黄芪总皂苷改善血管性痴呆大鼠的认知功能

张娟利，刘清，王菲

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是一种由于脑血管疾病所致的智力、记忆力、理解力等综合思维能力障碍的综合征[1]。在我国，VD是仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）的痴呆类型，其发病率达1.1%~3.0%[2]，该病可导致患者记忆力、理解力、计算力和定向力等综合思维能力的下降，严重影响患者的日常生活和社会功能[3]。VD作为一种进行性疾病，尚无有效的根治方法，临床主要侧重于防治卒中、改善认知功能障碍及控制心血管危险因素[4]。祖国传统医学认为，“虚、火、风、痰、气、血”为脑血管性疾病的基本病机，气虚血瘀为本病的主要病因，故治疗应以益气活血化痰为主[5]。黄芪总皂苷（astragaloside，AST）为传统益气补血中药黄芪的主要活性组分，具有理气活血、补气升阳之功效，对脑血管疾病具有良好的疗效[6]。既往研究表明，慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）与VD的发生发展密切相关，CCH可引起海马组织神经元细胞的凋亡、自噬、氧化应激等一系列的稳态改变，因此，对海马组织神经元细胞凋亡和氧化应激的控制可能会保护神经，从而起到治疗VD的作用[7,8]。故本研究将AST作用于VD模型大鼠，观察其对大鼠认知功能、神经元细胞凋亡及氧化应激的影响，以期为VD的临床治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠40只，体质量为（200±20）g，购自南京青龙山动物繁殖场，许可证号：SCXK（苏）2020-0696，饲养于恒温（20℃～25℃）恒湿（45%～65%）的洁净动物房内，自由摄食饮水。

1.1.2 主要试剂及设备 AST，购自江苏省医药有限公司，批号200623；甲磺酸二氢麦角碱缓释胶囊，购自赛诺菲安万特（杭州）制药有限公司，规格2.5 mg/片，国药准字H20041355；多巴胺（dopamine，DA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase，AchE）试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和活性氧（reactive oxygen species，ROS）试剂盒，购自南京建成生物工程有限公司；BCA蛋白检测试剂盒，购自日本TAKARA公司；水合氯醛，购自美国Sigma公司；抗B-细胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）兔多克隆抗体、兔抗Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）多克隆抗体、兔抗活化型半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白水解酶-3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-3，cleaved Caspase-3）多克隆抗体和抗β-肌动蛋白（β-actin）兔多克隆抗体，购自美国Cell Technology公司。Morris水迷宫动物行为分析系统，购自上海欣软信息科技有限公司；低温离心机，购自美国Thermo公司；电子天平，购自瑞士Mettler公司。

1.2 方法

1.2.1 VD模型制备 采用双侧颈总动脉结扎术（bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO）建立VD大鼠模型[9]，大鼠腹腔注射10%水合氯醛，待麻醉满意后仰卧固定，消毒后沿正中线切开颈部皮肤，分离双侧颈总动脉，腹腔注射3.5 mg/kg硝普钠，采用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉约10 min，然后移去动脉夹恢复血流10 min，重复2次。于手术处撒少量青霉素粉末，缝合伤口，待大鼠自然清醒，放回笼中。

1.2.2 分组及给药 将40只大鼠随机分为假手术组、模型组、阳性对照组和AST组，每组10只。模型组、阳性对照组、AST组均照上述方法建立VD模型，假手术组不夹闭颈总动脉、不注射硝普钠，其余操作相同。造模成功后，阳性对照组每天灌胃0.45 mg/kg甲磺酸二氢麦角碱缓释胶囊混悬液，AST组每天给予56 mg/kg的AST溶液，假手术组和模型组分别给予等体积的生理盐水，共给药7 d。

1.2.3 大鼠认知功能测试 采用Morris水迷宫实验[10]测试各组大鼠的认知功能。Morris水迷宫为高50 cm、直径120 cm的圆筒形宫体，内部设有一直径10 cm的平台，将平台置于第一象限水下约1 cm处，水中加入钛白粉以阻止大鼠看见水下平台。提前将大鼠置于水迷宫所在房间使其充分适应。维持水温在20℃～24℃，每次实验均将大鼠由象限中点面向宫体壁投入水中。实验分为学习阶段和记忆阶段：①学习阶段设计为5 d，于每天同一时间将大鼠投入水中，摄像头记录大鼠在120 s内寻找水下平台所需的时间，即逃逸潜伏期，若未在120 s内找到平台则记为120 s，每只大鼠每天学习4次；②第6天为记忆阶段，移去水下平台，将大鼠投入水中后观察大鼠120 s内在原先平台所在象限（第一象限）内停留的时间。

1.2.4 大鼠海马组织中DA、5-HT、AchE和SOD、MDA、ROS的含量测定 大鼠断颈处死，取海马组织，用冰PBS缓冲液冲洗，滤纸擦干，称重。在冰浴下研磨，以PBS缓冲液制备成10%的匀浆液，低温离心机4 000 rpm离心10 min，取上清，检测其中DA、5-HT和AchE的含量；采用黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）法检测其中SOD的含量，荧光酶标仪检测ROS的含量，硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法检测MDA的含量，所有操作均严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.5 Western blotting检测Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白的表达 取部分海马组织，冰PBS缓冲液洗涤3次，剪碎，过200目钢筛研磨，收集研磨后的海马组织，加入200μL裂解液，采用BCA法定量蛋白，取总蛋白40μg，以5×样品缓冲液配平上样体积，置于100℃沸水浴上5 min使蛋白变性，上样，SDS-PAGE电泳90 min后转膜60 min，以5%TBST脱脂奶粉封闭，加一抗，4℃反应过夜，TBST漂洗液洗膜5 min 3次，加HRP标记的二抗，37℃振荡孵育90 min，于室温下将PVDF膜置于ECL混合液中振荡温育，采用凝胶成像系统显影并分析Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3条带的灰度值，与β-actin的灰度的比值即为Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白的相对表达。

1.3 统计学处理

采用SPSS22.0软件分析数据，计量资料以（均数±标准差）表示，t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠一般情况

行BCCAO术后，模型组、阳性对照组和AST组大鼠苏醒后精神萎靡，不喜活动。模型组大鼠在整个实验期间摄食饮水减少，体重有所减轻，自发活动亦明显减少，部分大鼠出现眼睑下垂、毛发稀疏、缺乏光泽的现象，另有少数大鼠呼吸出现哮鸣音。阳性对照组和AST组大鼠在开始接受治疗后，上述症状均显著缓解，精神恢复正常，活动敏捷。各组大鼠在实验期间均未发生死亡。

2.2 大鼠认知功能比较

各组大鼠寻找水下平台的时间随着学习天数的增加均逐渐缩短，见图1A；第1天时，模型组、阳性对照组和AST组大鼠寻找水下平台所需时间差异无统计学意义（P＞0.05）；自第2天开始，阳性对照组和AST组大鼠所需时间短于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05）。第6天时，阳性对照组和AST组大鼠的停留时间长于模型组，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1B。

图1 各组大鼠认知功能比较（n=10）

2.3 各组大鼠海马组织中DA、5-HT和AchE的含量比较

模型组大鼠海马组织中DA、5-HT和AchE的含量均低于假手术组（P＜0.05）；与模型组相比，阳性对照组和AST组大鼠海马组织中DA、5-HT和AchE的含量升高（P＜0.05）；模型组大鼠海马组织中SOD的含量低于假手术组（P＜0.05），而MDA和ROS的含量高于假手术组（P＜0.05）；与模型组相比，阳性对照组和AST组大鼠海马组织中SOD的含量升高（P＜0.05），同时MDA和ROS的含量降低（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠海马组织中DA、5-HT、AchE、SOD、MDA和ROS的含量比较（±s）

表1 各组大鼠海马组织中DA、5-HT、AchE、SOD、MDA和ROS的含量比较（±s）

注：与假手术组相比，①P<0.05；与模型组相比，②P<0.05

组别假手术组模型组阳性对照组AST组只数10 10 10 10 DA/(×10－6)52.79±5.66 20.42±3.02①39.67±5.05②36.87±4.31②5-HT/(×10－6)45.73±5.17 24.74±3.34①39.18±4.85②35.99±4.32②AchE/(U/mg)2.83±0.19 1.56±0.12①2.42±0.23②2.33±0.27②SOD/(U/mg)2.49±0.56 0.82±0.12①1.67±0.15②1.59±0.21②MDA/(nmol/mg)1.13±0.17 4.04±1.14①1.88±0.55②1.83±0.62②ROS/(RFU/ug)1.03±0.15 2.76±0.32①1.38±0.33②1.43±0.37②

2.4 各组大鼠海马组织中Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白的相对表达

与假手术组相比，模型组大鼠Bcl-2的相对表达降低，而Bax和cleaved Caspase-3的相对表达升高（P＜0.05）；与模型组相比，阳性对照组和AST组Bcl-2的相对表达提高，同时Bax和cleaved Caspase-3的相对表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠海马组织中Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白的表达（±s）

表2 各组大鼠海马组织中Bcl-2、Bax和cleaved Caspase-3蛋白的表达（±s）

注：与假手术组相比，①P<0.05；与模型组相比，②P<0.05

组别假手术组模型组阳性对照组AST组只数10 10 10 10 Bcl-2 1.09±0.09 0.32±0.02①0.81±0.05②0.77±0.06②Bax 0.24±0.03 0.93±0.08①0.64±0.05②0.61±0.05②cleaved Caspase-3 0.89±0.16 1.66±0.22①1.09±0.13②1.13±0.17②

3 讨论

当今全球人口老龄化加剧，VD的发病率也日益增长，给患者家庭和社会带来极大的负担[11]。传统中医认为，VD属“中风、文呆、武呆、健忘、郁证”的范畴，气虚血瘀、痰瘀互结为本病的主要病理机制，因此治疗应以益气活血化痰为主[12]。现代药理学研究表明，AST具有抗炎、抗细胞自噬、抑制神经元细胞凋亡、改善脑组织能量代谢和抗氧化应激等作用，因此对脑血管疾病具有良好的疗效[13,14]。

Morris水迷宫实验显示，自第2天开始，阳性对照组和AST组大鼠所需时间显著短于模型组，且第6天时阳性对照组和AST组大鼠在目标象限停留时间显著长于模型组，提示AST对VD模型大鼠的认知功能有显著的改善效果。认知功能与中枢胆碱能系统密切相关，临床研究认为中枢胆碱能系统受损是导致VD的重要原因之一[15]。AchE分解生成重要的中枢神经系统神经递质—乙酰胆碱（acetylcholine，Ach），后者在海马组织及神经元活动中发挥关键作用。DA和5-HT作为单胺类神经递质，参与大脑的功能活动。张惠琴等[16]的研究显示，大鼠海马区内单胺类递质的含量可反映VD模型大鼠的认知功能情况，DA、5-HT、AchE及去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）的含量升高，说明大鼠认知功能越好。本研究中，模型组大鼠海马组织中DA、5-HT和AchE的含量均低于假手术组，而阳性对照组和AST组大鼠在接受治疗后，海马组织中DA、5-HT和AchE的含量升高，提示AST可通过提高海马组织神经递质的释放而达到改善VD大鼠认知功能的效果。

海马组织在学习、记忆等认知和综合思维能力方面起关键作用，但其对缺血缺氧等因素极为敏感。既往研究[17,18]认为，氧化应激在VD发病过程中扮演重要的角色，当海马组织发生缺血缺氧损伤时，其ROS的表达水平便会升高。ROS具有高度氧化活性，可导致核酸、结构蛋白、糖类、脂类等氧化性损伤，进而造成组织细胞受损。SOD为机体内重要的氧自由基清除剂，对防止氧化应激损伤至关重要。MDA是机体氧化反应的产物之一，其表达水平可体现体内氧自由基的水平，进而反映机体氧化应激的损伤程度[19]。在本研究中，模型组大鼠海马组织中SOD的含量低于假手术组、MDA和ROS的含量高于假手术组，阳性对照组和AST组大鼠经治疗后，海马组织中SOD的含量升高、MDA和ROS的含量显著降低，提示AST可抑制VD模型大鼠海马组织内的氧化应激，从而对VD起到治疗作用。李静娴等[20]的研究同样表明，AST与三七总皂苷（panax notoginseng saponins，PNS）联合应用于缺血再灌注损伤模型大鼠，可有效改善其神经功能和认知功能，其作用机制与降低海马区氧化应激有关。

氧化应激与细胞凋亡之间存在紧密的联系，当细胞发生氧化损伤或应激反应时，凋亡调控程序即被激活[21]。细胞内过量的氧自由基能诱导Caspase-3的活化，剪切多种关键蛋白，从而激活凋亡发生。Bax是一种重要的促凋亡蛋白，在受到凋亡信号刺激时即可发生构象改变，并转移至线粒体内，促使线粒体内细胞色素C（cytochrome c，cyt-c）的释放，而cyt-c的大量释放可激活Caspase-9，切割Caspase-3前体，启动Caspase级联放大反应，造成DNA损伤，进一步介导细胞凋亡。Bcl-2是一种重要的抗凋亡蛋白，可与Bax形成异源二聚体，阻碍Bax发挥促进线粒体内cyt-c释放的作用，从而抑制细胞凋亡的发生[22,23]。单铁强等[24]报道称，黄芪提取物可通过降低大鼠海马组织中NF-κB和Caspase-3蛋白的表达，从而抑制痴呆大鼠神经细胞的凋亡。李虎虎等[25]的研究显示，黄芪注射液可升高糖尿病神经损伤模型大鼠海马区抗凋亡基因Bcl-2的表达，并降低促凋亡基因Bax及Caspase-3的表达，从而改善大鼠的学习记忆能力。本研究结果显示，模型组大鼠Bcl-2的相对表达低于假手术组，而Bax和cleaved Caspase-3的相对表达高于假手术组；阳性对照组和AST组Bcl-2的相对表达提高、Bax和cleaved Caspase-3的相对表达降低，提示AST可改善VD大鼠海马组织神经元细胞的凋亡，从而达到治疗VD的目的。

综上所述，本研究显示，AST可显著改善VD大鼠的认知功能，其作用机制可能与调节神经递质释放、抑制氧化应激和海马组织神经元细胞凋亡有关。