食品中恩诺沙星残留检测方法研究进展

靳雨婷，陈金嫒，任涛涛，汤轶伟,*，王向红，王 硕,3,*

（1.渤海大学食品科学与工程学院，辽宁 锦州 121013；2.河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001；3.南开大学医学院，天津市食品科学与健康重点实验室，天津 300071）

恩诺沙星（enrofloxacin，ENR）是我国第一个食品动物专用氟喹诺酮类药物，其结构式如图1所示，该药物可通过结合回旋酶亚基阻断细菌DNA解链、切割与连接过程，从而实现抑菌和杀菌目的[1-2]。由于该药物具有高效低毒、抗菌谱广、耐药交叉性小、价格低廉等优点，被广泛用于畜禽及水产养殖过程[3]。然而，长期、不规范或过量药物使用造成食品和环境中ENR残留量不断增加，严重损害了生态环境和人类健康[4-5]。鉴于ENR药物的潜在危害，我国制定了其在食品中的最大残留限量（maximum residue limit，MRL）标准，规定动物肌肉、脂肪及奶中ENR的MRL为100 μg/kg，牛、羊肝脏和家禽肾脏中ENR的MRL为300 μg/kg[6]。

图1 ENR结构式Fig. 1 Structural formula of enrofloxacin

准确、便捷、稳定的检测方法是食品质量安全的技术保障，综述和分析近年国内外食品中ENR药物残留最新检测方法研究进展具有重要意义。本文将从样品前处理和食品中ENR残留检测方法两方面进行阐述。

1 样品前处理方法

样品前处理包括样品制备、目标物提取、净化以及富集，是整个分析技术中的关键步骤，决定着检测方法的准确度、灵敏度和稳定性。

1.1 样品制备

动物肌肉组织、脏器、水产品（去鳞、去皮或去壳）可食肌肉等样品测定前需解冻、剪碎，经组织匀浆机匀浆处理[7-8]；牛奶、奶粉等流体或粉末状态样品可直接进行目标物提取[9]。

1.2 提取、净化和浓缩富集

ENR分子中含有羧基和哌嗪基结构，易溶于酸性或碱性溶液。所以，食品样品中ENR的提取溶剂多选用酸化乙腈或碱性乙腈。为提高目标物的提取效率，杨金易等[10]以酸化乙腈为提取溶剂，分别研究了涡旋振荡、摇床振荡和超声辅助提取方式对水产品中ENR提取效率的影响，结果显示3种提取方式中涡旋振荡提取效率最高，回收率为84.21%～91.07%。基质效应是影响分析结果准确性的关键因素，消除基质影响是检测过程中的重要环节[11]。国家标准（农业部783号公告-2-2006）对水产品ENR等残留药物检测中的基质消除方法主要为液-液萃取法，通过目标物与干扰物质的溶解度不同而实现[7]。目前，国家标准中样品的ENR残留提取、净化和富集方法溶剂用量大、过程繁琐。固相萃取技术是基质影响消除的常用方法，该方法操作简便、快速、高效，回收率优于国家标准中液液萃取净化方法[12]。李慧芳等[12]研究了C18材料、N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附材料和氨基（－NH2）吸附材料在分散萃取中对鱼肉样品ENR等喹诺酮类药物残留吸附作用和净化能力的影响，结果表明C18和PSA材料都具有较好的基质净化效果，但C18对目标物的吸附作用会影响加标回收率结果。

新型吸附材料制备技术的发展为食品中ENR残留的提取和净化提供了新的选择。Li Zhaoqian等[13]合成了磁性金属有机骨架/氧化石墨烯复合材料Fe3O4/MIL-100(Fe)/GO，用于牛奶样品中ENR残留的提取和净化，首先样品经乙腈提取目标物，用正己烷去除脂肪，再以合成的Fe3O4/MIL-100(Fe)/GO为吸附材料通过磁性分散萃取方法吸附提取液中的目标物，然后用含有15%甲酸的甲醇溶液洗脱吸附的ENR用于荧光分析。分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers，MIPs）是对目标物具有特异吸附能力的高分子化合物，已广泛用于样品前处理。Wang Xiaoxiao等[14]以ENR为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体制备了ENR分子印迹聚合物，并建立了提取牛奶中ENR残留的固相萃取方法，最优条件下方法的加标回收率为94.6%～109.6%，与C18固相萃取柱相比，样品的加标回收率显著提高。表1为食品中ENR残留的提取净化方法。

表1 食品中ENR残留提取净化方法Table 1 Methods for extraction and purification of enrofloxacin residues in food samples

2 检测方法

HPLC、色谱-质谱联用、毛细管电泳、免疫分析、荧光光谱等分析方法在ENR检测中的应用已有报道[15-16]。近年来，新型功能材料的应用和检测方法的创新大大丰富了食品中ENR残留的检测技术，提高了分析方法的灵敏度、便捷度或检测速度。

2.1 荧光检测法

碳基荧光材料具有制备简单、毒性低、荧光信号稳定、生物兼容性好、易修饰等优点，是近些年新兴的荧光材料[17]。Guo Xingjia等[18]以苹果酸和甘氨酸为原料制备了表面富含羧基和氨基的碳量子点，研究显示该量子点荧光可被Cu2＋以电子转移方式猝灭，当检测系统中含有ENR时，Cu2＋从碳量子点上脱离，然后与ENR结合，体系荧光得到恢复，基于该原理建立了ENR检测方法，最优条件下该方法的线性范围为1.0～15.0 μg/mL，最低检出限（limit of detection，LOD）为0.16 μg/mL。氧化石墨烯是石墨烯的一种重要衍生物，能高效猝灭ENR、荧光染料、荧光纳米颗粒等材料的荧光（图2）。Dolati等[19]利用氧化石墨烯的广谱荧光淬灭特性和筛选出的ENR特异性核酸适配体，建立了牛奶中ENR残留的荧光检测方法，最优条件下该检测方法的线性范围为5～250 nmol/L、LOD为3.7 nmol/L、加标回收率为94.1%～108.5%，该方法简单、经济，适合现场牛奶样品中药物残留检测。

图2 基于氧化石墨烯和核酸适配体的ENR检测示意图Fig. 2 Schematic representation of the sensing mechanism of graphene oxide and aptamer-based label-free assay for ENR detection

上转换荧光纳米材料具有反斯托克斯（Stocks）发光特性，其发射光谱窄、荧光寿命长、基质干扰小，是当前荧光检测领域研究的热点[20]。Liu Xiuying等[21]以核酸适配体修饰磁性纳米材料，互补核酸链修饰上转换荧光纳米材料构建了杂交型ENR检测荧光探针，并建立了鱼样中ENR残留检测方法，结果显示样品的加标回收率为85.1%～98.5%、LOD为0.06 ng/mL，该方法简单、快速、灵敏、抗基质干扰能力强。为了提高ENR分子印迹上转换荧光探针的特异性，Liu Xiuying等[22]首先将核酸适配体偶联于上转换纳米材料表面，再加入目标物ENR，待ENR与核酸适配体结合后再以甲基丙烯酸为功能单体在材料表面合成分子印迹膜，制备上转换荧光探针。该荧光探针中甲基丙烯酸和核酸适配体的双识别位点提高了探针的选择性，检测结果显示鱼样中ENR加标回收率为87.05%～96.24%、LOD为0.04 ng/mL。Tang Yiwei等[23]以上转换纳米材料的内荧光为引发能量构建了核壳可控型分子印迹上转换荧光探针，通过控制聚合时间实现了探针分子印迹壳厚度的控制，该探针对ENR等喹诺酮类药物具有广谱识别特性，对ENR检测的线性范围为1.03 nmol/L～0.28 μmol/L。

镧系离子可与多种抗菌类化合物形成螯合物，分子内能量从有机配体的三重态转移到镧系离子，使荧光强度显著增强，这种镧系敏化的荧光检测方法已用于食品安全检测。Ershadi等[24]在铽敏化荧光基础上，利用Ag纳米离子再次放大体系荧光信号建立了牛奶中ENR残留的快速检测方法，最优条件下该方法的线性范围为0.05～0.60 mg/L、LOD为0.021 mg/L。

Accublue是一种荧光染料，游离或与单链DNA共存时，荧光强度弱，与双链DNA共存时，其荧光信号显著增强[25]。刘若冰等[26]利用Accublue的这种特性与ENR核酸适配体及其互补链建立了ENR荧光检测方法，最优条件下该方法的检测线性范围为20～1 000 μg/L、LOD为9.96 μg/L，对奶粉、虾肉和牛肉样品检测的加标添加回收率为76.54%～98.79%。

比率荧光传感检测方法具有自校准特性，可有效消除由于光源波动、探针浓度改变及环境变化对检测结果带来的影响，提高检测方法的稳定性。Wang Zhongxia等[27]以三聚氰胺为原料，通过水热反应制备了碳荧光纳米探针，研究发现该探针的最大荧光发射波长为290 nm，恰是目标物ENR的荧光激发波长。基于内滤效应，ENR可有效猝灭该荧光探针的荧光（290 nm），同时又可发射荧光（412 nm），在此基础上建立了比率荧光（FL412nm/FL290nm）检测牛奶中ENR残留的标准曲线，线性范围为0.05～200.00 μmol/L、LOD为22.43 nmol/L。实际牛奶样品只需过膜（0.45 μm）、离心，取上清液用Tris-HNO3缓冲液稀释后即可检测。

荧光分析是一种灵敏度高、所用设备简单的分析方法。适配体、MIPs、上转换荧光纳米材料的应用以及比率荧光检测方法的建立改善了传统荧光分析方法在复杂食品样品中对ENR检测的特异性、选择性或稳定性。

2.2 表面增强拉曼散射光谱法

表面增强拉曼散射技术（surface enhancement of Raman scattering，SERS）是目前食品潜在危害物超痕量检测研究的热点。Li Hongji等[28]通过抽吸过滤法将制备的粗糙Ag颗粒固定于聚偏二氟乙烯薄膜表面，该Ag-SERS传感膜对ENR盐酸盐具有超灵敏度，最佳检测条件下建立的SERS检测方法对目标物检测的线性范围为1～200 nmol/L、LOD为0.01 nmol/L。Ag-SERS传感膜的构建及SERS检测方法的建立为食品中痕量ENR残留的痕量检测奠定了基础。Chen Jie等[29]以纳米纤维素纤维多孔膜（nanocellulose fibers，NCF）为模板制备了Ag-NCF基质膜，Ag纳米粒子原位生长于纤维素交叉处形成敏感银团簇提供高密度“热点”，使电磁场显著增强，制备的Ag-NCF基质膜对食品中潜在危害物具有灵敏的SERS检测信号，ENR检测的LOD为0.069 mg/kg，制备的Ag-NCF膜可用于鱼样中ENR残留的原位检测，检出量可达1 mg/kg，该膜的制备为食品中抗生素残留的现场快速SERS检测提供了新型信号增强基底材料。

基底信号放大材料制备技术和新材料的开发提高了SERS检测方法灵敏度，也为实现食品中ENR残留原位检测奠定了基础。

2.3 微生物检测法

基于抗生素对微生物生长、代谢及其他生理机能抑制建立的微生物检测法是食品中抗生素残留测定的常用方法[30]。Tumini等[31]以地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisATCC14580）为指示微生物，以三苯基四唑和甲苯胺蓝为氧化还原指示剂，选择550 nm为检测波长，直接在微孔酶标板中建立了牛奶中ENR残留检测方法，结果显示该方法的反应时间为5.5 h，牛奶样品的LOD为109 μg/L。葡萄糖是细菌生长需要的重要能量源之一，其浓度与体系中微生物的数量和生长速率密切相关。Kwon等[32]将牛奶样品与含有大肠杆菌（E. coliATCC 11303）和葡萄糖的LB培养基混合培养，通过血糖仪测定细菌代谢消耗的葡萄糖浓度，样品中抗生素ENR含量越多，葡萄糖的消耗量越低，结果表明该方法的LOD为5 ng/mL、测定时间为2 h，用葡萄糖试纸进行高通量筛选时，可通过肉眼定性分析葡萄糖浓度的变化。图3A为基于血糖仪和葡萄糖试纸检测ENR残留示意图。

Lee等[33]以大肠杆菌（Escherichia coliATCC 11303）为指示微生物，基于样品中抗生素含量与细菌呼吸产生CO2量（通过毛细管中红墨水上升的高度显示CO2的产生量）的关系建立了牛奶中ENR残留检测方法，该方法操作简单，不需要分析仪器，最优条件下该方法的LOD为10 ng/mL、反应时间为2 h。图3B为基于CO2产生量检测ENR方法示意图。

基于微生物的ENR残留检测方法操作简单，不需要复杂的分析仪器，但该方法的灵敏度、选择性、精密度相对较低，适合食品中ENR等抗生素残留的广谱筛查监测。

图3 基于血糖仪和葡萄糖试纸检测ENR残留示意图（A）和基于CO2产生量检测ENR方法示意图（B）Fig. 3 Schematic diagram of enrofloxacin detection using a personal glucose meter with glucose test strips (A) and schematic diagram of the enrofloxacin detection method based on CO2 production during Escherichia coli respiration (B)

2.4 电化学分析法

电化学分析法通常以电极或以抗体、适配体、酶、分子印迹聚合物等生物分子或高分子聚合物为分子识别元件修饰的电极为基础，通过测定电阻、电位、电流等信号变化实现对待测物的定量分析[34]。Liu Yuting等[35]通过将CdS纳米颗粒修饰于电极表面，该修饰显著增大了电极的表面积、提高了电子传输速率、缩短了响应时间，最优条件下该电极对ENR检测的LOD为9.5h10－8mol/L，检测时间小于40 s。

共价有机骨架（covalent organic frameworks，COFs）是一种新型晶体多孔材料，具有表面积大、孔穴结构规则、机械稳定性强、易于修饰等特点，是目前电化学传感器研究的热点[36]。Wang Minghua等[37]以1,3,6,8-4(4-甲酰基苯基)芘与三聚氰胺为原料通过缩合聚合反应制备了COFs，然后将该骨架修饰于Au电极表面，再通过π-π堆积作用和静电吸附作用偶联ENR核酸适配体，结果显示，基于该电极建立的电化学检测方法对ENR具有超高的灵敏度、宽的线性范围（0.01～2 000.00 pg/mL）和极低的检出限（6.07 fg/mL），适合食品中超痕量ENR残留的快速检测分析。Song Yingpan等[38]基于CoNi和2,3,6,7,10,11-六氨基三苯合成金属有机骨架（metalorganic frameworks，MOFs），该MOFs具有类似石墨烯的二维片状结构，在水溶液中稳定、电化学活性好，修饰于电极后偶联核酸适配体，建立的电化学检测方法对ENR检测的线性范围为0.001～1.000 pg/mL、LOD为0.2 fg/mL，实验中构建的MOFs电极稳定性、选择性、重现性较好。

硼掺杂金刚石电极（boron-doped diamond，BDD）是一种新型电极，具有电化学势窗宽、析氧过电位高、耐腐蚀等优点，在电化学传感器具有良好的应用前景[39]。Donmez等[40]以BDD为工作电极，在表面活性剂十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）（0.9 μmol/L）信号增敏作用下建立了ENR电化学检测方法，最优条件下，响应信号与ENR浓度在0.025～1.000 μg/mL之间呈线性关系，LOD为0.005 7 μg/mL。

用CdS、COFs、MOFs等材料修饰电极，通过增加电极表面积、提高电子传输速率可显著增加电化学检测方法的灵敏度；在电极表面修饰分子识别元件酸适配体可提高检测方法的特异性和选择性。

2.5 免疫分析法

酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）操作简单、高效快速，是食品安全快速筛查检测的常用方法之一。为提高ELISA检测生牛乳中ENR残留的灵敏度，Hu Song等[41]使用分子描述符辅助筛选出适合用于检测的异源竞争吸附抗原，结果显示以沙氟沙星-牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）为包被原，以酶标二抗为探针建立的ELISA方法对牛奶中ENR残留检测的灵敏度是ENR-BSA为包被原的6 倍，该研究通过分析包被原表位的静电电位分布解释了吡哌酸-BAS、达氟沙星-BSA、普卢利沙星-BSA、培氟沙星-BSA等包被原与单克隆抗体识别的机制，为ELISA方法中异源包被原的选择提供了理论基础。

荧光偏振免疫分析方法（fluorescence polarization immunoassay，FPIA）是利用荧光偏振原理，基于与抗体竞争吸附机制建立的检测小分子物质检测方法，具有检测成本低、速度快、高通量等优点[42]。Shen Xing等[43]以ENR偶联荧光素硫代氨基甲酰己二胺为示踪探针，与目标物ENR竞争吸附多克隆抗体，检测体系中荧光偏振强度与目标物浓度呈负相关关系，最优条件下该FPIA对ENR检测的半抑制浓度（half-maximal inhibition concentration，IC50）为21.49 μg/kg，最低检测限为1.68 μg/kg，猪肝和鸡肉样品的加标回收率为91.3%～112.9%，检测时间为8 min。

以荧光材料代替胶体金构建免疫层析试纸，建立荧光免疫层析检测方法可以大大提高胶体金试纸检测的灵敏度和稳定性。Sheng Wei等[44]以ZnCdSe/ZnS量子点标记抗体为荧光探针、以ENR-卵清白蛋白（ovalbumin，OVA）为包被原固定于硝酸纤维素（nitrocellulose filter，NC）膜为检测线（test line，T）线、以羊抗兔二抗固定于NC膜为控制线（control line，C）线构建了ENR荧光免疫层析试纸，目标物ENR与T线的ENR-OVA竞争结合量子点标记抗体，样品中ENR浓度越高，结合到T线的量子点标记抗体越少，T线荧光强度越低，最优条件下该试纸对动物组织中ENR残留的目测临界含量为5 μg/kg，对牛奶中ENR残留的目测临界质量浓度为10 μg/L，该试纸条可在20 min内得出检测结果，适合食品安全现场快速检测。Li Shijie等[45]基于荧光能量共振转移原理设计构建了荧光猝灭免疫层析试纸条，试纸条以荧光量子点-OVA偶联物（荧光供体）固定于C线、以ENR-OVA和荧光量子点-OVA的混合物固定于T线、以纳米金-抗体偶联物为荧光受体，荧光受体首先与样品提取液混合孵育，然后在毛细管作用下依次流经T线和C线，当提取液中不含ENR时，纳米金-抗体偶联物与T线处的ENR-OVA结合，量子点与纳米金-抗体间发生荧光能量共振转移使荧光猝灭，当样品中ENR含量足够多时，T线荧光强度增强到与C线荧光强度相同，最优条件下该试纸条对牛奶ENR残留检测的目测临界浓度为2.5 μg/kg。

李诗洁等[46]将偶联ENR抗体的琼脂糖凝胶装入固相萃取小柱制成免疫亲和凝胶检测柱，以ENR-OVA-量子点偶联物为竞争荧光探针，基于ENR、荧光探针与抗体的竞争结合反应建立了免疫亲和凝胶柱快速检测新方法，该方法可通过目测检测柱的荧光强弱定性和半定量检测食品中ENR残留，最优条件下该检测柱对鸡牛肉、羊肉、猪肝、三文鱼、虾等动物源食品中ENR残留的检测限为20 μg/kg。与仪器方法相比，免疫亲和凝胶柱检测方法操作简便、检测时间短、结果易判断，在食品ENR残留监测筛选工作中有较广的应用前景。

基于DNA重组技术和蛋白质工程技术发展的基因工程抗体制备周期短，可定向改造抗体，使之更符合免疫分析检测法的需求。Leivo等[47]利用寡核苷酸靶向随机诱变技术获得了对喹诺酮类药物具有高亲和力和特异性的广谱抗体，开发了时间分辨荧光免疫分析方法，该方法可从全乳样品中检测ENR、二氟沙星、沙氟沙星、环丙沙星、达氟沙星、诺氟沙星、氟甲喹、马波沙星8种氟喹诺酮类药物残留，有效地缩短检测时间。

MIPs具有类似生物抗体的特异性且制备简单、耐有机溶剂、可重复使用，是生物抗体的理想替代材料。Wang Jing等[48]以ENR为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂、甲醇-二甲基甲酰胺混合溶剂为致孔剂，直接在96 孔酶标板中合成分子印迹膜并建立了直接竞争ELISA检测ENR方法，该方法的LOD为1.1 ng/mL，灵敏度（IC50）为85.7 ng/mL。吕春晖等[49]采用同样方法，以甲醇-甲苯混合溶剂为致孔剂制备了ENR分子印迹膜并建立了ELISA检测ENR方法。分子印迹仿生ELISA检测方法的准确度、精密度及特异性能满足检测要求，与传统ELISA方法相比省时经济，可以应用于实际样品中ENR残留的快速检测。

与传统酶标记、胶体金标记免疫分析方法相比，荧光免疫分析方法灵敏度高、抗基质干扰能力强、稳定性好，将是未来几年免疫分析检测研究的热点，基因重组抗体可定向改造抗体性能，应用范围更广。用MIPs膜代替生物抗体建立仿生ELISA方法是ENR残留检测方法的创新探索，具有较广的应用前景。

2.6 石英晶体微天平检测方法

石英晶体微天平（quartz crystal microbalance，QCM）是一种基于石英集体压电效应的高灵敏质量检测仪器，具有检测简单、快速、高精度等优点[50]。Pan Mingfei等[51]以ENR为模板分子、3-氨丙基三乙氧基硅烷为功能单体、四乙氧基硅烷为交联剂、N,N-二甲基甲酰胺为致孔剂，热引发聚合制备了ENR分子印迹聚合物，然后将该印迹聚合物修饰于Au电极表面构建QCM压电传感器，最优条件下该传感器对动物源食品中ENR残留具有较低的检出限（牛奶为0.31 μg/L、鸡蛋为0.44 μg/kg、鸡肉为0.54 μg/kg、猪肉为0.57 μg/kg），该传感器至少可重复使用30 次。

3 结 语

ENR抗菌药物在畜禽及水产养殖过程中的广泛应用大大增加了环境污染和食品安全的风险水平。复杂的食品基质使样品前处理技术的改良势在必行，严格的兽药残留限量标准对检测技术提出了更高的要求。与国家标准相比，吸附材料Oasis HLB、C18、PSA、Fe3O4/MIL-100(Fe)/GO和MIPs在样品前处理中的应用显著提高了食品中ENR残留的提取效率，缩短了样品前处理时间。新型功能材料（量子点、上转换纳米荧光材料、MIPs、MOFs等）在荧光检测方法、电化学检测方法、免疫分析方法、表面增强拉曼散射光谱法中的应用大大提高了原有检测方法的灵敏度、稳定性或精密度。QCM检测和基于微生物的新型检测方法建立丰富了我国食品安全检测方法，为食品中ENR残留检测提供了新的技术支持。

食品中ENR残留检测取得了一定进展，但依然不能完全满足当下食品行业或市场监管检测需求。因此，食品中ENR检测方法的研究可在以下几个方面突破：1）制备高特异性ENR吸附材料用于样品前处理，提高样品前处理过程的自动化程度，建立标准化前处理方法，提高检测方法稳定性；2）利用光谱检测，结合数据处理和图像分析技术，开发ENR残留原位无损快速检测技术；3）研发基于荧光比色的可视化、便携化、小型化、智能化检测平台，为现场快速检测ENR开拓前景；4）创新MIPs合成方法，提高批次间ENR分子印迹仿生抗体的稳定性和重现性，建立化学发光、荧光等新型仿生免疫分析方法。

开展食品中ENR残留的快速、简便、灵敏的检测技术成为提高食品品质的重要手段，只有不断改进和完善样品前处理级检测技术，才能确保消费者健康和动物源食品安全。