蛋白C p.Ala333Thr突变引起遗传性蛋白C缺陷症的分子机制

余晓敏，常国林，郑逸旸，陈诚，唐施艺，吴鑫媛，吕佳，林向阳，朱丽青

1.温州医科大学附属第一医院 医学检验中心 浙江省检验诊断及转化研究重点实验室，浙江 温州 325015；2.温州医科大学附属第一医院 温州市血液学重点实验室，浙江 温州 325015；3.温州医科大学附属第二医院 病理科，浙江 温州 325027

遗传性蛋白C缺陷症（inherited protein C deficiency, IPCD）是由位于2号染色体2q13-2q14的蛋白C基因（protein C gene, PROC）突变所引起的常染色体隐性、显性或不完全显性遗传性疾病[1]，全球发病率约为1/16 000[2]。IPCD的典型临床症状包括血栓性并发症、暴发性紫癜、弥漫性血管内凝血和新生儿期继发性出血，与PROC突变类型密切相 关[3]。截至目前，已报道300多种PROC突变[4]。IPCD可分为两种类型：I型表现为蛋白C（protein C, PC）抗原水平和功能同时降低，II型表现为PC功能降低而抗原水平正常，或PC活性远低于抗原水平，大多数IPCD属于I型缺陷[5]。虽然IPCD于1981年就曾被首次报道[6]，但其具体致病机制至今尚未完全明晰。本课题组发现了1个由p.Ala333Thr突变引起的I型IPCD家系，家系成员中多位有血栓形成史[7]，经测序发现患者PROC的第9号外显子存在c.1084G＞A杂合错义突变，导致p.Ala333Thr，但基因突变导致PC含量降低的分子机制尚不明确。因此，本研究构建PC p.Ala333Thr突变型质粒，通过体外实验对PC p.Ala333Thr突变导致IPCD的致病机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 先证者及其家系 先证者及其家系6人均纳入研究，随机抽取本院100名健康成年人作为对照组，其中男45例，女55例，年龄12～58岁。本研究通过温州医科大学附属第一医院的伦理委员会审查（伦理批号：KY2022-R050），且所有受试者均知情并签署知情同意书。先证者，女，39岁，因双下肢反复疼痛前往温州医科大学附属第一医院就诊。既往有下肢深静脉血栓形成史，长期口服华法林抗凝，家族中父亲因脑静脉窦血栓死亡，哥哥因肺栓塞死亡，家系图见图1。入院检查：PC活性39%，抗核抗体1∶320阳性，下肢血管超声显示左小腿深静脉血栓形成，临床诊断为“PC缺陷症，系统性红斑狼疮，下肢深静脉血栓形成”。

图1 IPCD家系图

1.2 人胚胎肾细胞HEK-293T的培养 HEK-293T细胞培养于含有10%胎牛血清（美国Gibco公司）的DMEM完全培养基。当细胞生长密度达到80%～90%时以1∶5的比例进行传代，传代后将细胞置于37 ℃、 5% CO2培养箱静置培养，接种后2～3 d即可长成致密单层。

1.3 PC p.Ala333Thr突变体质粒的构建 在已有野生型质粒：pCMV3-SP-N-Flag-PC WT（北京Sino Biological公司，见图2）的基础上，采用 QuickMutationTM定点突变试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）构建突变体表达质粒：pCMV3-SP-NFlag-PC p.Ala333Thr。挑取多个克隆进行全长测 序，经测序发现定点突变成功引入，且没有引入其他变异，最后将构建成功的突变质粒用QIAGEN质粒提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）大规模抽提，并转染入生长状态佳的HEK-293T细胞进行过表达。所有质粒都经正、反向测序证实构建成功，质粒测序图谱见图3。

图2 质粒结构图

图3 PROC第9号外显子存在c.1084G＞A杂合错义突变

1.3 细胞转染 转染实验分为WT组（转染pCMV3-SP-N-Flag-PC WT质粒）和Ala333Thr组（转染pCMV3-SP-N-Flag-PC p.Ala333Thr质粒），每组3个复孔，按Lipofectamine 2000试剂（美国ThermoFisher公司）说明书进行瞬时转染。将生长状态佳的HEK-293T细胞按5×105/孔接种于6孔培养板中，每孔加入3 mL无双抗完全培养基（含10%胎牛血清），在37 ℃，5% CO2的恒温培养箱中培养16 h至细胞密度达60%～70%时进行转染。分别在转染24 h后提取细胞总RNA进行RT-qPCR分析，转染48 h后提取细胞总蛋白质进行Western blot分析并收集细胞培养上清液进行ELISA分析。

1.4 RT-qPCR检测PC转录水平 使用RNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）抽提转染细胞总RNA，用PrimeScript RT Reagent Kit（日本TaKaRa 公司）配制RT反应液，混匀后进行反转录反应，使用ABI Prism 7500实时荧光定量PCR仪（美国 Applied Biosystems公司），按照两步法PCR扩增程序执行，反应结束后确认RT-qPCR的扩增曲线和熔解曲线。采用Ct法比较分析突变型PROC和野生型PROC表达水平的差异。

1.5 Western blot检测细胞内PC表达水平 提取收集细胞总蛋白后，通过Western blot法检测细胞系中PC表达量。SDS-PAGE进行蛋白分离，恒压电流浓缩胶80 V，分离胶120 V。湿转法进行蛋白转膜，冰浴中以300 mA电流转膜90 min。用5%的脱脂奶粉室温封闭1 h。按照说明书标示比例加入经稀释的PC抗体（美国Proteintech公司）、GADPH抗体（美国Proteintech公司），4 ℃轻摇过夜。次日，洗膜后按照1∶5 000体积比加入PBST稀释的兔抗，室温轻摇1 h。最后将曝光液滴加在条带上，置于曝光机内曝光，使用软件Image J分析获得的条带。

1.6 ELISA检测细胞外PC表达水平 转染48 h后，分别收集两组所有细胞培养液，用Amicon Ultra-4 10K超滤管将细胞培养液浓缩10倍。通过ELISA法检测细胞外PC表达水平。按照说明书（上海江莱生物科技有限公司）稀释标准品至相应浓度，在标准品孔内加入不同浓度的标准品50 μL，样本孔中加入待测样本50 μL，空白孔中加样本稀释液50 μL。除空白孔外加辣根过氧化物酶标记抗体100 μL/孔，封板后置于37 ℃温育60 min。洗涤液重复洗板5次后加入底物A，B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min后加入终止液50 μL，15 min内在450 nm波长处测定OD值。计算所得的样本浓度，除以浓缩倍数即WT组和Ala333Thr组PC的细胞外浓度。

1.7 PC及细胞器免疫荧光染色 铺Ф35 mm共聚焦专用皿，每皿接种5×104个细胞。细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h后转染，继续培养48 h。一抗使用3% BSA配制PC兔多抗（1∶500），二抗使用3% BSA配制抗兔FITC抗体（1∶200）。按照说明书分别配制ER Tracker Red工作液（上海碧云天生物技术有限公司）（1∶2 000）和Golgi Tracker Red工作液（上海碧云天生物技术有限公司）（1∶800），室温下避光孵育1 h吸走所有工作液，使用PBS清洗3次。在荧光显微镜下观察PC在内质网（endoplasmic reticulum, ER）和高尔基体（Golgi apparatus, GA）中的分布情况。

1.8 统计学处理方法 采用SPSS23.0软件进行统计学分析。计量资料采用±s表示，两组均数比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意 义。

2 结果

2.1 生物信息学分析 PolyPhen-2是用于预测氨基酸替代对蛋白质结构和功能影响的软件，通过给出预测分值量化评估突变类型的有害性，该值越接近1则表示突变造成的危险性越高，PolyPhen-2对先证者PC的突变类型危害程度评分为0.763，因而，预测p.Ala333Thr有害性为高。此外，我们利用多序列在线比对工具T-Coffee对PC的第333位氨基酸在同源物种间的保守性进行评估，显示该位点保守性不高，见图4。

图4 PC第333位氨基酸保守性分析结果

2.2 PC p.Ala333Thr突变体转录水平和细胞内外蛋白水平变化 RT-qPCR结果显示，转染24 h后，PC WT和PC Ala333ThrPROCmRNA表达差异无统计学意义（P=0.120），表明PC Ala333Thr突变体在转录水平未发生明显变化（见图5A）。Western blot结果显示，质粒转染48 h后PC WT和PC Ala333Thr的PC蛋白表达差异有统计学意义（P=0.020），表明PC Ala333Thr突变体在HEK-293T细胞中的蛋白表达量明显降低（见图5B）。转染48 h后，收集培养细胞的上清液，通过ELISA检测上清液中PC含量，实验结果显示p.Ala333Thr突变体的PC水平为60%±27.4%，明显低于WT组，这与I型IPCD的临床表型一致（见图5C）。

图5 PC p.Ala333Thr突变体转录水平和细胞内外蛋白水平变化

2.3 PC p.Ala333Thr突变体在ER和GA中含量的变化 我们将野生型PC质粒和p.Ala333Thr突变PC质粒转染后的HEK-293T细胞分别用ER和GA的荧光染料进行染色。染料可以使相应的细胞器在激光共聚焦显微镜下经594 nm激光激发红色荧光，而经染色的PC经488 nm激光激发绿色荧光，若PC在相应细胞器内，则两种颜色重叠显黄色荧光。结果显示，野生型PC除在ER分布外，在GA内也大量存在；突变蛋白主要分布在ER，少量进入GA内，见图6。

图6 野生型PC和突变型PC在细胞器内的定位

3 讨论

PC是人体重要的抗凝蛋白，在机体抗凝血功能中发挥重要作用。PC在凝血酶或凝血酶-血栓调节蛋白复合物的催化下，转变为活化蛋白C（activated protein C, APC），后者与辅因子蛋白S（protein S, PS）结合后，通过多种机制发挥抗凝血作用[8]。PC缺乏可引起静脉血栓栓塞、暴发性紫癜、弥散性血管内凝血等。

IPCD是由2号染色体长臂（2q13-14）上的PC基因突变引起[9]，多为常染色体显性遗传，严重的PC缺陷与纯合性或复合杂合性突变有关，最终通过影响mRNA的正常序列和蛋白质合成导致IPCD[10]。在我们的研究中，先证者及其家系发生PC p.Ala333Thr 突变，导致IPCD发生，引起机体静脉血栓栓塞等多种疾病。

本研究成功构建了PC p.Ala333Thr突变的质粒，经细胞转染后发现该突变导致PC表达量相对下降，该结论与临床结果相符合[7]。因此认为患者PROC的p.Ala333Thr突变导致PC含量偏低。为探讨p.Ala333Thr突变位点对PC结构和功能的影响，我们通过PolyPhen-2软件对p.Ala333Thr突变进行评估，评分结果为0.763分，评估有害性高，提示该突变可能影响到PC的结构和功能。为进一步分析p.Ala333Thr突变引起的IPCD的分子致病机制，本研究用野生型质粒和p.Ala333Thr突变型质粒分别转染HEK293T细胞。RT-qPCR实验显示，p.Ala333Thr突变型质粒转染的细胞PC mRNA转录水平与野生型质粒转染的细胞PC mRNA相比没有明显差别，说明该位点的突变并没有导致PROC基因在转录水平的下降，而Western blot和ELISA结果显示，细胞内和细胞外的PC都出现显著降低，因此，蛋白表达量的下降原因可能发生在细胞内细胞器对蛋白质进行加工、转运等过程中。我们选择了在细胞内负责蛋白质加工、转运和筛选的两种主要细胞器ER和GA，进行免疫荧光染色。免疫荧光染色结果显示，PC p.Ala333Thr突变体在ER中的含量变化不明显，而在GA内突变体含量相对野生型明显下降。因此我们推测PROC的p.Ala333Thr突变可能导致其翻译或PC转运过程受损。

ER是一种连接细胞核、细胞质和细胞膜的细胞器，在生物合成、折叠、稳定、分泌和跨膜蛋白运输中发挥重要作用。值得重视的是，蛋白质的折叠和组装过程很容易发生错误，导致错误折叠蛋白质的产生，引起蛋白质稳态失衡[11]。为了维持稳定，ER通过泛素-蛋白酶体系统或溶酶体来筛选和清除部分错误折叠的蛋白质，称之为ER相关降解或ER吞 噬[12-13]。在本研究中，PROC发生了p.Ala333Thr位点的突变，该突变可能导致PC的折叠与组装发生错误，从而引发PC在ER内被降解，不能顺利运输入GA内。

GA是细胞内中心的膜结合细胞器，在分泌蛋白及脂类的运输、加工和分类中起关键作用[14]。错误折叠的蛋白质可脱离ER而被运输到GA，由GA对其进行识别，由溶酶体靶向降解[15]。在本研究中，免疫荧光结果显示，PC p.Ala333Thr突变体在GA内的含量明显下降，证实了PC突变体含量的下降是在ER向GA运输的过程中发生的。

综上所述，本研究证实PC p.Ala333Thr突变造成PC表达量的下降，从而引发IPCD。通过体外表达实验，我们推测：PC表达量下降的关键分子机制在于p.Ala333Thr位点突变造成PC发生了折叠错误，从而在ER内被分选并促使错误折叠的PC被降解或吞噬，阻止其向GA运输，最终导致PC含量的减少。