周志明,吕 彪,4,闫 芳,张春云,王海平,王勤礼,王建东,徐 涛,张春梅,,陈 叶
(1甘肃农业大学资源与环境学院,兰州 730000;2河西学院祖师麻原植物应用技术研究所,甘肃张掖 734000;3甘肃泰康制药有限责任公司,甘肃武威 733000;4河西学院乡村振兴研究院,甘肃张掖 734000)
唐古特瑞香(Daphne tangutica Maxim)为瑞香科瑞香属(Daphne linn)多年生小灌木,分布于甘肃、青海、四川、云南等海拔3000 m左右的山坡灌丛、林缘、沟谷地带[1]。唐古特瑞香的根皮和茎皮为中国传统中药材‘祖师麻’,其果、叶可治鼻炎及下疳,花可治肺脓肿,根皮茎皮则具有祛风除湿,止痛散瘀等功效[2],临床应用非常广泛。现代研究揭示唐古特瑞香含有香豆素类、木脂素类、黄酮及二萜三萜原酸酯类等多种化学成分[3-4],有抗炎、抑菌、抗疟、降压、镇静、催眠等药理作用[5]。
唐古特瑞香耐寒、喜冷凉气候,适生地域环境特殊,在干燥寒冷、植被单一的西北地区是难得的常绿灌木,亦为此地区水土保持和水源涵养的优良生态树种[6],目前,中国的祖师麻药材多以采挖野生唐古特瑞香为主,连根掘起的采药方式已致使其野生植物资源日渐匮乏,加之唐古特瑞香种子量小,且不易发芽,天然更新能力弱,野生资源正面临着前所未有的破坏,蕴藏量急剧下降,不少地区已经濒于灭绝[7]。因此,唐古特瑞香人工种植工作势在必行,实现祖师麻药材的可持续利用已成为当下亟需解决的问题。近年来,国内外学者对唐古特瑞香的研究主要集中在化学成分测定、药理作用等方面[8-13],对不同产地、不同年限唐古特瑞香不同部位有效成分含量测定鲜有研究。基于此,本研究利用HPLC方法,测定不同地区(互助、哈溪)、不同年限(3、5和8年)及不同部位(根皮和茎皮)的唐古特瑞香中祖师麻甲素、7-羟基香豆素和紫丁香苷含量动态变化规律,为下一步祖师麻人工高效种植、合理和可控地使用该类药材提供科学依据。本实验在甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室与河西学院医学院完成,于2020年11月—2021年5月进行。
岛津20A-T液相色谱仪、万分之一电子天平(FA2004上海舜宇恒平科学仪器有限公司)、ZORBAX SB-C18(4.6 mm ×150 mm)、十万分之一电子天平(PT-124/85S福州华志科学仪器有限公司)、数控超声波清洗器(KQ3200DE昆山市超声仪器有限公司)、KQ-500E型超声波清洗器、DFT-50手提式中药粉碎机(世诺)。
祖师麻甲素(批号:B21084 HPLC≥98%上海源叶生物科技有限公司)、7-羟基香豆素(批号:B21854 HPLC≥98%上海源叶生物科技有限公司)、紫丁香苷(批号:Cas:118-34 HPLC≥99.90%成都麦德生科技有限公司)。流动相A:甲醇(批号:20170920256,色谱纯);流动相B:乙腈(色谱纯,天津市科密欧化学试剂有限公司);流动相C:娃哈哈水;流动相D:磷酸(优级纯)。
不同年份和产地唐古特瑞香不同药用部位药材12批次,见表1。
表1 不同年份的样品来源
本试验以武威天祝藏族自治县哈溪镇和青海省互助土族自治县的唐古特瑞香为研究对象,选取3年生、5年生和8年生唐古特瑞香植株,剥取根皮和茎皮,分别剪碎置于室内晾干,将材料粉碎装入样品袋,以待备用。
2.1.1 祖师麻甲素和7-羟基香豆素含量的测定 对照品溶液的制备:精密称取祖师麻甲素和7-羟基香豆素标准品各10 mg,于50 mL容量瓶中,加85%甲醇至容量瓶的2/3,超声5 min,在用85%甲醇定容至刻度线,摇匀,即得到祖师麻甲素和7-羟基香豆素含量分别为0.2076 mg/mL和0.1956 mg/mL的标准品溶液单品。抽取溶液冲洗针管1~2次,再取溶液,换下针头,安装针头过滤器(有机膜),将针管中溶液打出一半倒入废瓶,剩余一般装入样品瓶2/3。
供试品溶液的制备:精密称取唐古特瑞香样品粉末约1 g,置于具塞锥形瓶中,精密加水80 mL,密塞,称定重量,超声提取45 min(功率25 w,频率25 khz),放冷,再称定重量,用水补足减失的重量,摇匀,过滤到锥形瓶(将初滤液倒入废瓶),再取过滤液冲洗针管1~2次,换下针头,安装针头过滤器(有机膜),将针管中溶液打出一半倒入废瓶,剩余一半装入样品瓶2/3。
色谱条件:色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm);对祖师麻甲素和7-羟基香豆素的测定,流动相使用乙腈∶0.05%磷酸(10∶90),流速为0.9 mL/min,检测波长是327 nm,柱温为40℃,进样量为20 μL。在此条件下对照品(图1、2)和供试品(图3)色谱在26 min和46 min有色谱峰。
图1 祖师麻甲素对照品色谱图(左)
图2 7-羟基香豆素对照品色谱图(右)
图3 祖师麻甲素和7-羟基香豆素供试品HPLC色谱图
2.1.2 紫丁香苷含量的测定 对照品溶液的制备:精密称取紫丁香苷对照品10 mg,于50 mL容量瓶中,加85%甲醇至容量瓶的2/3,超声5 min,在用85%甲醇定容至刻度线,摇匀,即得到紫丁香苷含量为0.2064 mg/mL的对照品溶液单品。抽取溶液冲洗针管1~2次,再取溶液,换下针头,安装针头过滤器(有机膜),将针管中溶液打出一半倒入废瓶,剩余一般装入样品瓶2/3。
供试品溶液的制备:同2.1.1中供试品溶液制备一样。
色谱条件:色谱柱:ZORBAX SB-C18(4.6 mm×150 mm);对紫丁香苷的测定,流动相使用流动相使用甲醇∶水(20∶80),流速为 0.9 mL/min,检测波长是265 nm,柱温为40℃,进样量为20 μL。在此条件下对照品(图4)和供试品(图5)色谱在17 min有色谱峰。
图4 紫丁香苷对照品色谱图
图5 紫丁香苷供试品HPLC色谱图
2.2.1 线性关系考察 精密吸取祖师麻甲素对照品溶液(0.4152 mg/mL)4、8、12、16、20 μL,精密吸取7-羟基香豆素(0.3912 mg/mL)4、8、12、16、20 μL,精密吸取紫丁香苷(0.4128 mg/mL)4、8、12、16、20 μL,按照上述条件分别注入色谱仪测定(分别以待测成分质量浓度(x,μg/mL)为横坐标,峰面积(y)为纵坐标,进行线性回归,绘制标准曲线,结果表明线性关系良好。线性回归方程、线性范围和相关系数(r2)见表2。
表2 3种成分的标准曲线和线性范围
2.2.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液(含祖师麻甲素0.2076 mg/mL,7-羟基香豆素0.1956 mg/mL,紫丁香苷0.2064 mg/mL)20 μL,连续进样6次,记录峰面积,结果祖师麻甲素峰面积RSD为0.90%,7-羟基香豆素峰面积RSD为0.20%,紫丁香苷峰面积RSD为0.30%。表明仪器精密度良好。
2.2.3 稳定性试验 精密称取同一批供试品(S4号样品)6份,室温放置,分别于0,2,4,6,8,10,12 h按照2.1.1项色谱条件下进样20 μL。结果祖师麻甲素峰面积RSD=0.27%,7-羟基香豆素峰面积RSD为0.13%,紫丁香苷峰面积RSD为0.18%(n=6),表明供试品溶液在12 h内稳定。
2.2.4 重复性试验 精密称取同一批次供试品(S7号样品)6份,分别按照2.2项下方法制备供试品溶液,按照2.1.1项下色谱条件实验,记录峰面积并计算各待测组分含量。结果,祖师麻甲素平均含量为5.597 mg/g,RSD=0.50%(n=6),7-羟基香豆素平均含量为0.899 mg/g,RSD=0.40%(n=6),紫丁香苷平均含量为5.098 mg/g,RSD=0.40%(n=6)。结果表明,本方法重复性较好。
2.2.5 加样回收试验 取已知含量得唐古特瑞香供试品(S7号样)9份,每份取0.1 g,精密称定,分别精密加入唐古特瑞香对照样品(祖师麻甲素0.2076 mg/mL,7-羟基香豆素0.1956 mg/mL、紫丁香苷0.2064 mg/mL)储备液1.5、1、0.5 mL,按照2.2.1项下方法制得供试品溶液,以上色谱条件测定:祖师麻甲素平均回收率为95.78%,RSD为1.8%;7-羟基香豆素平均回收率为95.84%,RSD为1,4%;紫丁香苷平均回收率为95.10%,RSD为1.4%。
含量测定结果表明,唐古特瑞香香豆素主要3种活性成分在所有待测样品中均能检测出,每一样类型中各成分含量变化不大,同一部位不同年限或同一年限不同部位的唐古特瑞香中各成分含量存在差异。利用SPSS 26对不同年限和不同部位的唐古特瑞香各成分含量进行单因素方差分析,结果见表3、4。
表3 同一部位不同年限唐古特瑞香样品中3种成分含量的比较(x±s,n=3)
同一部位的样品在不同年限各成分含量呈现动态积累见表3,除哈溪地区茎皮中紫丁香苷含量随年限增长而增加外,其余不同地区、不同部位紫丁香苷的含量在第5年显著增加(P<0.05);互助地区根皮和哈溪地区茎皮中祖师麻甲素、7-羟基香豆素,在第5年含量显著减少(P<0.05);互助地区茎皮和哈溪地区根皮中祖师麻甲素含量次序分别为,3年生>8年生>5年生,5年生>8年生>3年生(P<0.05);互助地区茎皮与哈溪地区根皮中7-羟基香豆素含量次序分别为,5年生>3年生>8年生,3年生>5年生>8年生(P<0.05)。
同一年限不同部位样品各成分含量比较见表4,茎皮中祖师麻甲素、7-羟基香豆素和紫丁香苷含量显著高于根皮中(P<0.05);哈溪地区茎皮祖师麻甲素含量显著高于互助地区根皮和茎皮含量(P<0.05);5年生和8年生祖师麻甲素与3年生7-羟基香豆素和紫丁香苷的含量依次为互助茎皮>哈溪茎皮>互助根皮>哈溪根皮(P<0.05);5年生和8年生紫丁香苷的含量依次为互助茎皮>互助根皮>哈溪茎皮>哈溪根皮(P<0.05)。
表4 同一年限不同部位唐古特瑞香样品中3种成分含量的比较(x±s,n=3)
基于HPLC分析的中药质量控制与评价研究主要依靠指标性有效成分的定量或定性分析策略。因此,合理选取指标性成分进行含量测定分析是中药质量评价的重要前提。HPLC已在唐古特瑞香成分含量测定、指纹图谱研究以及资源化学开发方面应用广泛。本研究以《中国药典》2020年版规定的香豆素为基础,结合文献报道常用于唐古特瑞香质量评价的祖师麻甲素,7-羟基香豆素和紫丁香苷3种化合物作为HPLC指标成分,建立同时测定祖师麻甲素和7-羟基香豆素2种成分和单独测定紫丁香苷1种成分的HPLC体系。祖师麻甲素,7-羟基香豆素和紫丁香苷稳定性差,对光、热敏感,在供试品溶液制备时比较了甲醇超声和甲醇回流的提取结果,并且发现长生45 min对3种成分的提取效果好,故采用简便的超声提取法,时间为45 min。同时采用紫外检测器在200~400 nm波长范围内对唐古特瑞香3种指标性成分进行扫描,结果祖师麻甲素在327 nm处波长有最大吸收,紫丁香苷在265 nm处波长有最大吸收,7-羟基香豆素在327 nm处波长有最大吸收。尝试在327 nm波长处检测,祖师麻甲素、7-羟基香豆素均具有较强响应,但紫丁香苷峰几乎不可见,故选择327 nm为祖师麻甲素、7-羟基香豆素测定波长;尝试在265 nm波长处检测,祖师麻甲素与7-羟基香豆素响应值虽有降低,但紫丁香苷响应值明显提高,且与相邻杂质峰分离良好,能够达到检测要求,故选择265 nm为紫丁香苷测定波长。
中药材的质量形成过程与物种的生态环境关系极为密切,前期产地样品采收、加工技术、后期运输及储藏等对药效都会产生中药的影响[14]。从中药的生产地来看,药用植物生理代谢与环境因素的交互导致植物体内次生长代谢物质积累量不一致,这是道地药材的核心问题[15]。多数文献报道唐古特瑞香资源分布状况[7]以及有效成分的提取和测定方法[8-10]。王明时等[16]在唐古特瑞香中首次提取出了祖师麻甲素、7-羟基香豆素和紫丁香苷等多个成分。张超等[17]在研究中表示香豆素主要分布于祖师麻基原植物黄瑞香的根皮和茎皮;张金等[18]在测定祖师麻基原植物黄瑞香不同部位紫丁香苷含量的研究中表示,紫丁香苷在叶部含量较低,可以从根芯或茎芯中分离制备紫丁香苷。为了深入探究唐古特瑞香不同地区、不同年限及不同部位质量形成的化学本质,本研究进行了3、5和8年生唐古特瑞香根皮和茎皮主要成分含量的动态分析。结果发现,3种成分在不同年限或不同部位的唐古特瑞香样品中含量积累并不一致。同一部位样品,除哈溪地区根皮祖师麻甲素和互助地区茎皮7-羟基香豆素含量呈现先增加后减小的趋势外,其余地区的这2种成分均表现为先增加后减小,且3年生唐古特瑞香茎皮中含量最高;除哈溪地区茎皮紫丁香苷含量一直增加外,其余地区部位的含量均呈现先增加后减小的趋势,且5年生唐古特瑞香含量最高。同一年限内,3年生和5年生唐古特瑞香根皮中3种成分含量大于8年生,但8年生茎皮中3种成分含量均高于根皮,说明唐古特瑞香的根皮和茎皮都是香豆素类化合物储藏的主要器官,这些与黄瑞香的研究结果相似。5年生唐古特瑞根皮与茎皮总香豆素含量高达0.17%,说明互助地区各种环境生态因子适合唐古特瑞香香豆素的积累。
中药发挥功效的物质基础为主要有效成分,然而药用部位有效成分积累的生物学本质目前了解甚少。本研究揭示药用唐古特瑞香主要有效成分在不同年限不同部位的差异积累,根皮与茎皮中的含量都很高,茎皮中含量稍高于根皮,佐证了唐古特瑞香根皮及茎皮入药的认识。唐古特瑞香如何通过生理代谢合成并转运有效成分至药用部位贮藏,将是亟待解决的问题。现如今祖师麻基原植物唐古特瑞香极度紧缺,因此,研究和推广野生唐古特瑞香人工种植,模拟天然野生环境,采用温室大棚种植或者组织培养技术,研究快速繁殖的方法,才能从根本上缓解祖师麻药材的资源紧缺问题。