基于网络药理学及分子对接技术研究白头翁治疗肺癌的潜在作用机制

高宇 高秀丽 岳丽玲

【摘要】目的：探寻白头翁治疗肺癌的物质基础及潜在的作用机制，为肺癌的中医药治疗提供参考。方法：通过 TCMSP 及 Swiss Target Prediction 数据库检索白头翁活性成分及作用靶点;通过 OMIM 和GeneCards数据库筛选肺癌疾病靶点;采用 DAVID 数据库对白头翁的作用靶点进行 GO 功能和 KEGG 信号通路富集分析;使用 Auto Dock Vina 软件对白头翁核心成分与靶蛋白进行分子对接验证。结果：白头翁与肺癌交集靶点共21个，主要富集在33个 GO 生物功能和50条 KEGG 通路，分子对接所得结合能均较低。结论：白头翁通过调节细胞增殖和凋亡等功能，并影响 VEGF 和 p53等信号通路发挥其抗癌作用，可为肺癌的基础实验与临床研究提供理论依据。

【关键词】白头翁;网络药理学;肺癌;机制;活性成分

【中图分类号】S858.28  【文献标识码】A  【文章编号】2096-5249（2022）14-0001-0004

To study the potential mechanism of pulsatilla pulsatilla in the treatment of lung cancer based on network pharmacology and molecular docking technology

Gao Yu1，Gao Xiu-li1，Yue Li-ling2△

1.Jiamusi University，Jiamusi 154000，China

2.Qiqihar Medical College ，Qiqihaer 161006，China

【Abstract】Objective：To explore the material basis and potential mechanism of Pulsatilla pulsatilla in the treatment of lung cancer，and to provide reference for the treatment of lung cancer with TRADITIONAL Chinese medicine.Methods：The  active  components  and  Target  were  searched  by  TCMSP  and  Swiss  Target  Prediction database.Lung  cancer  targets  were  screened  by  OMIM  and  GeneCards  databases. DAVID  database  was  used to analyze the GO function and KEGG signal pathway enrichment of the target of Pulsatilla pulsatilla.Auto Dock Vina was used to verify the molecular docking between core components and target protein of Pulsatilla pulsatilla. Results：There were 21 targets for the intersection of Pulpaeatum and lung cancer，which were mainly enriched in 33 GO biological functions and 50 KEGG pathways，and the binding energy obtained by molecular docking was low. Conclusion：Pulsatilla pulsatilla plays an anticancer role by regulating cell proliferation and apoptosis and in?uencing VEGF and p53 signaling pathways，which can provide theoretical basis for basic experiments and clinical studies of lung cancer.

【Key words】Pulsatilla pulsatilla;Network pharmacology;Lung cancer;Mechanism;The active ingredient

肺癌是全世界最常见、最致命的恶性肿瘤之一，目前，肺癌死亡率呈逐渐上升趋势，严重危害人类生命。也是全世界癌症相关死亡的主要原因。对疾病生物学的普遍了解的实质性改善、预测性生物标志物的应用以及治疗的改进使许多患者取得了显著的进步并改变了许多患者的预后。此外，降低吸烟率也有助于降低高收入国家的肺癌发病率和提高患者生存率。近年来，男性肺癌发病率的下降速度是女性的两倍，反映出女性吸烟和戒烟的历史延迟。然而，低收入国家的新肺癌确诊病例继续增加，这些国家的戒烟倡议落后，获得保健服务的机会很少[1]。此外，从未吸烟的人也会被诊断为肺癌。因此，我们要特别关注肺癌的筛查、诊断和治疗的进展。

西医治疗肺癌的方法包括手术、化疗、放疗和免疫治疗，其中化疗治疗效果较显著，能提高患者的生活质量 [2]。但化疗的同时，会导致患者的正常细胞受到损伤，可产生胃肠道反应、骨髓抑制和口腔黏膜损伤等较严重的副作用。因此，肺癌患者进行化疗时，临床上多采用中药或中药复方进行辅助治疗，在防治肺癌的过程中弥补西医治疗的缺点和不足，提高患者生活质量并延长患者的生存期。中医药作为综合疗法的一部分，受到了广泛的研究关注。因此，研究肺癌早期转移的分子机制，结合新的中医药治疗方法和抑制非小细胞肺癌转移的药物，可能是治疗非小细胞肺癌的一条有前途的途径。

白头翁（Pulsatilla radix）在中国已有两千多年的药用历史。“中国药典”记载它来源于毛茛科白头翁的干燥根，白头翁的根具有增强免疫功能作用、抗氧化、抗炎、抗肿瘤的药理作用。目前，白头翁治疗肺癌的药理作用已有相关报道[3]，但其系统性药理学研究较少，尚未完全阐明其抗肺癌的药用有效成分及分子作用机制。本文通过网络药理学研究方法，构建“药物- 成分 -靶点”网络，探究白头翁治疗肺癌过程中发挥作用的关键靶点和相关分子网络调控机制，可为白头翁治疗肺癌的体内外实验和临床研究提供新的思路和方向。

1  材料与方法

1.1  白头翁药效成分筛选与靶点预测

以“白头翁”为关键词，在TCMSP（TCMSP：http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）平台及 Swiss Target Predictio n （http：//www.swisstargetprediction.ch/）數据库筛选有效成分及靶点，并在Uniprot（https：//www.uniprot.org/）数据库对有效成分作用靶点进行筛选和标准化命名为基因名。并在 Cytoscape3.7.2软件中，构建“药物- 成分- 靶点”网络，进行可视化拓扑分析。

1.2  预测肺癌疾病靶点

以“Lung Cancer”为关键字，在Genecards和OMIM数据库检索肺癌靶点并去除重复值，建立肺癌疾病靶点数据集。利用Venn软件绘制“药物- 疾病”共同靶点图，其交集部分可认为是白头翁治疗肺癌的候选靶标。

1.3  靶点相互作用网络构建

将交集靶点输入 STRING（https：//string-db.org/）平台，绘制共表达靶点蛋白质- 蛋白质互作网络（PPI）。  1.4  靶点富集分析

将1.2中得到的交集靶点输入 DAVID 数据库，分析GO 生物过程和KEGG 信号通路。并在SangerBox网站对数据进行绘图及可视化分析。

1.5  分子对接

将1.5项下筛选的10个核心靶点与白头翁主要活性成分进行分子对接验证。根据Pubchem数据库获得白头翁活性成分的结构，从 PDB（https：//www.rcsb.org/） 数据库中获得作用靶点的晶体结构信息（PDB：CASP- 4 PS0，ERS1-3 P86，JUN-2 G01），利用AutoDock Vina 软件进行分子对接以验证预测结果的可靠性，计算出活性成分与靶蛋白的最小结合能。

2  结果

2.1  收集白头翁活性成分与潜在靶点

通过检索TCMSP 数据库共获得8个有效成分和73个药物成分作用靶点，包括Sitosteryl acetate（谷甾醇乙酸酯）、Aureusidi n（金鱼草素）、层粘连蛋白（LAN）、锌指蛋白（ZINC01615307）、Mairi n（丁子香萜）、Isorhamneti n （异鼠李素）、Beta-sitosterol（β-谷甾醇）和 Stigmasterol （豆甾醇）。将上述药物、成分及靶点数据输入到 Cytoscape3.7.2软件中，获得药物- 成分- 靶点网络图。

2.2  收集肺癌疾病靶点

利用GeneCards和 OMIM 数据库，获得与肺癌疾病靶点信息共1021个，将这些靶点定义为肺癌疾病的相关靶点。利用 Venn 图软件获得白头翁药物与肺癌交集靶点共21个。

2.3  靶蛋白相互作用PPI网络

将交集靶基因输入到STRING 数据库中进行分析。PPI 网络中有20个节点，96条边，平均度值为9.14，这充分体现了疾病机制的交互复杂性以及中药治疗疾病的机制特点。将 STRING 数据库中得到的结果输入到 Sytoscape3.7.2中，利用其中的SytoHubba插件筛选hub 基因，选择 Degree 算法筛选出前十位的 hub 基因，分别为：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（CASP3，CASP8， CASP9）、前列腺素 G/H 合酶（PTGS2）、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK14）、转录因子 p65（RELA）、雄激素受体（AR）、转录因子 AP-1（JUN）和 RAS 相关蛋白Rab-28（PGR）及 ESR1。表明这些靶点在互作网络中具有重要作用，可作为白头翁治疗肺癌的重要预测靶标。

2.4  GO功能与KEGG信号通路富集分析

将21个交集靶基因提交至 DAVID 数据库进行 GO 功能和 KEGG 信号通路富集分析，P <0.05。涉及 GO 功能共33个，其中生物过程（BP）22个，细胞组成（CC）4个，分子功能（MF）7 个。其主要的 GO 功能包括细胞增殖及凋亡、调节线粒体膜电位和转录激活活性等。涉及 KEGG 信号通路共50条，主要包含肺结核、肿瘤坏死因子、VEGF、P53和小细胞肺癌等通路。

2.5  分子对接

为了验证预测结果的可靠性，本研究选择白头翁治疗肺癌的蛋白互作网络中度值较高的3 个核心靶点 JUN、CASP3和 ESR1与 8个化合物进行分子对接（见图1），计算活性成分与核心靶点的结合能均低于-5.0 kcal/mol，表明所筛选的药物成分与靶点之间具有很好的结合活性。靶点 JUN 与 ESR1与化合物 LAN、ZINC01615307和 Stigmasterol 的结合能小于 -9.0 kcal/mol，表明白头翁的多种活性成分可能通过作用于以上靶点参与肺癌的治疗。

3  讨论

我国名贵中药白头翁用药历史悠久，早在《神农本草经》[4]中就有记载，具有抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗氧化、促进免疫等作用。远处转移是早期肺癌患者死亡的主要原因，白头翁皂苷 E 抑制 A549细胞的增殖、迁移和侵袭[5]。白头翁皂苷 D 通过调节 AKT/mTOR 信号通路抑制人结肠癌细胞的发展。

本研究通过白头翁有效活性成分的挖掘，发现白头翁中主要活性成分包含：豆甾醇、β-谷甾醇和异鼠李素等，提示这几种有效成分在治疗肺癌中发挥着重要的作用。豆甾醇是植物甾醇中的一个重要组分，既往研究证实植物甾醇能降低肿瘤发病风险、遏制肿瘤细胞生长、促凋亡和调节免疫活性。有研究表明，β-谷甾醇可通过上调 p53、Bax基因表达而诱导肺癌细胞凋亡，表明植物甾醇能降低肿瘤发病风险、遏制肿瘤细胞生长、促凋亡和调节免疫活性[6]。在 Lewis 肺癌小鼠模型中发现白头翁具有很强的抗肿瘤活性。其在体外和体内抑制人肝细胞癌和胰腺癌细胞的生长。分子研究表明， PSA 可能诱导 DNA 损伤，导致细胞 G2/M 期停滞和细胞凋亡。有研究表明，β-谷甾醇可通过上调 p53、Bax基因表达而诱导肺癌细胞凋亡[7]，异鼠李素可能通过上调凋亡基因Bax、caspase-3和 p53的表达，下调Bcl-2、Cyclin-D1和 PCNA 表达的机制有关，诱导肺癌A549细胞凋亡[8]。另外，官紫祎[9]等发现白头翁皂苷抑制肺癌NCI-H460细胞的增殖并可能干预 MAPK 信号通路及调控 CASP 途径诱导其凋亡。我们对白头翁治疗肺癌的预测结果与当前相关研究结果基本一致，证明预测的可靠性，所以豆甾醇、β-谷甾醇和异鼠李素等可能是白头翁治疗肺癌的主要有效成分，具有潜在的研究价值。

靶蛋白相互作用 PPI 网络筛选 CASP3、CASP8、 CASP9、NOS2、ESR1和 MAPK14等为白头翁治疗肺癌的核心靶点。CASP3可能作为潜在的干预靶点而促进肿瘤细胞凋亡[10]，其诱导 PAC-1与顺铂联用而协同诱导肺癌细胞凋亡[11]。CASP8影响 T 细胞的活性和增殖，在治疗肺癌中发挥着重要作用[12]。研究发现 NOS2基因（CCTTT）n 多态性的长等位基因与非吸烟者中的肺癌发病风险降低相关[13]，NOS2的高表达可被认为是治疗非小细胞肺癌良好的预后指标。ESR1能有效地抑制细胞凋亡促进肺癌细胞异常增殖，ESR1信号的激活被证明与肺癌细胞的间质和耐药特征相关[14]。MAPK14对肺癌细胞 H1299具有放射增敏作用，在细胞分化和增殖等过程中具有重要影响[15]。以上研究均表明 CASP3等靶点与肺癌的发生发展密切相关，是白头翁治疗肺癌的重要靶标。

GO 生物学过程富集分析证实了白头翁对细胞增殖调节、细胞凋亡过程、调节细胞因子的产生与炎症、类固醇、线粒体膜电位的调节、NF-ΚB 信号和转录激活活性等生物学过程有一定影响，这些生物学过程在白头翁治疗肺癌所涉及的作用靶点及其相关通路都有体现。在 KEGG 富集分析中，筛选得到与肺癌密切相关的信号通路，如癌症通路、肺结核、细胞凋亡、 TNF-α、VEGF、p53和小细胞肺癌等信号通路。研究表明， VEGF 是 HIF-1的调控靶基因之一，VEGF 过表达或高表达在非小细胞肺癌和小细胞肺癌中都有报道，在人小细胞肺癌细胞系中也观察到 VEGF 和磷酸化的 VEGFR2的表达，提示 VEGF 可能通过自分泌机制维持小细胞肺癌的细胞功能[16]。40%～60%的肺癌细胞与肿瘤抑制基因 P53突变有关，这些突变在与烟草相关的肺癌中比在从不吸烟的肺癌中更常见[17]。白头翁在治疗肺癌的机制方面是通过多条通路发挥作用。而且利用分子对接技术对所筛选的关键靶点与活性物质进行模拟结合验证结果的可靠性，所得结合能均较低，具有良好的结合效果，进一步验证了本文所筛选的白头翁治疗肺癌的关键活性物质和核心作用靶点。

综上所述，本研究为中药白头翁的多组分、多靶点协同作用提供了依据，促进了人们对中药多组分、多靶点协同作用的理解。然而，在未来的研究中，还需要进行体内外实验和临床调查，以验证白头翁治疗肺癌的作用机制。

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（收稿日期：2021-10-28）