广东省猪十二指肠贾第虫感染现状和分子特征分析

钟梦龙，张浩吉，陈祥杰，李复坤，邱茜茜，李 易，黄福强，王妮娜，余新刚

（佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山 528231）

十二指肠贾第虫（Giardiadoudenalis，G.doudenalis），简称贾第虫，又称蓝氏贾第鞭毛虫（Giardialamblia），是一种寄生于宿主十二指肠的寄生性原虫，可感染人类、野生动物、家畜和犬猫等，常引起消化不良、腹痛和腹泻等症状[1-2]，而且贾第虫病对儿童的生长发育和认知能力有重要影响，被世界卫生组织列为危害人类健康的10种主要寄生虫病之一[3]。

按照基因型的不同，贾第虫可分为8个集聚体（A～H），集聚体A和B可感染人类和多种哺乳动物，引起人兽共患病，集聚体C～H表现出一定的宿主特异性，集聚体C和D多感染犬，集聚体E多感染猪和反刍动物，集聚体F多感染猫，集聚体G和H分别感染啮齿类动物和海豹[4]。但是近年来也发现了不同集聚体跨宿主传播的事例，如在贾第虫患者人群中发现了集聚体C、E和F的感染[5-7]。更有报道显示，在人类与动物密切接触的地区，已发现贾第虫在人与动物之间相互传播[8-9]。

目前中国对贾第虫的研究主要集中在人、牛、羊和伴侣动物等[10-12]，对猪贾第虫的研究资料较少。感染贾第虫的猪粪便中常含有大量的感染性包囊，这些感染性包囊能通过水源或其他途径造成环境污染，进而可引起人类或其他动物感染。广东省是中国养猪大省，掌握广东省各地区猪群中贾第虫的感染现状，并进一步研究其基因型的分布特征，不仅能为贾第虫病的防控提供基础资料，而且具有一定公共卫生意义。本试验通过巢式PCR（nested-PCR）扩增谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，gdh）基因，并进行序列分析，对广东不同地区猪源贾第虫的基因型进行鉴定，以期为猪群贾第虫病防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器

PremixTaqTMVersion 2.0 plus dye、DL2000 DNA Marker均购自宝日医生物技术（北京）有限公司；E.Z.N.A. Stool DNA Kit（D4015-02） 购自OMEGA Bio-Tek公司。

梯度基因扩增仪购自Biometra 公司；电泳仪、水平电泳槽购自Bio-Rad公司；江南光学显微镜（NLCD500）购自江南光电股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 2019年12月-2021年6月，分别从广东省清远、佛山、茂名、江门、肇庆、阳江、河源、韶关、广州和惠州部分猪场共采集521份新鲜猪粪样品，其中断奶仔猪（21～60 d）粪便样品203份，育肥猪（61～180 d）208份，母猪（>180 d）110份，每份样品约30 g，单独装入洁净密封袋，标明采集地、性别、年龄和编号，样品低温保存于泡沫箱并当天运送至实验室，4 ℃保存待检。

1.2.2 显微镜检测 取6 g新鲜粪便样品，加入2倍体积的双蒸水混匀后经200目网筛过滤，滤液3 000 r/min离心5 min后弃上清，沉淀加入4倍体积的33%硫酸锌溶液重悬，1 500 r/min离心5 min，上清液转至另一个离心管，加入4倍体积ddH2O稀释，混匀后3 000 r/min离心5 min，弃上清，剩余1 mL上清重悬沉淀，取适量悬液滴加在载玻片中，加入适量卢戈氏碘液染色，于显微镜下镜检。

1.2.3 样品DNA提取 取粪便样品200 mg置于2 mL离心管中，按照粪便DNA提取试剂盒说明书进行DNA提取，置于-20 ℃保存备用。

1.2.4 贾第虫gdh基因巢式PCR扩增 参照文献报道[13]的方法设计gdh基因巢式PCR引物，第一轮PCR上游引物Ghd1：5′-TTCCGTRTYCA-GTACAACTC-3′，下游引物Gdh2：5′-ACCTCG-TTCTGRGTGGCGCA-3′；第二轮PCR上游引物Gdh3：5′-ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT-3′，下游引物Gdh4：5′-GTGGCGCARGGCATGAT-GCA-3′。引物均由生工生物工程（上海）有限公司合成。PCR反应体系均为25 μL：2× rTaqMix 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反应程序均为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min。将PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳分析，并拍照记录。所有阳性样品均进行2次巢式PCR检测。

1.2.5 测序及遗传特性分析 将所有gdh基因阳性的PCR产物送生工生物工程（上海）有限公司测序。所获序列进行BLAST比对，并应用MegAlign程序与NCBI获得的参考序列进行比对，确定贾第虫的基因型；运用Mega 7.0软件的最大似然法构建进化树。

1.2.6 统计分析 采用SPSS 17.0中的χ2检验的方法分析不同年龄段猪贾第虫感染率的差异性，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 显微镜观察结果

经显微镜镜检，可见贾第虫包囊呈椭圆形，囊壁较厚，大小为（10～14）μm ×（7～10）μm，具有明显纵向轴柱，细胞核分布于轴柱两侧（图1）。

图1 显微镜观察结果（400×）Fig.1 The results of microscopic observation （400×）

2.2 猪贾第虫阳性率调查结果

基于gdh基因的巢式PCR扩增结果发现，在521份猪粪样品中，有94份样品于530 bp处有清晰可见的目的条带（图2），贾第虫阳性率为18.04%。不同地区猪群贾第虫的阳性率明显不同（表1），阳性率在3.90%～40.00%之间，其中茂名猪贾第虫阳性率最高，达40.00%；肇庆样品猪贾第虫阳性率最低，为3.90%。

M,DL2000 DNA Marker;1～27,样品；N，阴性对照；P，阳性对照M,DL2000 DNA Marker;1-27,Samples;N,Negative control;P,Positive control图2 部分样品贾第虫gdh基因PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of gdh gene of Giardia duodenalis in partial sample

表1 广东省不同地区猪贾第虫阳性率Table 1 Positive rates of Giardia duodenalis in pigs in different areas in Guangdong province

2.3 不同饲养阶段猪贾第虫阳性率调查结果

不同饲养阶段猪贾第虫阳性率统计结果见表2，母猪的贾第虫阳性率显著高于断奶仔猪（P<0.05），与育肥猪的贾第虫阳性率差异不显著（P>0.05）。

表2 广东省不同饲养阶段猪贾第虫阳性率Table 2 Positive rates of Giardia duodenalis in pigs in different feeding stages in Guangdong province

2.4 猪贾第虫基因分型结果

将gdh基因的PCR阳性样品进行测序，共获得94条贾第虫gdh序列，经BLAST比对，结果形成5个不同基因亚型（表3）。以贾第虫分离株TX443gdh基因（登录号：MK645799）为参考序列，有58份样品相似性为95%～100%，为集聚体AⅠ亚型。以贾第虫分离株HY32和ECUST20410gdh基因（登录号：MK645797、KY633476）为参考序列，有30份样品的相似性在95%～100%之间，为集聚体E1亚型。以贾第虫分离株QQ1gdh基因（登录号：KT698971）为参考序列，有3份样品的相似性均为99%以上，为集聚体E10亚型。以贾第虫gdh基因（登录号：MK881605）为参考序列，有2份样品的相似性为99%和100%，为集聚体E2亚型；以贾第虫分离株MSZ-96gdh基因（登录号：MH621339）为参考序列，有1份样品相似性为97%，为集聚体E13亚型。

表3 广东省不同地区猪贾第虫基因分型结果Table 3 Genotyping results of Giardia duodenalis in pigs in different areas of Guangdong province

惠州以集聚体E1为优势亚集聚体，广州、佛山等其他地区均以AⅠ为优势亚集聚体。在不同饲养阶段的猪群中，断奶仔猪和育肥猪以AⅠ为优势亚集聚体，而母猪则以E1为优势亚集聚体。

2.5 系统进化分析

选择上述gdh基因测序5个亚型的代表性序列，其中每个亚型各1条序列，以苍鹭贾第虫（Giardiaardeae）gdh基因序列（登录号：AF069060）为外群，构建遗传进化树（图3）。58个样品的代表序列AⅠ与集聚体A为一群，其他36个样品的4条代表序列与集聚体E为一群。

图3 猪贾第虫gdh基因序列遗传进化树Fig.3 Genetic evolution tree of gdh gene sequence of Giardia duodenalis in pig

3 讨 论

十二指肠贾第虫是近些年来国内外学者非常关注的肠道寄生性原虫。越来越多的报道显示，贾第虫是猪常见的肠道寄生性原虫，但不同国家和地区的贾第虫的阳性率具有一定的差异，如韩国猪贾第虫的阳性率为14.8%[14]、加拿大为66.4%[15]、英国为57.1%[16]、美国为7.4%[17]；国内猪贾第虫的阳性率最低为1.6%[18]，最高为26.9%[19]。本次对广东省10个地区的调查显示，在受检的521份样品中，贾第虫的阳性率达18.04%，其中不同地区和不同饲养阶段猪群的阳性率皆存在差异，如茂名猪贾第虫阳性率高达40.00%，肇庆的阳性率仅为3.90%；而且育肥猪（19.23%）和母猪（24.55%）的贾第虫阳性率均高于仔猪（13.30%）。这些结果说明广东省猪群贾第虫的感染比较普遍，而且随着猪年龄的增长，贾第虫的阳性率有升高的趋势。

贾第虫有8个集聚体（A～H），宿主范围广泛，包括人、哺乳动物及鸟类。不同集聚体的贾第虫感染的宿主存在一定的差异[4]。集聚体A和B具有广泛宿主，可通过污染水源感染人类和多种哺乳动物，其他集聚体多表现出一定的宿主特异性。因此，研究猪源贾第虫的分子特征，进一步进行基因分型，具有重要的公共卫生意义。Wang等[20]报道集聚体E为猪源贾第虫的优势集聚体，但在上海和陕西等地区也有关于猪感染人畜共患性集聚体A的报道[19,21]。本研究基于gdh基因的序列特征，选择获得的代表性序列构建系统进化树，其中58份样品属于集聚体AⅠ亚型，占测序阳性样品的61.70%（58/94），另外36份样品属于集聚体E的不同亚型。对不同年龄段的猪样品进行基因分型分析显示，断奶仔猪和育肥猪均以AⅠ为优势亚集聚体，而母猪则以E1为优势亚集聚体。

贾第虫是一种重要的机会致病寄生性原虫，生产及生活污水等导致的水源污染是引起贾第虫病流行的重要途径，人吞食10个具有活力的包囊即可感染[22]。人贾第虫病流行病学资料显示,中国人群贾第虫感染率近年来在0.16%～6.75%，沿海地区和西部地区的感染率相对较高[23]。姚月娴等[24]报道广州腹泻儿童的贾第虫感染率为4.6%（16/348），检出的16份阳性样本中有14份属于A型集聚体（9份AⅠ亚型，5份AⅡ亚型），2份为B型集聚体。目前，在中国人群中发现的贾第虫有集聚体A、B和C，其中以集聚体A为主[5,23-24]。虽然集聚体E一般认为具有宿主特异性，但也有感染人的报道[5]。本研究在广东省猪群中检出94份阳性粪便样本，其中61.70%（58/94）属于人兽共患的集聚体AⅠ亚型，38.30%（36/94）属于集聚体E的不同亚型，表明本地区猪群中的贾第虫具有人兽跨物种传播能力。华南地区雨水充沛，广东省河流众多且纵横交错，南方地区农村供水水源调查显示，贾第虫包囊的检出率曾经达33.33%[25]。长期在猪养殖场、屠宰场的工人或其所在水域附近的居民具有感染贾第虫的风险，因此有必要对附近人群及水源进一步开展贾第虫流行病学调查，同时要警惕猪源十二指肠贾第虫可能引起的公共卫生问题。

4 结 论

广东省猪群猪十二指肠贾第虫的感染较为普遍，总体阳性率达18.04%，不同地区猪群的阳性率在6.49%～40%之间；其中母猪群和育肥猪群的阳性率分别为24.55%和19.23%，高于断奶仔猪的阳性率13.30%。基于gdh基因特征分析，本研究共获得5个不同的集聚体亚型，其中58份样品属于人兽共患性集聚体AⅠ，36份样品属于集聚体E的4个不同亚型。结果表明，广东省猪源贾第虫存在人兽跨物种传播的风险，应重视该病可能引起的公共卫生问题。