因为沙棘叶安全、营养丰富且来源较广，近年来，人们对沙棘叶茶越发感兴趣，沙棘叶茶的生产及加工多是参照传统茶叶的工艺[13]，市面上售卖的沙棘叶绿茶和红茶较多，然而沙棘叶茶的加工和品质并无统一的标准，并且相关研究较少，导致市场上的沙棘叶茶品质参差不齐。

本研究通过比较不同产地沙棘叶茶中总多酚、总黄酮、异鼠李素等含量以及其抗氧化活性，体外抑制α-葡萄糖苷酶活性和体外抑制胰脂肪酶活性，从而为沙棘叶茶的加工提供数据基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

沙棘叶茶基本信息见表1。绿茶，均采摘6 月份的沙棘叶，经锅炒杀青、揉捻、干燥得到样品。红茶，均采摘6月份的沙棘叶，经萎凋、揉捻、发酵、干燥得到样品。

表1 沙棘叶茶基本信息Table 1 Information of sea buckthorn leaf tea

没食子酸标准品，CAS 149-91-7，色谱纯；芦丁标准品，CAS 153-18-4，色谱纯；异鼠李素标准品，CAS 480-19-3，色谱纯；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH），CAS 1898-66-4，分析纯；福林酚（2 mol/L），生物试剂，对硝基苯基-α-D-葡萄糖苷（PNPG），CAS 3767-28-0；生物试剂，α-葡萄糖苷酶，CAS 9001-42-7，70 U/mg；蒽酮，CAS 90-44-8，分析纯；猪胰脂肪酶，CAS 9001-62-1，3 万U/g，三羟基氨基甲烷（Tris），CAS 77-86-1，分析纯；以上试剂均购自上海源叶生物科技有限公司。对硝基苯基月桂酸酯（PNP），CAS 1956-11-2，色谱纯，Sigma；甲醇，67-56-1，色谱纯，天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

Agilent 1100 高效液相色谱仪，美国Agilent 公司；DNZ-9806 型酶标分析仪，北京普朗新技术有限公司；V-1200 型分光光度计，上海美浦达有限公司；TG-16 离心机，常州市万合仪器制造有限公司；旋转蒸发器RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂；DF-101S 集热式数显恒温磁力搅拌器，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司。

1.3 试验方法

将不同种类沙棘叶茶磨成粉末，过20 目筛，称取粉末3 g，用60%乙醇提取，料液比为1∶20（g∶mL），65 ℃、100 W 超声提取3 次，时间分别为60、30、30 min，提取液8 000 r/min 离心5 min，倒出上清液，合并3 次上清液，在旋转蒸发仪上60 ℃旋干，用60%乙醇定容至25 mL，每份提取3 个平行，提取液放在-4 ℃冰箱里保存备用。

1.4 沙棘叶茶的测定指标与方法

1.4.1 水分含量

根据《中国药典》2015 版[14]中水分测定法的第二法烘干法，测定沙棘叶茶中的水分含量。

1.4.2 总黄酮含量

沙棘叶茶总黄酮含量按照Chen 等[15]的方法稍作改动。将沙棘叶茶提取物0.2 mL 置于10 mL 试管中，加入4.8 mL 乙醇，向其中加入0.4 mL 5%亚硝酸钠溶液，静置6 min，再加入0.4 mL 5%的硝酸铝溶液，静置6 min。最后，加入4 mL 4%的氢氧化钠溶液。混匀后静置15 min，在510 nm 处测定吸光度。以芦丁为标准建立样品总黄酮含量的线性方程，总黄酮含量以mg 芦丁当量（RT）/g 干质量表示。

1.4.3 可溶性总多酚含量

沙棘叶茶可溶性总多酚含量测定方法在Chen 等[15]的基础上稍作改动。向45 μL 沙棘叶茶提取物中加入360 μL 乙醇和120 μL 福林酚试剂，混合均匀在室温下静置5 min，最后向混合物中添加120 μL 20%的碳酸钠终止反应，在680 nm 处测量吸光度。使用没食子酸作为标准品绘制校准曲线。可溶性总多酚含量以mg 没食子酸当量（GAE）/g 干质量表示。

1.4.4 水溶性碳水化合物含量

取沙棘叶茶醇提取物10 mL，挥去溶剂，用10 mL 水定容，采用硫酸-蒽酮法[15]。测定其中水溶性碳水化合物含量，向2 mL 沙棘叶提取物水复溶液中加入5 mL 含0.2%蒽酮的硫酸溶液，将其置于沸水浴中10 min 后，流水冷却，在620 nm 处测量其吸光度。定量基于葡萄糖的标准曲线。

1.4.5 异鼠李素含量

色谱条件：色谱柱为Kromasil 100-5-C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相为A 相甲醇和B 相0.4%磷酸溶液（58∶42）；检测波长为370 nm；流速为1 mL/min；柱温为25 ℃。

取沙棘叶茶提取液370 μL，加350 μL HCl，75 ℃水浴1 h，冷却至室温后加醇4.3 mL。吸取处理过的沙棘叶茶提取液10 μL，按上述色谱条件测定。其中标准曲线用不同浓度的异鼠李素测定。

1.4.6 抗氧化活性

（1）DPPH·清除能力

沙棘叶茶DPPH·清除能力测定方法是在Chen 等[15]的基础上稍作改动。将不同浓度沙棘叶茶提取物200 μL与100 μL DPPH 混合。混合均匀后，在室温下黑暗中静置20 min。测量反应溶液在517 nm 处的吸光度。以60%乙醇代替提取液为空白对照。自由基清除率计算公式见式（1）。

式中，A样品为样品的吸光度；A空白为空白的吸光度。

EC50值是清除50%DPPH 自由基的有效浓度，通过线性回归方程分析获得；下同。

（2）还原力

沙棘叶茶还原力测定是在Chen 等[15]的基础上稍作改动。向加有1mL 样品的具塞试管中加入2.5mL0.2mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和2.5 mL 1%铁氰化钾。在50 ℃下孵育20min 后，立即用冰水冷却，向混合物中添加0.5 mL 10%三氯乙酸，在3 000 r/min 离心10 min。将1 mL 上清液与1 mL 蒸馏水及0.2 mL 0.1%三氯化铁混合，10 min后，在700 nm 下测定溶液的吸光度。使用不同浓度的抗坏血酸（AC）制备标准曲线，还原力表示为μmol AC/g dw。

（3）OH·清除能力

沙棘叶茶OH·清除能力测定按照Chen 等[16]方法稍作修改。分别取2.2 mL 不同浓度的沙棘叶茶提取物按顺序与1.5 mL 0.2 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH 7.4）、0.2 mL 520 μg/mL 藏红花T 溶液、0.7 mL 2.0 mmol/L EDTANa2Fe（Ⅱ）、0.4 mL 过氧化氢（6%，V/V）混合，混合物在37 ℃下孵育30 min，520 nm 处测量吸光度。以60%乙醇代替提取液为空白对照。OH·清除率计算公式见式（2）。

式中，A样品为样品的吸光度；A空白为空白的吸光度。

（4）NO2·清除能力

沙棘叶茶NO2·清除能力测定在Lee 等[17]的基础上进行了改动。将90 μL 不同浓度的沙棘叶茶提取物按顺序与50 μL 50 mg/L 亚硝酸钠、250 μL 0.1 mol/L 柠檬酸盐缓冲液（pH=3.0）、110 μL 水混合，并在37 ℃下孵育30 min。冷却至室温后，向混合物中添加1 mL 0.4%对氨基苯磺酸，5 min 后，向混合物中添加500 μL 0.2%N-(1-萘基)乙二胺盐酸盐和3 mL 蒸馏水。混合后，将混合物置于室温下15 min，并在538 nm 处测量吸光度。以60%乙醇代替提取液为空白对照。NO2·清除率计算公式见式（3）。

式中，A样品为样品的吸光度；A空白为空白的吸光度。

（5）抗氧化活性（antioxidant potency composite，APC）综合指数的计算

沙棘叶茶综合抗氧化活性采用APC 综合指数法[18]进行比较，按照式（4）计算APC 综合指数。

1.4.7α-糖苷酶抑制活性

沙棘叶茶α-糖苷酶抑制活性测定在Miao 等[19]方法的基础上进行了微小的修改。将不同浓度（100 μL）的样品溶液与60 μLα-葡萄糖苷酶溶液（5 U/mL）混合于2 mL离心管中，加入350 μL 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=6.8）。在37 ℃下孵育10 min 后，加入10 μL 10 mmol/L 于溶解于0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=6.8）溶液的PNPG。混合物在37 ℃下孵育30 min 后加入500 μL 碳酸钠（0.5 mol/L）终止反应，在405 nm 下测定吸光度。以超纯水代替提取液为空白对照。α-葡萄糖苷酶抑制率（百分比）的计算公式见式（5）。

式中，A样品为样品吸光度；A空白为空白吸光度。

1.4.8 胰脂肪酶抑制活性

沙棘叶茶胰脂肪酶抑制活性测定在Mcdougall 等[20]方法的基础上进行了修改。将猪胰脂肪酶以5 mg/mL 溶解于超纯水中，以8 000 r/min 离心5 min 后取上清液，将PNP溶解于含1%曲拉通X-100 的5 mmoL/L 醋酸钠（pH 5.0）配成0.8 mg/mL 的底物。将0.1 moL/L（pH 8.2）的Tris 缓冲液400μL 和猪胰腺脂肪酶100μL 混合，加入100μL 含有相同量总多酚或总黄酮的样品和450 μL 底物，并在37 ℃下孵育60 min，在405 nm 处测量吸光度。以超纯水代替提取液为空白对照。胰脂肪酶抑制率计算公式见式（6）。

式中，A样品为样品的吸光度；A空白为空白的吸光度。

1.4.9 统计分析方法

所有测定重复3 次，数据以“平均值±标准差”的形式表示。使用IBM SPSS 20 统计软件对数据进行显著性分析和聚类分析。

2 结果与分析

2.1 沙棘叶茶活性物质的含量

沙棘叶茶水分、水溶性总多酚、总黄酮、异鼠李素和水溶性碳水化合物含量见表2（见上页）。由表可知，沙棘叶茶的含水率为4.43%～6.93%，符合国标中茶叶水分含量低于7%的要求[21-22]。

表2 沙棘叶茶中主要成分含量Table 2 Content of main components of seabuckthorn leaf tea

水溶性总多酚含量为40.55～106.57 mg GAE/g，其中红茶中水溶性总多酚含量为40.55～84.06 mg GAE/g，绿茶中水溶性总多酚含量为76.95～106.57 mg GAE/g。同一产地的绿茶和红茶相比，绿茶中水溶性总多酚含量高于红茶。这与吴清华等[23]报道的绿茶发酵后茶多酚总量总体上呈下降趋势一致。这是由于红茶在加工过程中受湿热条件和微生物的作用，茶多酚发生褐变，形成暗褐色的茶褐素和其他多酚类高聚物。XJ-G 中水溶性总多酚含量高于XJ-YG，而YA-SB 中的水溶性总多酚含量高于YA-AB，这个结果与陈海银[24]所报道的8 月份之前沙棘叶中多酚含量呈增高趋势一致。这可能是由于沙棘叶内多酚的积累主要与碳代谢相关，在夏季光合作用时间长从而使得次级代谢产物多酚含量较高[25]。

总黄酮含量为33.16～54.54 mg RT/g，其中红茶中黄酮含量为33.1～52.14 mg RT/g，绿茶中黄酮含量为43.74～54.54 mg RT/g。同一产地的绿茶和红茶相比，绿茶中黄酮含量高于红茶，这与王丽丽等[26]的测定结果一致，这可能是和发酵有关。XJ-G 中总黄酮含量高于XJ-YG，而YA-SB 中的总黄酮含量高于YA-AB，施荣富等[27]报道得出6 月采摘的沙棘叶中总黄酮含量最高，黄酮类化合物是植物酚类化合物中最大的一类[28]，与植物体内的次级代谢相关。

异鼠李素含量为0.65～2.02 mg/g，SY-B 中异鼠李素含量高于SY-G，在沙棘叶中异鼠李素主要是以苷元的形式和糖基结合的异鼠李素糖苷类化合物形式存在[29]，黄酮苷类在红茶发酵过程中分解为黄酮苷元和葡萄糖。YA-SB 中的异鼠李素含量高于YA-AB，XJ-G 中异鼠李素含量高于XJ-YG，这与总黄酮含量测定的结果一致，推测和植物体内的次级代谢相关。

水溶性碳水化合物在1.23%～4.54%，XZ-B 中水溶性碳水化合物含量高于XZ-G，在沙棘叶中黄酮醇苷是一类主要的活性成分，常见的糖残基是葡萄糖和半乳糖[30]，在红茶发酵过程中糖苷酶解释放出糖基[31]，导致红茶中水溶性碳水化合物含量较高。YA-AB 中的水溶性碳水化合物含量高于YA-SB，推测可能是由于在夏季植物的次级代谢较强，碳水化合物转化较多，到了秋季植物的次级代谢减弱，碳水化合物在植物内保留较多。

2.2 沙棘叶茶的抗氧化活性

沙棘叶茶的抗氧化能力通过DPPH·清除能力、OH·清除能力、NO2·清除能力和还原能力的测定进行评估，结果见表3。自由基清除能力实验中EC50值越低则该茶的清除自由基能力越强。DPPH·清除实验结果显示EC50值在0.075 4～0.315 3 mg/mL 之间，同一产地绿茶清除DPPH·的能力更强，XJ-G 清除DPPH·的能力强于XJ-YG，YA-SB 清除DPPH·的能力强于YA-AB。活性成分和抗氧化活性相关性分析结果见表5（见第32 页），由表可知，可溶性总多酚含量和总黄酮含量与DPPH·清除能力的EC50值呈显著负相关（r=-0.922，r=-0.883，P＜0.01）。

OH·清除实验结果显示EC50值在1.052 0～3.595 9 mg/mL 之间，同一产地红茶OH·清除能力强于绿茶，XJ-YG 清除OH·能力强于XJ-G，YA-SB 清除OH·的能力强于YA-AB。活性成分和抗氧化活性相关性分析结果（表5）显示，异鼠李素含量和水溶性碳水化合物含量与OH·清除能力的EC50值呈强的负相关（r=-0.815，r=-0.758，P＜0.05）。

NO2·清除实验结果显示EC50值在3.977～20.132 mg/mL 之间，同一产地绿茶清除NO2·的能力更强，XJ-G清除NO2·的能力强于XJ-YG，YA-SB 清除NO2·的能力强于YA-AB。活性成分和抗氧化活性相关性分析结果（表5）显示，可溶性总多酚含量与NO2·清除能力的EC50值呈显著负相关（r=-0.913，P＜0.01）。

还原力实验结果显示，沙棘叶茶还原力在52.46～165.04 μmol AC/g dw 之间，SY-G 还原力显著强于SY-B。XZ-B 和XZ-G 还原力较强，但是它们之间并无显著性差异，XJ-YG 还原力强于XJ-G，YA-SB 还原力强于YA-AB。活性成分和抗氧化活性相关性分析结果（表5）显示，还原力与可溶性总多酚含量呈显著正相关（r=0.896，P＜0.01），与总黄酮含量和水溶性碳水化合物含量呈强的正相关（r=0.807，r=0.754，P＜0.05）。

由上述结果可知，沙棘叶茶在4 种抗氧化方法中的测定结果并不一致，主要因为不同方法反应原理不同[18]，因此，为了全面评价沙棘叶茶的抗氧化活性，采用APC综合指数法对4 种方法测得结果进行综合评价，结果见表3。同一产地，绿茶的APC 综合指数大于红茶，这与周金伟等[32]对传统茶叶研究结果一致，主要由于发酵过程导致多酚类成分含量减少。YA-SB 的APC 综合指数大于YA-AB，这与陈海银[24]报道的6 月份沙棘叶总抗氧化性出现最高值，而6—8 月份沙棘叶处于成熟状态，理化指标处于稳定状态，导致总抗氧化性下降。XJ-G 的APC综合指数和XJ-YG 相差较小。

表3 沙棘叶茶抗氧化活性及抗氧化活性综合指数Table 3 Antioxidant capacity and antioxidant potency composite (APC) index of sea buckthorn leaf tea

2.3 不同沙棘叶茶的酶抑制活性

2.3.1 不同沙棘叶茶的α-葡萄糖苷酶抑制活性

沙棘叶茶的α-葡萄糖苷酶抑制活性测定结果见表4，α-葡萄糖苷酶抑制活性实验结果显示IC50值在1.086 0～3.859 9 mg/mL 之间，其中SY-G 对α-葡萄糖苷酶抑制活性显著强于SY-B，XZ-B 对α-葡萄糖苷酶抑制活性显著强于XZ-G，XJ-YG 对α-葡萄糖苷酶抑制活性显著强于XJ-G，YA-SB 和YA-AB 对α-葡萄糖苷酶抑制活性最差，且两者之间无显著性差异。活性成分和α-葡萄糖苷酶抑制活性相关性分析结果（表5）显示，α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值与水溶性碳水化合物含量呈显著负相关（r=-0.893，P＜0.01），与异鼠李素含量呈强的负相关（r=-0.731，P＜0.05）。α-葡萄糖苷酶抑制活性的IC50值与可溶性总多酚和总黄酮含量呈弱的负相关，此结果表明，可溶性总多酚和总黄酮对于α-葡萄糖苷酶抑制有一定的作用，柳梅等[33]研究发现沙棘叶多酚提取物对α-淀粉酶具有一定的抑制作用。

表4 沙棘叶茶α-葡萄糖苷酶抑制活性和胰脂肪酶抑制活性Table 4 α-glucosidase inhibitory activity,and pancreatic lipase inhibitory activity of sea buckthorn leaf tea

表5 沙棘叶茶中活性成分和活性的相关性分析Table 5 Correlation coefficients for the relationship of between active ingredient and activity of sea buckthorn leaf tea

2.3.2 不同沙棘叶茶的胰脂肪酶抑制活性

沙棘叶茶的胰脂肪酶抑制活性测定结果见表4，当样品中总黄酮含量相等时，胰脂肪酶抑制率在40.33%～64.40%之间，其中SY-G 对胰脂肪酶抑制活性显著强于SY-B，XZ-B 对胰脂肪酶抑制活性显著强于XZ-G，XJ-YG 对胰脂肪酶抑制活性显著强于XJ-G，YA-AB 对胰脂肪酶抑制活性强于YA-SB。当样品中可溶性总多酚含量相等时，胰脂肪酶抑制率在59.80%～96.92%之间，而整体趋势与样品中总黄酮含量相等时恰恰相反，这一结果可能是由于在这两种情况下样品中的活性成分含量存在差异所致。范金波等[34]研究发现沙棘叶黄酮提取物对胰脂肪酶活性有一定的抑制作用。

2.4 不同沙棘叶茶样品聚类分析

根据以上沙棘叶茶的活性成分含量及活性，利用SPSS 20 软件对8 种沙棘叶茶样品进行聚类分析，得到树形图见图1（见下页）。由图可知，忻州绿茶（XZ-G）、忻州红茶（XZ-B）、新疆沙棘嫩叶绿茶（XJ-YG）、新疆沙棘叶绿茶（XJ-G）和沈阳绿茶（SY-G）可以聚为一类，延安沙棘叶红茶（秋）（YA-AB）、延安沙棘叶红茶（夏）（YA-SB）和沈阳红茶（SY-B）可以聚为一类。从聚类分析结果来看，绿茶和红茶之间存在显著性差异，而同一种茶的特性较相似。

图1 沙棘叶茶聚类分析结果Fig.1 Cluster analysis of sea buckthorn leaf tea

3 结论

通过对8 种沙棘叶茶中主要成分的分析，发现在同一产地绿茶中可溶性总多酚和总黄酮含量高于红茶；而异鼠李素含量和水溶性碳水化合物含量在红茶中较高。YA-SB 中可溶性总多酚、总黄酮和异鼠李素含量高于YA-AB。XJ-G 中可溶性总多酚、总黄酮和异鼠李素含量高于XJ-YG。采用APC 指数法对8 种沙棘叶茶的抗氧化活性进行评价，发现同一产地绿茶的抗氧化活性强于红茶；YA-SB 的抗氧化活性强于YA-AB。α-葡萄糖苷酶抑制活性和黄酮含量相等时的胰脂肪酶抑制活性实验结果显示SY-G 强于SY-B，XZ-B 强于XZ-G，XJ-YG 强于XJ-G；而多酚含量相等时的胰脂肪酶抑制活性实验结果与此趋势相反。通过聚类分析，可以把8 种沙棘叶茶分为两大类：一类包括XZ-G、XZ-B、XJ-YG、XJ-G 和SY-G；另一类包括YA-AB、YA-SB 和SY-B。结果表明，第一类沙棘叶茶的总多酚含量（76.95～106.57mgGAE/g），总黄酮含量（43.7～54.54 mg RT/g），异鼠李素含量（1.25～1.86 mg/g）较高，抗氧化活性APC 综合指数（71.80%～88.65%）较高；α-葡萄糖苷酶的IC50值（1.086 0～2.233 0 mg/mL）较低；黄酮含量相等时的胰脂肪酶抑制率较高；而第二类均为红茶，相对第一类来说其活性成分含量较低，活性较差。本研究结果为沙棘叶茶加工方式的选择及采摘时间提供了数据基础。