金银花绿原酸磷脂复合物制备及其透皮性能研究

曾川 何源芳 刘佳伟 王琪 王领

金银花中绿原酸为天然多酚类物质，具有极强的抗氧化活性，能抵御紫外线对人体皮肤的伤害，保护胶原蛋白免受自由基攻击，具有较高的美容开发价值，但由于绿原酸的脂溶性差，不易透过人体角质层，极大地限制了其应用。为更好的利用金银花，发掘金银花绿原酸的新功效及其靶点，为金银花绿原酸的护肤美容提供理论支持和现代科学依据。本研究以无水乙醇为溶剂，利用超声提取法制备金银花绿原酸磷脂复合物，使用离体小鼠皮肤模拟人体皮肤，在 Franz 扩散池进行体外透皮吸收实验，分别测定吸收池溶液的绿原酸含量及绿原酸磷脂复合物含量，比较分析透皮吸收率。结果显示，0-10h 绿原酸溶液体外透皮吸收率大于该复合物，而10h 之后透皮率则明显小于该复合物，表明绿原酸磷脂复合物可以提高绿原酸的生物利用率，为绿原酸后续研究及开发利用提供了新的方向。

关键词：绿原酸；磷脂复合物；体外透皮吸收

金银花（honeysuckle） 又名忍冬花，属忍冬科植物，为干燥花蕾或带初开的花，是中国传统的药用品种，最早在《神农本草经》中就有记载。金银花富含挥发油、萜类、环烯醚萜苷类、三萜皂苷类、黄酮类、有机酸类、无机元素等多种化学成分[1]，具有较高的药用价值。近代对于金银花化学成分的研究以绿原酸为主，绿原酸是金银花中典型的抗氧化功效成分，有着很强的药理活性[2]。药理学研究表明，绿原酸具有抑制葡萄糖-6-磷酸酶活性、降血脂、改善血液流动情况、免疫调节、抗病菌病毒、抗炎等功效[3-6]。在皮肤美容功效方面，绿原酸的活性羟基可以形成具有抗氧化作用的氢自由基，可保护胶原蛋白不受活性氧等自由基伤害，有效防止紫外线对人体皮肤产生的伤害[7，8]，还能抑制酪氨酸酶和过氧化氢酶活性来清除细胞中的活性氧[9]，罗磊等人发现，绿原酸对于 DPPH 有较高的抑制率，抗氧化能力是抗坏血酸近3倍[10-11]。

绿原酸属于多酚类化合物，脂溶性较差，不易透过皮肤角质层或滞留于皮肤表面难以发挥其功效，因此大大影响了绿原酸在化妆品中的实际应用，如果采用脂质体技术将其包埋，将更有利于其透皮吸收而发挥功效。脂质体是药剂学中的一类常规释药系统，常常用作为难溶性药物的给药剂型，来提高其生物利用率。区别于传统脂质体，复合磷脂脂质体是通过与磷脂双分子层进行排列作为外相来形成球型药物载体，包裹着作为内相的活性成分药物，具有更好稳定性，克服了传统脂质体包合率低和药量偏低的问题，更有效的提高活性成分的吸收与利用程度[12-13]。

根据范明辉等[14]人的研究，在脂質体的制备中，胆固醇对脂质体的物化性质影响不大，所以在本次实验中采用了磷脂复合的制备工艺，使用大豆卵磷脂对绿原酸进行包裹，参考赵安权等[15]人的实验方法，采用超声提取的方式进行复合物的制备并利用复合物极易溶于三氯甲烷，而绿原酸不溶于三氯甲烷的特性，将复合物分离。同时，本实验采用了正交试验方法，确定复合率较高的工艺，通过该工艺制备的绿原酸磷脂复合物再经过 Franz 扩散池的体外透皮吸收实验来进行研究，以期提高生物利用率。

1 实验材料与仪器

1.1 实验材料

绿原酸（分析纯），西安首禾生物科技有限公司；无水乙醇，天津大贸化学试剂厂；大豆卵磷脂，日本富士和光株式会社；小鼠，山东中医药大学；三氯甲烷（分析纯），天津市科密欧化学试剂有限公司；生理盐水（注射级） 上海长征富民药业有限公司。

1.2仪器

SK5200H 高频超声波清洗仪，上海科导超声仪器有限公司； SHZ- DIII 循环水式多用真空泵，海互佳仪器设备有限公司；Franz 扩散池，上海玉研科学仪器有限公司；佑科 UV1810S 紫外可见分光光度计，上海精学科学仪器有限公司；上海亚荣 RE-5220旋转蒸发器，上海垒固仪器有限公司；德国 IKA 艾卡 EUROSTAR 20顶置式搅拌器，艾卡（广州）仪器设备有限公司；DHP-9082BS-Ⅲ电热恒温培养箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；德国 IKA 艾卡 T25/T18 digital 数显分散机，艾卡（广州）仪器设备有限公司；AB265-S/FACT 型电子天平，上海梅特勒托利多仪器有限公司；上海卢湘仪 TG16-WS 台式高速离心机，上海坤权生物科技有限公司。

0 2 实验方法

2.1 绿原酸磷脂复合物制备

将一定量的大豆卵磷脂溶于300mL 无水乙醇之中，常温搅拌1h，v=450r/min。搅拌溶解之后用滤饼抽滤除去不溶物，收集滤液放入烧杯备用。烧杯中加入1.0g 绿原酸，超声提取后得到绿原酸、大豆卵磷脂和绿原酸磷脂复合物混合物。将所得溶液加入圆底烧瓶进行减压旋蒸，除去全部乙醇。加入三氯甲烷溶解混合物，反复洗涤三次用滤纸过滤除去绿原酸。再次减压浓缩除去溶剂，放入恒温箱中继续挥发剩余三氯甲烷即得绿原酸磷脂复合物。

2.2标准曲线测定

精密称量绿原酸0.0150g，加入无水乙醇溶解后转移至250mL 容量瓶中，并加入无水乙醇定容至刻度线，摇晃均匀得到0.06mg/mL 绿原酸溶液。分别精密取出绿原酸溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL 加入25mL 量筒中，加入无水乙醇至20mL 刻度线后摇晃均匀，分别得到浓度为0.003mg/mL、0.006mg/mL 、0.009mg/mL、0.012mg/ mL、0.015mg/mL 绿原酸溶液。分别于330nm 处测量吸光度，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归，作得标准曲线。

2.3复合率计算

精密称量实验所得复合物0.1000g，加入50mL 乙醇溶解，以250mL 容量瓶定容，震荡均匀后精密量取1.00mL 加入烧杯中，再加入50mL 去离子水进行充分均质，均质条件为8000r/min，t=10min，吸取溶液3mL 进行离心，离心条件为4000r/min，t=30min，强制分离绿原酸和卵磷脂。后取下清液于330nm 处测量吸光度，带入标准曲线计算即得复合率。

2.4单因素考察

2.4.1反应物质量浓度的影响

以无水乙醇为反应溶剂、绿原酸与磷脂投料比为1∶1、反应温度20℃、反应时间2h，使用4.0、6.0、8.0、10mg/ mL 的绿原酸乳液进行磷脂复合物制备，得到不同绿原酸浓度下的复合率，考察绿原酸浓度对复合率的影响。

2.4.2投料比的影响

以无水乙醇为反应溶剂、反应温度20℃、反应时间2h、绿原酸8mg/mL，使用投料比为1∶0.8、1∶1、1∶2、1∶3的绿原酸与磷脂进行磷脂复合物制备，得到不同投料比下的复合率，考察绿原酸与磷脂的投料比对复合率的影响。

2.4.3反应时间的影响

以无水乙醇为反应溶剂、绿原酸与磷脂投料比为1∶1、反应温度20℃、绿原酸8mg/mL，反应1、1.5、2、3 h 后，得到不同反应时间下的复合率，考察反应时间对复合率的影响。

2.4.4反应温度的影响

以无水乙醇为反应溶剂、绿原酸与磷脂投料比为1∶1、反应时间2h、绿原酸8mg/mL，在20、30、40、50℃时进行磷脂复合物制备，得到不同反应温度下的复合率，考察反应温度对复合率的影响。

2.5正交试验

根据单因素考察的实验结果以反应物的质量浓度（A）、投料比（B）、反应时间（C）和反应温度（D）为影响因素。以复合率为指标，每个因素取3个水平，采用 L9（34）表进行正交试验进一步优化这4个因素的最佳水平。

2.6皮肤样品处理

用脱毛膏脱去小鼠腹部毛发后，脱颈致死，快速剥离腹部皮肤，取适宜大小鼠皮，小心剔除皮下脂肪，以生理盐水反复浸泡冲洗至干净无粘连物，并用滤纸吸干小鼠皮肤表面的生理盐水，将清洗之后的小鼠皮肤切成1cm×1cm 小片，浸泡于生理盐水中并放置于冰箱备用。

2.7体外透皮吸收实验

分别以无水乙醇配置浓度为0.1mg/mL 绿原酸溶液和磷脂复合物（以绿原酸计） 溶液备用。样品池注水并排除气泡，调整实验条件，保持接收池内温度为37.0℃。扩散池注满生理盐水，设置磁子搅拌转速为200r/min。取两块小鼠皮分别固定于样品池与接收池之间，角质层面向样品池。对照组加入绿原酸溶液，实验组加入复合物溶液，分别于0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、5h、6h、10h、20h、24h 吸取反应溶液1mL，后用生理盐水补足至刻度线。将吸取溶液稀釋5倍后测量吸光度。按照下式计算透过率。

（μg ·mL-1）；Ci 为第i （i≤ n －1）个取样点测得的药物质

量浓度（μg ·mL-1）；A 为扩散池的有效透皮渗透面积；V 为接收液体积；Vi 为取样体积。

3 结果与讨论

3.1标准曲线

以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归后，得到回归线性方程 y=62.83x+0.0009（R2=0.9991），结果显示，绿原酸0.003～0.015mg/mL 与吸光度呈良好线性关系。

3.2复合率

3.2.1绿原酸浓度对复合率的影响

绿原酸为4.0、6.0、8.0、10mg/mL 时，复合率分别为73.8％、79.3%、86.2%、82%（ n=3），复合率随着绿原酸浓度的增加而提高，但当绿原酸浓度大于8mg/mL 时，随着绿原酸浓度的增加，复合率却有所下降，因此绿原酸浓度不宜过高。

3.2.2绿原酸与磷脂的投料比对复合率的影响

绿原酸与磷脂的投料比为1：0.8、1：1、1：2、1：3时的复合率分别为71.3%、86.4%、74.8%、73%（ n =3）;在投药比为1∶1时，复合率达到最高。

3.2.3反应时间的影响

反应1、1.5、2、3 h 后，复合率分别为77%、81.1%、85%、85.8%（ n =3）。随反应时间的延长，复合率提高，但是在2h 后复合率的提高并不明显。

3.2.4反应温度对复合率的影响

20、30、40、50℃时绿原酸与磷脂的复合率分别为87.5%、86.4%、83.5%、78.5%（ n =3），随着反应温度的升高，复合率逐渐下降，可能是由于绿原酸对热不稳定。

3.3正交试验

根据极差分析可知，表明各因素对综合指标影响大小为 B ＞ D ＞A ＞ C，即投料比影响最大，其次是反应温度，再次是反应物质量浓度，最后是反应时间。以 A3B1C2D1为最佳，最终确定工艺为绿原酸和磷脂投料比为1：1，反应温度为20℃，反应时间为2h，反应物质量浓度为8mg/mL。

采用最佳工艺进行验证试验，重复3次，结果见表3。验证试验与正交试验的结果一致，所得复合物的复合率不低于84.5%，说明此优化工艺稳定可行。

3.4体外透皮吸收

实验数据显示，大约在10h 之前，绿原酸磷脂复合物的透皮率低于绿原酸溶液的透皮率，而在10h 之后绿原酸的透皮率则显著小于其复合物。这可能是由于绿原酸的分子量较小，而复合物的分子量较大，而且和皮肤亲和力较好，所以减缓了复合物的释放，因此前期绿原酸溶液透皮率更高。而10h 之后，复合物透过速率明显高于绿原酸溶液，可能是因为皮肤开始释放复合物，故速率增大。同时，随着时间的增长，绿原酸溶液的透过速率有所减慢，可能是小鼠皮对于绿原酸的吸收方式主要通过渗透压进行，随着压差的降低，透过速率减慢，而透过速率减慢导致渗透的溶液比用来测量时吸取的溶液少，所以20h 后体外透皮吸收浓度下降。

鉴于绿原酸溶液与绿原酸磷脂复合物在透皮吸收时间上的差异性，在护肤品领域应用中，可充分利用时间差异性对配方进行调整，采用合适的添加比例，最大程度的发挥绿原酸溶液和绿原酸磷脂复合物在抗菌抗氧化、清除自由基、抗衰老方面的协同作用。

4 结论

本实验采用超声提取的方式制备了绿原酸和卵磷得到了复合率较高的磷脂复合制备工艺，再经过体外透皮吸收实验进行研究。研究结果表明，0～10h 绿原酸溶液体外透皮吸收率大于该复合物，而10h 之后透皮率则明显小于该复合物，绿原酸的脂溶性得到了显著提高。以磷脂复合物为载体能增强绿原酸的透皮率，可以提高绿原酸的生物利用度，为绿原酸进一步的开发利用提供了更多的可能性。

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