鞣花酸和尿石素类代谢产物的生物活性及其对肠道健康的作用研究进展

肖玉欣，王 楠，王 婧，谭碧娥

（湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128）

鞣花酸（ellagicacid，EA）是广泛分布于石榴、草莓及覆盆子等水果或坚果中的天然多酚类抗氧化剂，可由鞣花单宁（ellagitannin，ET）进入体内后水解生成。越来越多的动物模型和人类临床试验证明，ET和EA具有抗炎、抗氧化、抗癌及调节肠道菌群的生理活性，对慢性疾病的发生发展具有潜在的预防、治疗作用[1-3]。但ET和EA在肠道中不易被吸收，生物利用度低，部分未被吸收的EA则在动物和人体肠道内代谢生成尿石素（urolithin，Uro）A、异尿石素（isourolithin，isoUro）A和Uro B等更易吸收的尿石素类物质。因此，有报道认为尿石素可能是ET和EA在体内发挥生物活性的物质基础[4]。近年来，尿石素的结构特征、理化性质和生物活性等也日渐受到国内外的广泛关注。EA及其代谢产物尿石素的生物活性与其抗氧化能力和微生物调节作用密切相关。本文主要讨论EA及尿石素的代谢途径、生理活性和机制，及其在肠道疾病研究中的应用。

1 EA的来源、提取方式及结构特征

1.1 EA的来源

EA主要以游离单体、衍生物和复合ET形式存在于多种植物的液泡中，如石榴、蓝莓、树莓、草莓、胡桃等水果及坚果[5]。ET和EA属于一类具有生物活性的多酚化合物，其中ET是可水解单宁类多酚，可被酸或碱水解后释放六羟基二苯酸，六羟基二苯酸可自发形成内酯从而生成EA[6]。不同种类的植物中，ET和EA的含量及种类存在差别。石榴中含有丰富的安石榴苷，草莓、树莓和圆叶葡萄中有较高含量的地榆素H6和游离EA，核桃中主要含有花梗鞣素、缬草酸双内酯和大麻黄素[7]。据研究人员统计，在蔷薇科浆果中，游离EA占总EA含量的40%～50%，总EA含量范围为47 mg/g（以红树莓鲜质量计）～90 mg/g（以黑树莓鲜质量计），总ET的含量范围为0.65 mg/g（以草莓鲜质量计）～3.90 mg/g（以北极树莓鲜质量计）；在圆叶葡萄中，游离EA含量为49.1 mg/kg，总EA含量为86.9 mg/kg；在坚果中，核桃的EA总含量约为0.33～0.59 mg/g；而在其他水果或坚果中（如苹果、脐橙、葡萄柚、梨、桃、猕猴桃、花生和腰果等），EA的含量低于高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）系统的检测阈值[8]。不同植物来源EA间的活性差异鲜见报道。

1.2 EA的结构特征

EA分子式为C14H6O8，含有2 个内酯基团和4 个羟基基团（图1），这使EA在不同条件下均可发挥重要的抗氧化活性[9]。EA及其衍生物的抗氧化效率与它们的羟基化程度直接相关，并随着糖基的存在而降低[10]。EA难溶于水，可溶于甲醇、乙醇、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等有机溶剂，与三氯化铁的显色反应呈蓝色，遇硫酸呈黄色。

图1 EA结构Fig. 1 Structure of ellagic acid

1.3 EA的提取方式

EA可从水果果实、果汁、果皮和籽中提取。在树莓、草莓等浆果类水果籽中EA含量为6.7～32.0 mg/g（以鲜质量计），占总EA含量的80%[11]。科学家们常利用富含EA的果汁、果皮粉末或籽油作为营养添加剂研究其对人体与动物的生物活性。根据植物的提取部位不同，EA的活性可能存在差异。有研究表明，与石榴汁相比，石榴皮粉末提取物表现出更强的抗氧化和抗菌能力[12]。此外，研究人员将石榴汁与其等量的纯化EA进行比较，发现石榴汁较纯化的EA具有更高的生物利用度和生物活性，但在尿石素产物含量、血脂水平、和炎性因子表达等生理活性上的差异并不明显[13]。

通过精进提取方法提高天然植物提取物中EA等活性物质的含量是降低加工成本、减少生物废弃物和环境污染的有效途径。不同的提取方法可影响植物中EA的提取效率。有研究表明，140 ℃种子焙烧15 min可提高冷榨树莓、草莓和樱桃籽油中EA的含量[14]。由于EA难溶于水，其提取溶剂多为丙酮和甲醇等有机溶剂。Panichayupakaranant等[15]利用10%甲醇、乙酸乙酯和2%醋酸水溶液将石榴皮中EA的提取效率从7.06%提高至13.63%，并发现石榴皮EA干粉较其水溶液更稳定。Markom等[16]比较了不同提取溶剂类型和提取方法对提取珠子草中EA的影响，结果发现在一定温度下，水-乙醇溶剂萃取法提取EA的效果最好，且EA含量随水含量的增加而增加；而加压水提取法可在最短时间内提取出最大量的EA，并表明两种溶剂提取方式中助溶剂混合物的选择以及温度时间等参数仍需进一步优化[16]。然而，有机溶剂提取法耗能高、污染环境且提取效率低，因此，环保、高效率的提取方式亟待开发。近期，An Juanyan等[17]利用反溶剂沉淀法优化低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DES），将板栗皮中EA的回收率提高至94.4%，且提取纯度较乙醇提取法提高2 倍以上，高达85.6%；同时，证实了优化的DES提取法回收的EA具有较高的抗氧化活性和抑菌活性[17]，DES法还可显著提高草莓和树莓残渣中EA的提取与回收效率[18]。因此，DES可作为一种绿色、高效的提取和回收EA等高价值酚类化合物的方法。

2 EA的代谢

人体摄入180 mL石榴汁1 h后，血液中EA的浓度达到最大值（0.1 μmol/L），随后在4 h内快速消除[4]。ET难以被胃肠道直接吸收，其在小肠微生物或生理pH值的作用下水解释放EA，游离的EA可在小肠被吸收[4]。EA在肠道上皮细胞的转运载体尚未被确定，通常认为EA的吸收过程是由浓度梯度驱动的被动扩散[19]。人[4]和大鼠[20]摄入石榴汁后，均在其血浆和尿液中检测到了Uro A、B、C以及二甲基葡糖醛酸内酯。未被消化吸收的ET和EA到达结肠后，由微生物代谢产生一系列EA代谢产物，统称为尿石素[21]。尿石素的羟基数量因其代谢途径而不同，并依次命名为Uro A～D。EA打开一个内酯环脱去羧基生成Uro D，Uro D通过脱去1、2或3 个羟基分别生成Uro C、Uro A或isoUro A、Uro B[22]（图2）。尿石素被肠道上皮细胞吸收后与葡糖醛酸结合，随后进入体循环到达各靶器官[6,21]。有研究表明，人体摄入石榴汁后，尿石素以游离或复合的形式出现在体循环中，在24～48 h内达到最高浓度，最长存在时间为72 h[22]。葡萄糖醛酸化Uro A和Uro A硫酸盐是血浆和尿液中主要的EA代谢产物，其次是葡萄糖醛酸化Uro B和Uro C以及Uro B和Uro C硫酸盐[19-20]。在大鼠和小鼠实验中，尿石素在前列腺和肠道中富集，少量分布在肝脏和肾脏组织中[20,23]。因此，EA及其微生物代谢产物进入体循环主要通过3 个过程：1）饮食中游离的EA在胃部和近端小肠被吸收；2）ET在小肠水解释放EA，部分EA被小肠上皮细胞吸收；3）未被吸收的EA和ET进入结肠，被微生物代谢产生尿石素，尿石素被肠上皮细胞吸收进入体循环。

图2 EA代谢途径[24]Fig. 2 Metabolic pathway of EA[24]

将EA与人类粪便悬液经体外厌氧培养后，可检测到尿石素；在服用300 g树莓的回肠造瘘患者回肠液中回收到241%的EA，但其尿液中仅检测到低于1%的EA而未检测到尿石素，这进一步证实了EA主要在胃部和小肠段水解释放，而后肠段微生物在EA代谢和尿石素生成过程中发挥重要作用[19,25]。虽然科学家们提出了微生物介导尿石素的合成，但在这一过程中涉及到的特定细菌仍是未知的。并且尚不清楚ET释放EA的过程中是否有肠道微生物的参与，以及微生物的参与是否可以使ET不通过EA而直接代谢合成尿石素。最近，从人类粪便样品中分离出两株产生尿石素的细菌，这些细菌属于科氏杆菌科并被命名为Gordonibacter urolithinfaciens（DSM 27213T）和Gordonibacter pamelaeae（DSM 19378T）[26-27]。经高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS）分析显示，这些微生物依次产生Uro-M5、Uro-M6和Uro C，但是未在培养基中发现Uro A、isoUro A和Uro B。研究人员认为尿石素最终的分解代谢需要其他Gordonibacterspp的参与，或者体内的生理环境对于Gordonibacter urolithinfaciens（DSM 27213T）和Gordonibacter pamelaeae（DSM 19378T）的去羟基作用和产生Uro A和Uro B至关重要。因此，为了完善EA代谢产生尿石素的生理过程，仍然需要后续的微生物分离与研究。

此外，肠道菌群的细菌类型和多样性组成在不同人群中存在差异[26-27]，这也暗示了不同人群具有不同的EA分解代谢能力。研究人员根据摄入ET或EA后产生尿石素的定量和定性分析，将人群分为3种尿石素代谢表型，即尿石素代谢A、B和O型[28]（图3）。按受试者尿石素排泄水平分类，将受试者分为高浓度尿石素生产者、低浓度尿石素生产者和极低浓度尿石素生产者，极低浓度尿石素生产者因为生产尿石素浓度过低相当于非生产者[2]。代谢A型人群的微生物可代谢产生Uro A及其轭合物；代谢B型人群的微生物可代谢产生Uro B及其轭合物；代谢O型人群的微生物无法代谢产生尿石素。长期服用或短期高剂量服用ET或者EA可使部分代谢O型人群（非生产者中的应答者）转化为代谢A型或B型[29]。

图3 3种尿石素代谢表型Fig. 3 Three metabotypes of urolithins

3 EA及其尿石素类代谢产物的生物活性

近年来，国内外许多科研人员对EA及其代谢产物的生物活性进行了深入的探讨与研究。本文结合体外细胞实验、体内动物模型以及人体临床试验的研究结果，主要总结了3 个EA的生物活性特性：抑菌性和益生元特性、抗氧化特性、抗炎特性（表1）。

表1 EA的生理功能Table 1 Physiological functions of EA

3.1 调节肠道菌群

人们普遍认为肠道对ET和EA的吸收利用度较低，而被肠道微生物分解代谢生成的尿石素则更容易被吸收。2005年，Cerdá等[30]首次证明了在摄入富含ET和EA的核桃提取物后，人类肠道微生物可生成尿石素类代谢产物。尹培培等[31]研究表明，在诱导结肠炎模型前20 d给予石榴提取物（可水解生成EA）和Uro A处理后，观察到乳酸杆菌丰度显著增加，揭示了EA及Uro A潜在的益生元活性。

3.1.1 EA调节肠道菌群

EA对一系列病原微生物具有生长抑制作用。板栗雄花序中提取出的EA对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有一定的抑制效果[32]。此外，EA对从消化道溃疡患者肠道内分离出的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）具有剂量依赖性抑制作用[33]；同时，EA对其他病原微生物的生长抑制作用也有报道，如霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、痢疾志贺氏菌（Shigella dysenteriae）和弯曲杆菌（Campylobacterspp）[6]。反之，EA对益生菌和大部分双歧杆菌不存在抑制作用。

3.1.2 尿石素类代谢产物调节肠道菌群

除EA之外，Uro A和Uro B具有通过抑制微生物群体感应来抑制病原微生物的重要能力。群体感应是一种微生物间的沟通机制，该机制可响应小分子和自诱导物。细菌能通过该机制感应种群密度、调节基因表达并控制与感染进程相关的关键因素，如毒力、生物膜生成和运动性[24]。

Giménez-Bastida等[35]研究表明，Uro A和Uro B在较低浓度（4 µmol/L）下可降低肠道病原菌耶尔森菌（Yersinia enterocolitica）生物膜的生物量以及其游动活力。且Giménez-Bastida等[35]认为，Uro A和Uro B的抑菌作用主要是通过降低细菌酰基高丝氨酸内酯的释放，并改变细菌的基因表达水平从而影响其内酯与鞭毛的合成。以上研究表明，尿石素类代谢产物通过抑制病原菌、促进或不影响有益菌群的生长来维持肠道微生物菌群的平衡，可作为潜在的对抗病原菌感染的抗生素替代品。

3.2 抗氧化性

氧化应激会破坏蛋白质、脂质和核酸，引起慢性炎症，是导致多种疾病的重要因素。诸多研究表明，EA作为一种有效清除自由基的强氧化剂，对维持机体氧化还原稳态、氧化应激损伤修复具有重要的调节作用[24]。作为EA的代谢产物，尿石素保留了一定的抗氧化活性，其抗氧化能力与酚羟基数目有关[7]。在体外抗氧化实验中，仅具有两个酚羟基的Uro A的抗氧化能力（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl- 2-picryhydrazyl，DPPH）自由基清除能力和2,2’-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)（2,2’-azinobis-3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid，ABTS）阳离子自由基清除能力）明显低于其前体物质[36]。然而，在氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）抗氧化实验中，与抗坏血酸相比，Uro A是尿石素类中抗氧化能力最强大的代谢产物[36]。由此可见，尿石素的抗氧化性高于人们对其最初的认识，其抗氧化活性取决于不同的测定方式；鉴于自由基在不同疾病模型中发挥着重要作用，尿石素的抗氧化活性需结合不同的动物和疾病模型进行深入研究。

3.2.1 EA通过脂质过氧化作用发挥抗氧化性

活性氧自由基引起的脂质过氧化是导致许多器官发病的共同诱因。MDA的含量可反映机体或器官脂质过氧化的程度。在不同的动物和细胞模型中，EA和尿石素可显著降低机体或器官的脂质过氧化损伤。Yonar等[37]以彩虹鳟鱼为研究对象，分别检测了50、100、150 mg/kgmbEA的抗氧化活性，结果表明，3种浓度的EA均可降低肝、肾和脾脏中MDA的水平，并提高SOD、CAT和GSH活性。同时，在不同动物模型中，EA对特定条件下多种化学物质和药物诱发的脏器损伤具有保护作用。在亚砷酸钠诱导大鼠心脏和血液毒性的模型中，EA（10 mg/kgmb和30 mg/kgmb）显著降低了大鼠血液中MDA和一氧化氮（NO）的含量，提高了大鼠心脏GSH含量、CAT、SOD和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）活性[38]。在硫代乙酰氨基诱导的大鼠肝毒性模型中，EA显著降低了血清中丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate amino transferase，AST）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活力并抑制了肝脏中纤维化相关基因（基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）2和MMP9基因）的表达，同时降低了肝脏中MDA水平，增加了GPx活性[39]。在不同强氧化剂诱导的细胞模型中，Uro A、B、C和D似乎也表现出了降低细胞内活性氧含量和脂质过氧化产物的活性。研究人员用尿石素混合物（Uro A、B、C和D）处理人类结肠癌细胞Caco-2细胞系，发现胞内ROS产生减少，氧化应激减轻[40]。Qiu Zhengpeng等[41]通过测定膀胱癌T24细胞内的ROS、MDA水平和SOD活性来验证EA和Uro A的抗氧化活性，结果发现EA和Uro A均可降低H2O2诱导的膀胱癌T24细胞中的ROS和MDA水平，并增加SOD活性，表明Uro A与其前体EA均可缓解T24细胞的氧化应激。在H2O2诱导氧化损伤的HepG2细胞中，Uro A（150 µmol/L）处理细胞12 h后显著降低了胞内MDA、ROS、SOD和GPx水平[42]。此外，用Uro A和Uro B孵育降低了肝癌细胞HepG2细胞增殖，这可能与尿石素具有细胞膜穿透性，从而引起细胞内反应有关[43]。在顺铂诱导的肾脏损伤小鼠模型中，Jing Taile等[44]观测到Uro A（100 mg/kgmb）预处理有效缓解了小鼠体内GSH的消耗并降低了还原型辅酶II氧化酶2（reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 2，NOX2）基因的表达。

3.2.2 EA通过调控线粒体功能发挥抗氧化性

ROS的增加与线粒体功能障碍有关，线粒体受损促使线粒体膜通透性迅速增加，导致线粒体膜电位崩溃、氧化磷酸化解耦联以及线粒体渗透肿胀[45]。近年来研究发现，EA和尿石素在不同动物和细胞模型中可通过维持线粒体功能缓解氧化应激。Hwang等[46]对VK3诱导氧化损伤的人体肝脏细胞CHL细胞进行10 mmol/L EA预处理，发现EA降低了线粒体膜电位缺失细胞的百分比；将VK3换成线粒体呼吸链复合体I的抑制剂鱼藤酮，EA同样可以阻止线粒体膜去极化，维持线粒体功能，缓解细胞氧化损伤。在庆大霉素诱导的大鼠肾脏损伤模型中，EA降低了线粒体ROS的含量，阻止了线粒体膜电位的缺失，减少了线粒体肿胀并降低了Cyt c的释放，证明EA可通过保护线粒体功能缓解庆大霉素诱导的肾脏损伤[47]。Ryu等[48]对比Uro A在幼年蠕虫（1 日龄）和老年蠕虫（10 日龄）中对线粒体功能的调节作用，研究发现短期的Uro A处理（1 d）会暂时降低线粒体含量，但随着时间的延长（10 d），Uro A激活了线粒体的生物合成，显著增加了线粒体的含量以及呼吸链配体的基因与蛋白的表达，从而延长了蠕虫的寿命。同时，Andreux等[49]首次在人体临床试验中验证了Uro A的安全性（连续4周每天服用500 mg或1 000 mg Uro A），并报道了Uro A可通过调节老年人骨骼肌线粒体基因的表达改善其线粒体功能。然而，Yin Peipei等[50]发现Uro C似乎与EA的生物活性不同，EA促进了大鼠嗜铬细胞瘤PC12细胞的增殖，而Uro C显著增加了PC12细胞中MDA和ROS的含量，刺激乳酸脱氢酶的释放和线粒体膜去极化，并导致细胞停滞在S期，促进细胞凋亡；Uro C还导致了B淋巴细胞瘤2凋亡家族（b-cell lymphoma-2/bcl2-associated X，Bcl-2/Bax）比值失衡，触发了一系列半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）级联反应。

线粒体自噬是线粒体的选择性清除。线粒体自噬控制线粒体质量，通过消除受损的线粒体来抑制ROS的过量累积，从而防止细胞过氧化损伤[51]。Shida等[52]研究发现线粒体自噬可通过调控线粒体的分裂与融合以清除功能受损的线粒体并抑制ROS的过量积累，对预防氧化损伤相关疾病的发生具有重要作用。Ryu等[48]对幼龄蠕虫进行短期Uro A处理（1 d），发现蠕虫的线粒体含量显著降低，但却维持了最大呼吸能力，这一现象可能与Uro A诱导的线粒体自噬相关；与对照组相比，Uro A处理组促进了线粒体自噬基因和线粒体分裂基因的表达，并通过敲除多个线粒体自噬相关基因（如Pink1、常染色体显性OPA-1、自噬效应蛋白（beclin1）基因）对此进行了验证，进一步在哺乳动物细胞系中验证Uro A对线粒体自噬的调控。在小鼠成肌细胞C2Cl2细胞和小鼠肠道上皮细胞Mode-K肠道细胞中，Uro A激活了参与自噬启动的关键酶AMPKα以及张力蛋白同源物诱导的Pink-1和LC-3，并增加了激光共聚焦显微镜下分裂的线粒体网格形态[48]。此外，Ryu等[48]还证明了Uro A可提高小鼠肌肉功能，主要体现在增加了约9%的握力和57%的自发运动量。与此同时，Lin Jialiang等[53]也验证了Uro A预处理可通过激活AMPKα诱导线粒体自噬，从而减少椎间盘内侧髓核（nucleus pulposus，NP）细胞的凋亡。

由以上研究可见，EA和尿石素对机体氧化应激的调节机制主要包括：1）缓解脂质过氧化，提高抗氧化酶的活性；2）维持线粒体功能，促进线粒体生物合成；3）诱导线粒体自噬，清除功能受损的线粒体。然而，在不同的疾病模型和体内外实验中，EA和Uro A的抗氧化调节机制存在差异，如短期的Uro A处理可能会诱导线粒体自噬，维持线粒体呼吸功能，而长期的Uro A处理则更倾向于促进线粒体生物合成[48]。关于EA和Uro A对于线粒体自噬的调节作用仍需要更多的体内体外研究进行深入探讨。

3.3 抗炎

许多研究已经证实了酚类化合物的抗炎作用和免疫调节作用。EA的抗炎活性在多种疾病模型中得到验证，但其具体机制尚未明确。在结肠癌大鼠模型中，EA表现出化学保护作用，并通过抑制核转录因子kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）的表达下调了一氧化氮合成酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、环氧化酶2（cyclooxyganese-2，COX-2）、TNF-α和IL-6的水平[54]。在糖尿病胰腺炎小鼠模型中，灌胃EA显著降低了促凋亡蛋白cleaved-caspase 3、硫氧还蛋白相互作用蛋白（thioredoxin interacting protein，TNXIP）和IL-1β的水平，升高了血浆抗炎因子IL-10的水平[7]。同时，EA显著减少了脂多糖诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7中IL-6，NO和前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE-2）的产生[1]。目前，EA抗炎活性的人类临床研究较少，且实验结果并不完全一致。Shishehbor等[55]研究发现，40 位二型糖尿病患者连续4周每天服用50 g浓缩石榴汁后，血清中IL-6的水平显著降低，而TNF-α水平并未改变。在透析病人中，连续12 个月每天服用100 mL石榴汁显著降低了病人血液IL-6和TNF-α的水平；而在另一个临床试验中，透析病人连续6 个月每天服用1 g石榴提取物，并未出现炎症因子水平显著的变化。上述临床试验证据表明，服用大剂量的EA或长期服用时，可以减缓全身的炎症反应。除了石榴，EA同样是黑莓中的最主要成分，在胃肠道消化环境体外模型中发现，添加黑莓提取物的消化液能够抑制HepG2细胞中氨基酸诱导的ROS和超氧阴离子自由基生成，并且显著提高SOD和CAT活性[56]。在脂多糖诱导的炎症小鼠模型中，黑莓籽粉提取物对炎性因子IL-1β有明显的抑制作用，并提示黑莓籽粉中的EA可能是其发挥抗炎作用的主要物质[57]。

有研究人员认为富含EA的食物（如石榴汁）摄入机体后在抗炎过程中发挥主导作用的物质主要为EA和ET，而并不依赖食物中所含的其他酚类[58]。而EA在机体内的利用和活性的发挥至少部分依赖于其代谢产物尿石素类。近年来，科研人员在不同的实验模型中对尿石素类的抗炎活性进行了研究。在这些研究中，尿石素主要通过两种方式调节抗炎反应：1）降低调节炎症反应关键因子的表达与含量，如MCP-1、IL-6、IL-1、IL-8和TNF-α[25,59]；2）减弱成纤维细胞和内皮细胞的迁移以及单核细胞的黏附[60]，这些都是与炎症功能障碍相关的关键步骤。然而，体循环中尿石素含量较低，许多体外细胞实验中对于免疫应答有效的尿石素工作浓度高达10～60 µmol/L，超过了血浆中这些代谢产物的生理浓度[21]。尿石素类轭合物在体循环中的含量高于游离的尿石素，其更适合在不同细胞模型中进行体外验证实验。有报道称，生理浓度的糖基化Uro A可抑制内皮细胞的迁移和单核细胞的黏附作用[60]；低浓度的糖基化Uro B可降低心肌细胞中MCP-1、CX3趋化因子配体1（chemokine C-X3-C motif ligand 1，CX3CL1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的基因表达[58]。在动物模型中，Uro A对小鼠足水肿具有急性抗炎作用，这与其抗氧化活性相关[35]。同时，Uro A在尿道炎大鼠中可降低IL-1β的表达与PGE-2的水平[60-61]。然而，尿石素类的体内研究报道有限，仍然需要进一步的体内动物实验和临床研究，从而证明EA能通过抑制MAPK激酶的激活控制炎症。

4 EA及其尿石素类代谢产物在肠道疾病研究中的应用

近年来，炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）和结肠癌在我国的发病率一直呈上升趋势，严重影响着人体健康。正确的日常饮食对结肠癌和炎症性肠病的预防和患者的调护至关重要。研究证明，EA和尿石素在胃肠道可达到生物活性浓度[24]，并通过其抗菌、抗炎及抗氧化活性发挥对炎症性肠病和结直肠癌的有效治疗作用[62]。

4.1 炎症性肠病

流行病学研究结果显示，IBD和结直肠癌在世界范围内具有相似的流行率，提示长期的肠道炎症与结直肠癌发病率密切相关[63]。Singh等[64]研究发现EA可降低葡聚糖硫酸钠（dextran sulphate sodium，DSS）诱导的溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）小鼠中结肠过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的含量，并通过防止结肠肥大细胞膜脱颗粒和抑制组胺释放，发挥其预防炎症和阻止结肠炎扩散的作用。Marín等[65]验证了EA在急性和慢性UC模型中的抗炎作用，结果显示EA可轻微改善高浓度DSS诱导的急性UC的严重程度并推迟发病时间，同时降低了炎症因子IL-6、TNF-α和INF-γ的分泌；在1%和2% DSS诱导的长期慢性UC模型中，EA减少了溃疡的扩散及结肠质量与长度之比。Marín等认为EA缓解UC的主要机制包括抑制COX-2和iNOS的表达、调节p38MAPK、NF-κB以及信号转导与转录因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信号通路，并提出EA可作为治疗UC的理想选择[65]。在三硝基苯磺酸（trinitro-benzene-sulfonic acid，TNBS）诱导的小鼠克罗恩肠病（Crohn’s disease，CD）模型中，Rosillo等[66-67]发现EA可显著降低MPO及促炎症因子的含量与表达；同时，EA抑制了MAPK的磷酸化和NF-κB的易位，从而缓解了TNBS对小鼠肠道造成的损伤。同样在小鼠CD模型中，研究人员发现Uro A可显著降低结肠炎小鼠肠道通透性和过氧化物酶MPO的含量，并减少小鼠全身炎症因子（IL-6、TNF-α、IL-1β）的产生，提示Uro A通过芳香烃受体（Ahr）-Nrf2通路途经调节肠道黏膜结构，缓解肠道损伤[68]。此外，富含EA的石榴汁和石榴提取物也被研究人员广泛应用在IBD疾病治疗和研究中。有报道称，石榴汁和石榴提取物可显著降低DSS诱导的结肠炎大鼠血清和黏膜中促炎症因子PGE2、IL-18、IL-1β和NF-κB的水平、肠道黏膜损伤指数和疾病活性指数，从而降低疾病的严重程度[69-70]。综合各项IBD疾病模型的研究发现，EA、Uro A和石榴提取物的作用机制强调了其对炎症细胞因子PGE-2、TNF-ɑ、IL-1β等的调节作用，以及对p38 MAPK、NF-κB和STAT3信号通路的抑制作用。

4.2 结肠癌

科研人员将富含EA的石榴汁或石榴提取物应用在结肠癌患者的临床研究中，以期改善结肠癌患者的疾病活性指标和术后恢复情况。35 名结肠癌患者连续每天服用900 mg富含EA的石榴提取物，并对比手术前后结肠组织中结肠癌相关基因的表达，结果显示，石榴提取物调节了结肠组织中CD44、CTNNB1、CDKN1A、EGFR和TYMs基因表达水平[71]。在另一项临床研究中，术前连续每天服用石榴提取物可显著降低患者血液中内毒素标志物脂多糖结合蛋白的水平[72]。在临床研究上初步得到了富含EA的石榴提取物对结肠癌的调控作用，研究人员进一步在结肠癌细胞系模型中分析其具体的作用机制。近年来，研究人员在不同结肠癌细胞系（HT-29、HCT-116、SW480和SW620）中分别验证了EA对癌细胞凋亡的促进作用[73]。EA和Uro A、Uro B的混合物被证实对Caco-2细胞的增殖具有抑制作用，这种抑制作用主要是通过调节细胞周期相关基因（细胞蛋白周期B1（cyclin B1，CCNB1）和人源重组蛋白1（cyclin B1 interacting protein，CCNB1IP1）基因）将癌细胞阻滞在S和G2/M期，同时抑制癌症发展的相关基因（细胞癌基因c-Myc、磷酸化癌基因Fos、成纤维细胞生长因子受体2（fibroblast growth factor receptor 2，FGFR2）基因和表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因）的表达，促进细胞凋亡[74]。石榴汁和石榴提取物能够降低HT-29人结肠癌细胞系中TNF-α介导的COX-2蛋白表达水平以及NF-κB与丝苏氨酸蛋白激酶（protein kinase B，AKT）的结合激活[75]。并且，Bai Chongfei等[76]首次证实了三甲基鞣花酸通过上调Bax、磷酸化Caspase 3以及下调Bcl-2抑制结肠癌细胞SW620细胞的生长，且发现该过程与VEGF/磷脂酰肌醇-3-激酶/AKT/雷帕霉素靶蛋白通路有关。在HCT-15结肠癌细胞中，其他研究人员发现了类似的EA和尿石素抑癌作用，并提示了该机制与丝裂素活化蛋白激酶信号转导（extracellular signal-regulated kinase1/2，ERK1/2）途径相关[77-78]。EA和尿石素靶向调控结肠癌的另一种可能是Wnt途径[79-80]。EA（63 µmol/L）和Uro A（39 µmol/L）在可达到生理浓度下均可以抑制HEK T293结肠癌细胞中的Wnt途径[79]。近期，有研究人员在结肠癌细胞系模型（HCT-116、Caco-2和HT-29）中发现Uro A，而非其他尿石素类代谢产物，能够通过上调p43增加衰老相关β-半乳糖苷酶的活性，从而发挥其抗癌作用；同时提出该实验中Uro A的抗癌作用可能与细胞周期阻滞和细胞凋亡无关[81]。总结以上研究，EA和Uro A靶向调节结肠癌的可能机制为：1）调节细胞周期和凋亡相关基因，但该作用可能与剂量相关；2）调控细胞信号转导通路，如抑制AKT、ERK1/2、Wnt通路以及NF-κB磷酸化。

5 结 语

肠道微生物可将EA代谢为尿石素，尿石素通常比EA具有更高的吸收率和生物活性。反过来，EA与微生物间的相互作用也可增加微生物菌群多样性、刺激有益菌群的生长并延缓致病菌株的感染。EA和尿石素可通过降低脂质过氧化、增加抗氧化酶活性以及促进抗炎症因子的分泌、抑制炎症因子的表达，同时还可调节相关的代谢途径的表达，如Nrf2、TNF-α、NF-κB等发挥抗氧化和抗炎活性。但是，关于EA和尿石素在肠道疾病中作用机制的研究尚存空白。目前，对尿石素的直接生物学活性研究较少，主要集中在体外细胞模型中，而动物模型尤其是人体临床试验的研究还不充足。并且，多数的体外模型实验中尿石素的活性浓度远高于机体生理条件下可达到的浓度。因此，应继续研究生理浓度下，EA及尿石素对肠道疾病模型的作用，或靶向研究肠道组织中两者的代谢途径和生理功能。此外，还需要深入研究微生物与EA和尿石素之间的相互作用以及确认与该代谢途径直接相关的微生物群落。EA和尿石素的生物特性以及其与肠道微生物的互作可有效地预防和缓解肠道疾病的发生与发展，未来仍需进一步探究EA和尿石素的抗炎、抗氧化及其他潜在特性，以提高EA和尿石素的生物利用度，推广其在临床营养和肠道疾病治疗中的应用。