Snail家族基因功能研究进展

李奇隆，陈湘楠，龙 凤，陈嘉玥，杨 森，王 京，昝林森，成 功

（西北农林科技大学动物科技学院，杨凌 712100）

锌指转录因子Snail家族基因在脊椎动物中高度保守，被广泛认为是一种典型的上皮—间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）转录因子。EMT是上皮细胞来源的恶性肿瘤细胞获得迁移和侵袭能力的重要生物学过程。因此，Snail家族基因是检测恶性肿瘤细胞发生转移的一个重要标志基因，长期以来是恶性肿瘤细胞转移方面研究的明星分子[1]。另一方面，Snail作为转录因子参与了Wnt/β-catenin、Notch等信号通路调节，在哺乳动物胚胎发育、干细胞多能性维持及免疫调节等多个生理过程中扮演重要角色[2]。

脂肪生成及肌肉发育等过程影响了哺乳动物，特别是农业动物产肉性能和肉品质。上述过程的本质就是基因表达模式的转变，受到了一系列转录因子的共同作用来调控相关靶基因的表达，进而决定了细胞成肌、成脂分化进程[3]。随着研究的深入，近年来发现锌指转录因子Snail家族基因在哺乳动物脂肪生成和肌肉发育中也发挥了重要作用。Snail家族可通过招募转录辅因子并结合下游靶基因，参与成脂、成肌过程的调节。然而，Snail家族在成脂、成肌调控过程中既表现出功能冗余，也有截然相反的作用，说明该家族基因功能仍待进一步深入研究。以下主要介绍了Snail家族蛋白结构、生物学功能、主要参与的信号通路，总结概括了Snail家族在哺乳动物脂肪和肌肉发育中调控作用的相关研究进展，并对今后Snail家族基因在哺乳动物中研究方向进行了展望，以期为下一步深入阐述其分子机制及其在动物育种中的应用奠定基础。

1 Snail家族基因、蛋白结构及生物学功能

1.1 Snail家族基因及其蛋白结构

Snail家族基因编码具有锌指类结构的转录因子，通过结合下游基因，参与基因转录调控的过程。目前，在脊椎动物中鉴定出了3种Snail家族基因：Snail1（Snai1）、Snail2（Slug）和Snail3（Smuc）[4]，Snail家族成员含有1个多变的氨基末端区域和4～6 个Cys-His（C2H2）锌指结构的高度保守的羧基末端区域。C2H2锌指结构由2个β-折叠片紧连1个α-折叠片和含有1个DNA连接凹槽的氨基酸末端区域组成[5]，与以CAGGTG为核心的靶基因E-box位点结合发挥转录调控作用。SNAG结构域位于Snail蛋白N端，以MPRSFLV氨基酸为特征序列，在多个物种中高度保守[6-7]。研究发现，SNAG结构域通过招募并结合赖氨酸特异性去甲基化酶（lysine-specific demethylase 1，LSD1）[8]、羧基末端结合蛋白（C-terminal-binding protein，CtBP）[9]、组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylases，HDACs）[10-11]等辅抑制因子发挥转录抑制作用。然而，也有研究表明，Snail蛋白可能通过与其他转录因子互作进而具有增强子活化作用，激活下游基因表达[12]。

1.2 Snail家族的基本生物学功能

Snail家族基因在干细胞多能性维持、免疫调节、胚胎发生及癌细胞的迁移等方面具有广泛的生物学功能[7]。干细胞特性维持方面，Snail家族基因可被同源域蛋白Nanog激活进而参与细胞重编程和维持干细胞自我更新[13]。免疫方面，一方面Snail可通过抑制细胞因子和调节免疫细胞引起免疫抑制；另一方面在转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）的诱导下巨噬细胞表达Snail，然后将其募集到损伤或炎症部位，从而直接诱导免疫应答[14]。胚胎发生方面，Snail家族基因在胚胎发育和肿瘤转移过程中胚层的形成、神经嵴形成、细胞存活及左右不对称等过程发挥了重要作用[15-17]。目前，关于Snail家族在参与EMT过程和癌细胞侵袭、迁移方面是研究热点[15-16]。 在EMT过程中，Snail家族在多种组蛋白修饰酶（G9a、EZH2和HDACs）的协同下，抑制E-钙黏蛋白的表达，从而促进了肿瘤细胞EMT过程和侵袭转移功能[18-19]。

2 Snail家族主要参与的信号通路

2.1 Wnt/β-catenin信号通路

Wnt/β-catenin信号通路是胚胎发育中最重要的调控途径之一，异常活化会导致肿瘤、神经系统退行性等疾病的发生。研究发现，β-catenin水平的增加上调Snail1、Snail2基因表达，Snail2敲低后Wnt/β-catenin信号减少[20]。有研究报道，β-catenin抑制睾丸孤核受体4（testicular orphan receptor 4，TR4）的转录活性，进而影响脂肪细胞中脂质稳态，而这种抑制作用是通过诱导转录抑制因子Snail2基因表达实现的[21]。Wnt/β-catenin信号通路下游核心转录因子淋巴增强因子/T细胞因子（Lef/TCF）可以调节胚胎外胚层中Snail2的转录，参与动物早期胚胎发育调控[22-23]。在肿瘤细胞中，Wnt/β-catenin 信号可通过调节Snail家族基因表达参与肿瘤细胞侵袭过程[24]。另外，Wnt/β-catenin可通过抑制Snail1蛋白磷酸化提高Snail1蛋白水平进一步参与EMT过程[25]。肿瘤细胞中，Snail1与β-catenin 蛋白结合进而激活Wnt/β-catenin信号通路下游轴抑制蛋白（Axin）、存活蛋白（survivin）等标志基因表达[12]。上述研究表明，Snail家族基因与Wnt/β-catenin信号通路间可能存在正反馈回路参与生理调节过程。

2.2 Notch信号通路

Notch信号通路是一种细胞间接触依赖性的通讯方式，调节应答细胞的分化方向，影响细胞发育、增殖、分化等多个过程。Notch诱导的Snail2在心脏EMT的启动中发挥重要作用[26]，Snail2基因是Notch通路的直接靶点，Notch信号通过Notch配体CSL（CBF1/Hairless/Lag-1的抑制子）直接调节Snail2基因启动子活性，导致内皮细胞中Snail2基因的上调[27]。Notch信号还可以通过诱导Snail2基因正向调控乳腺癌细胞的EMT、侵袭和生长。除转录水平调控外，Notch通路信号分子Notch胞内结构域（Notch intracellular domain，NICD）可通过直接结合并引起Snail1蛋白泛素化降解，抑制Snail1依赖的肿瘤细胞侵袭[28]。此外，Notch信号通路诱导的Snail2基因表达还参与神经嵴的形成过程[29-30]。有研究表明，在新生的血管内皮细胞中，Snail2可通过结合并抑制Notch配体Delta样配体4（Delta-like ligand 4， DLL4）和Jagged2（JAG2）基因表达， 进而抑制Notch信号通路， 参与调控肿瘤细胞血管生成[31-32]。

2.3 TGF-β/Smad信号通路

TGF-β在细胞的增殖、分化、胚胎发育、免疫调节以及神经系统的发育中都有重要作用。研究发现，TGF-β通过激活Snail1和Snail2基因，诱导分泌细胞外基质的肌成纤维细胞的出现[33]。TGF-β1通过激活Smad2/3信号传导短暂诱导转录因子hey1和高迁移率族蛋白A2（high mobility group protein A2,HMGA2）基因的表达，从而导致Snail1和Snail2基因表达的上调[34]。TGF-β/Smad信号通路TGF-β2的表达促进了内皮-间质细胞转化EMT，且这一过程依赖于Snail1基因表达的激活[35]。此外，Snail1可能通过结合TGF-β/Smad信号通路TGF-β1启动子区并抑制其表达，进而影响Smad的活化过程[36]。另一方面，Snail1和Snail2基因过表达提高了TGF-β受体2（transforming growth factor,beta receptor Ⅱ，TGFBR2）基因启动子区组蛋白乙酰化水平，表明Snail家族可通过调节TGF-β信号通路关键蛋白表达水平参与TGF-β/Smad信号通路调节[37]。

2.4 PI3K-AKT信号通路

磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（PI3K-AKT）信号通路参与了细胞增殖、凋亡、生长及运动等多个生物学过程，具有广泛的生物学效应。糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）是PI3K/AKT信号通路的效应分子[38]，在参与EMT过程的信号通路中具有分子开关的功能，可通过调控Snail1基因的表达和转录活性来调节EMT[39]。有研究表明，PI3K/AKT/GSK-3β信号通路的激活可使GSK-3β发生磷酸化并经过泛素化途径降解，从而抑制了其通过磷酸化修饰介导的Snail蛋白降解[40]。而Snail1可通过激活PI3K和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路来抵抗低血清或肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）所带来的致死效应及癌细胞侵袭过程[41-42]。

3 Snail家族在哺乳动物脂肪和肌肉发育中的作用

3.1 Snail家族在脂肪发育中作用

近年来研究发现，Snail家族可能是调节脂肪发育过程中的重要调节因子，参与了脂肪生成及脂代谢等生理过程。Snail1可以直接结合并抑制过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators-activated receptorγ,PPARγ）、增强子结合蛋白（CCAAT/enhancer binding proteins alpha，C/EBPα）、脂联素（adiponectin）表达，抑制脂肪细胞成脂分化[43]。也有研究发现，Snail通过结合并抑制孤核受体亚家族2F成员6（nuclear receptor subfamily 2 group F member 6，Nr2f6）和白细胞介素17（interleukin 17，IL-17）的表达来抑制脂肪细胞分化[44]。体内试验发现，肥胖小鼠脂肪组织中Snail1基因表达水平高于正常小鼠，而进食过程促进了Snail1基因的表达。脂肪组织特异性敲除Snail1基因显著上调了PPARγ、甘油三酯水解酶（adipose triglyceride lipase,ATGL）的表达，且进一步通过介导“insulin-Snail1-ATGL-lipolysis”信号轴促进脂解过程，导致小鼠脂肪含量减少，脂肪细胞直径变小[45]。在肝脏组织中，胰岛素可激活Snail1表达，Snail1蛋白SNAG区域招募HDAC1、HDAC2进一步上调Snail1靶基因脂肪酸合成酶（fatty acid synthase,FASN）启动子区甲基化，进而抑制肝脏脂肪水解过程[46]。

Snail2基因也参与了脂肪的生成和脂代谢[47-48]，在来源于肥胖人群皮下脂肪的脂肪干细胞中表达量显著高于正常人群[49]。Snail2基因敲除降低了小鼠体内白色脂肪含量，且抑制了胚胎成纤维细胞（mouse embryonic fibroblasts，MEFs）成脂分化及脂滴积累过程[47,50]。研究发现，Snail2可能通过抑制HDAC1与成脂分化关键基因PPARγ启动子区的结合，维持PPARγ基因启动子区开放状态，进而激活PPARγ基因的转录，促进脂肪细胞成脂分化[47]，且Snail2促进了C/EBPα和β对PPARγ基因的激活作用。上述研究表明，Snail2基因上调与脂肪生成呈正相关。然而，也有研究发现，Snail2基因抑制脂肪生成。如3T3-L1细胞中过表达Snail2基因抑制了脂肪细胞的分化[50]。Snail2可通过与TR4蛋白互作抑制其转录活性导致其下游基因脂肪酸转运蛋白（fatty acid transport protein 1，FATP1）、丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxylase）表达下调，进而抑制脂肪细胞分化及脂滴累积[21]。在脂代谢过程中，Snail2通过“Insulin/Snail 2/Lsd1/H3K9 demethylation”信号轴招募赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（lysine-specific demethylase-1,Lsd1）蛋白，降低FASN基因启动子区H3K9甲基化水平，提高FASN的表达，促进肝脏脂肪酸水解过程，表现出与Snail1截然相反的作用[45]。此外，Snail2可结合并调控乙酰辅酶A羧化酶（acetyl coenzyme A carboxylase 1，ACC1）及固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element binding protein，SREBP1c）等基因表达进而抑制脂肪细胞分化及脂解过程[45]。上述研究表明，Snail2介导的脂肪生成及脂代谢调控是一个动态过程，在不同组织及不同发育阶段受到了复杂且精细的调控[47]。

3.2 Snail家族在肌肉发育方面的作用

Snail家族基因参与调控动物的肌肉发育。Snail家族可上调转录因子ZEB1（zinc finger E-box binding homeobox 1）的表达[6]，而ZEB1可以通过调节肌肉干细胞和巨噬细胞的正反馈回路来保护肌肉免受损伤并促进肌肉再生[51]。有研究表明，Snail1促进了生皮肌节（dermomyotome）的EMT过程，而这一过程触发了肌祖细胞生成[52]。Snail2基因表达水平随肌卫星细胞衰老呈下调趋势，且Snail2基因敲除鼠表现为肌肉再生障碍。进一步研究发现，Snail2基因敲除上调了抑癌基因p16lnk4a的表达进而抑制肌肉干细胞自我更新，影响肌肉再生[53]。有研究表明，Snail2是生肌决定因子（MyoD）的下游靶基因，Snail2缺失导致小鼠肌肉的再生缺陷[54]。进一步研究发现，MyoD对Snail2基因的结合和调节是一个动态过程，随着成肌细胞分化过程，Snail2基因启动子区MyoD和H3K27ac结合水平逐渐降低[55]。Snail1和Snail2抑制了肌细胞成肌分化过程，对MyoD的表达没有影响，但可以通过招募HDAC1、HDAC2并竞争性地结合到MyoD下游靶基因启动子区E-boxes位点，阻断了MyoD的转录激活作用，从而抑制肌细胞分化过程[56]。此外，Snail1可直接结合并抑制生肌调节因子5（myogenic regulatory factor 5，MRF5），抑制横纹肌瘤细胞成肌分化[57]。在平滑肌细胞中，Snail2的过表达促进了平滑肌细胞的增殖和迁移，同时通过调节TNF-α和TGF-β1来诱导平滑肌细胞成肌分化[58-59]。

4 结论和展望

综上，Snail家族基因在胚胎发育、干细胞多能性维持及肿瘤发生等多个生理过程扮演重要角色。同时，它也是一类动物脂肪和肌肉发育的重要候选功能基因，其功能解析对于深入研究动物脂肪和肌肉发育的分子机制，并应用于动物分子育种中具有重要意义。作为恶性肿瘤研究相关的明星分子，已经开展了大量关于Snail家族基因在通过EMT过程介导恶性肿瘤侵袭、迁移方面的研究工作，为解析肿瘤的发生、发展奠定了重要基础。然而，目前关于其在调节成脂、成肌过程中的作用研究仍相对较少，其在哺乳动物生理调控中作用机制仍待深入研究。如Snail1可调节自身表达[60]，同时Snail1可以结合并抑制Snail2的表达[10]，且二者在生理调控过程中既表现出功能冗余[61]，也有截然相反的作用[62-63]，这种功能的冗余或相反是如何实现的，是否在不同物种、不同组织或不同发育阶段存在差异，其在脂肪成脂分化和脂代谢动态平衡过程中是如何发挥作用的也仍未知。此外，目前关于Snail1功能的研究多数都集中在其作为转录抑制因子抑制其下游靶基因表达。然而，也有研究发现，Snail1可通过招募转录辅激活子发挥转录激活作用，从而激活下游基因的表达[61]。这提示，Snail家族基因转录调控作用的发挥可能受到了细胞微环境、不同发育、分化阶段等的精细调控，是一个复杂的、动态的调控过程，其潜在分子机制仍待进一步研究。此外，前人研究发现，Snail家族在动物脂肪发育、脂代谢及肌肉发育等生理过程均发挥重要作用，参与脂肪、肌肉发育的多个关键基因（如PPARγ、MyoD等基因）的调控过程[57,64]。然而，其在动物育种中的应用特别是对农业动物产肉性能及脂肪含量等方面的影响仍待进一步探究，这也是今后研究的重要方向。