花色苷对视网膜的保护作用及其机制研究进展

彭珍珍，綦文涛，王 勇,*，黄铮昱，彭文婷，刘婷婷,3

（1.中南林业科技大学食品科学与工程学院，稻谷及副产物深加工国家工程研究中心，湖南 长沙 410004；2.国家粮食和物资储备局科学研究院，北京 100037；3.上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093）

花青素是人们日常饮食中摄入量最高的酚类化合物，通常被糖基化修饰后形成花色苷。花色苷为自然界中水溶性的可食用植物色素，广泛分布于深色的蔬菜、浆果和谷物中，人们通过混合膳食每天可以摄入数十毫克的花色苷[1]。花色苷具有黄酮类特有的C6-C3-C6碳骨架结构，食物中含量最为丰富的6 类花青素是矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素[2]。花色苷具有抗氧化、抗炎、抗癌、缓解脂肪肝、预防糖尿病和神经保护作用等多种生理功能[3-10]。此外，花色苷还具有促进视紫红质再生、改善视网膜毛细血管微循环、提高夜视力等作用[11]。花色苷的健康功效在食品和医药领域受到越来越多的关注，其作为着色剂在食品加工领域具有极大的应用潜力，研究花色苷的生物活性及其作用机理对指导合理膳食和开发健康功能食品具有重要意义。

可食用的植物茎、叶、花、果实是人们摄取花色苷的重要来源，通常颜色越深的食物花色苷含量越高。花色苷的功能活性与其特殊的化学结构、理化性质、机体吸收代谢利用率、与其他食物组分的相互作用都有极大关系，3-葡萄糖苷糖基化形式是自然界中最为常见的花色苷类型。矢车菊素-3-葡萄糖苷（cyanidin-3-glucoside，C3G）在自然界中分布最为广泛，其为矢车菊素3位羟基被一分子葡萄糖取代的糖基化合物，母核存在3 个苯环，形成高度共轭体系，环上的羟基取代增加其给电子共轭效应，赋予C3G较好的供电子能力和较强的抗氧化活性[12]。叶菜、浆果及有色谷物中富含C3G，例如C3G分别约占黑米和黑豆中总花色苷含量的88%和95%[13-14]。

眼睛是机体接收外界光信号的重要器官，智能手机、平板电脑等电子设备的广泛使用不可避免地会产生过量光暴露，造成视网膜光氧化损伤，从而引发多种视觉障碍。截至2020年我国近视人口将接近7亿，且低龄化趋势明显[15]，预防视网膜光损伤对保护视力至关重要。据国家市场监督管理总局特殊食品信息查询平台数据显示，具有缓解视疲劳功能的保健食品的原材料在2013年以前多以中草药及其提取物为主，如菊花、枸杞、决明子等。近年来，天然非中药护眼活性成分在缓解视疲劳保健食品中应用较为普遍[16]，如越橘提取物、蓝莓提取物、类胡萝卜素（叶黄素、玉米黄质和β-胡萝卜素）、多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）（二十二碳六稀酸（docosahexaenoic acid，DHA）和二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA））、牛磺酸、维生素（VA、VC和VE）等。研究表明，不同来源花色苷对视网膜中多种细胞具有保护功效，摄入花色苷有助于维持视觉健康[17-18]，但具体作用机制尚不明确。本文以花色苷的吸收代谢、视网膜光氧化损伤机理及花色苷在视网膜保护方面的研究现状进行综述，系统阐明花色苷保护视网膜细胞的关键作用靶点，为花色苷类功能因子保护视觉健康提供参考依据。

1 花色苷的吸收代谢

花色苷进入机体后，可以完整的糖苷形式或微生物代谢产物（一级、二级代谢）被人体的各组织和器官吸收和代谢，其吸收速率和程度与糖基团、酰化基团和食物基质成分密切相关[19]。胃是花色苷单糖苷吸收的重要部位之一，1%～10%以完整结构被胃上皮细胞吸收，10%～20%以一级代谢产物通过主动运输穿过胃上皮细胞进入血液循环[20]。未被吸收的花色苷进入肠道，部分发生去糖基化反应，以花色苷苷元形式被动扩散穿过生物膜，大部分被肠道中的微生物分解转化为低分子质量的、可被吸收的酚酸和醛等，这些代谢产物具有促进肠道微生物增殖和人体健康的作用[21-22]。被吸收的花色苷（原型或共轭物）及其降解产物通过肝肠循环和血液循环进入各组织器官（图1）[3,23]。多种动物经口摄入花色苷后在眼组织检测到花色苷原型，证明花色苷可以穿过血脑屏障、血-房水屏障和血-视网膜屏障（blood-retinal barrier，BRB），更值得注意的是，相比于脑和肝脏，眼组织中花色苷含量最高[24-27]。

图1 花色苷吸收代谢过程Fig. 1 Anthocyanins absorption and metabolism

在肠道菌群中只有少量的菌种（如双歧杆菌、乳杆菌等）能将包括花色苷在内的多酚类化合物分解代谢[28]。不同个体肠道微生物种类不同，导致花色苷及其代谢产物的生物利用率和生物活性不同[29]。Bifidobacterium、Lactobacillus和Akkermansia等细菌分泌大量的酶如β-葡萄糖苷酶，催化花色苷3位糖苷键裂解，产生中性pH值环境下不稳定的花色苷苷元，随后杂环C环断裂为相应的稳定产物-酚酸（来源于花色苷骨架B环）和间苯三酚衍生物（来源于花色苷骨架A环）等[30-31]。体外研究表明，花色苷在1 h内被大肠菌群去糖基化，并进一步被降解为对应花色苷B环的酚酸[32]。花色苷在结肠中微生物的代谢下产生的酚酸主要为原儿茶酸（protocatechuic acid，PCA）、阿魏酸（ferulic acid，FA）、没食子酸、丁香酸、对香豆酸和香草酸等[30,33]，代谢生成的酚酸也具有较好的抗氧化、抗炎和抗凋亡功能[3,23]。越来越多证据表明，结肠菌群代谢和降解的酚酸产物在提高花色苷生物利用率和促进人体健康功效方面具有重要作用，且酚酸在某些方面的生物活性高于花色苷，例如C3G的抗氧化、抗炎、抗癌、调节肠道菌群活性可能归因于其在体内的代谢产物PCA和FA[34-36]。相关研究为膳食花色苷在眼部发挥健康功效提供了重要的理论基础。

2 视网膜光氧化损伤机理

视网膜结构精细、功能复杂，既是光的接受器又是传导器。视网膜处于高氧、高光照、高PUFAs的环境中极易受到活性氧攻击而发生光氧化损伤[37]。视网膜光损伤主要涉及视网膜色素上皮（retinal pigmented epithelium，RPE）细胞和感光细胞，其中RPE细胞是可见光引发视网膜损伤的主要靶点之一，蓝光（405～480 nm）对RPE细胞具有最强的光毒性[38]。视网膜RPE层是由高度极性、特殊分化的单层上皮细胞构成，位于感光细胞外节和脉络膜之间。RPE细胞的主要功能包括运输营养与代谢物质、形成BRB、吞噬和消化感光细胞脱落的外节盘膜等，RPE细胞形成的BRB对于维持视网膜健康具有重要意义[39]。

RPE细胞间紧密连接（tight junction，TJ）是BRB的基础，对于维持视网膜的营养供给和解毒功能非常重要。BRB由外屏障和内屏障组成，其中外屏障由RPE细胞及细胞间TJ构成，具有选择性吸收脉络膜输送的营养，转运离子、水和代谢产物到脉络膜血管的作用。跨膜蛋白（闭合蛋白Claudin-5和闭锁蛋白Occludin等）、胞质附着蛋白（闭合小带蛋白ZO-1等）和细胞骨架蛋白共同组成了TJ。ZO-1与Claudin-5、Occludin形成蛋白复合体，对于维持RPE细胞TJ结构和屏障功能具有重要作用。各种内源、外源的信号通路通过调节TJ蛋白实现对BRB通透性的调节作用。体内研究表明光氧化引起RPE细胞凋亡并破坏TJ结构，最终导致BRB功能紊乱[40]。

2.1 类视色素二聚体对视网膜光损伤的影响

N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺（N-retinylidene-N-retinyl-ethanolamine，A2E）（图2）为类视色素二聚体（bisretinoids）自发荧光的主要物质基础[41-42]。随着年龄的增长，A2E积累于RPE细胞溶酶体中，在蓝光照射下产生活性氧基团（reactive oxygen species，ROS），ROS可诱导A2E环氧化物形成，破坏内质网、线粒体和溶酶体正常功能，引起RPE细胞凋亡和BRB功能障碍[27,43-45]。过量积累的A2E经过光氧化和光裂解形成高活性的二羰基化合物丙酮醛，丙酮醛与蛋白质反应生成晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs），AGEs促进TJ蛋白的异常分泌，破坏BRB通透性[46-48]。当A2E等类视色素二聚体在RPE细胞中过度积累时，可诱导年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）等视网膜疾病的发生[37]。目前在细胞水平常采用化学诱导剂H2O2等引发RPE细胞损伤[49-50]，基于A2E和蓝光诱导RPE细胞光损伤模型可更真实、合理地反映RPE细胞在光氧化生理条件下的致病机制。

图2 A2E的结构Fig. 2 Structure of N-retinylidene-N-retinyl-ethanolamine (A2E)

2.2 PUFAs对视网膜光损伤的影响

RPE细胞中的ROS易攻击PUFAs产生脂质过氧化物，其存在时间比ROS长，具有更严重的损伤能力，导致视网膜光氧化损伤[51]。感光细胞外节盘膜中富含PUFAs，易受到活性氧和脂质过氧化物攻击，蓝光照射后，生成醛类等高活性的脂质过氧化终产物，如4-羟基壬烯酸（4-hydroxynonenal，4-HNE）和4-羟基己烯醛（4-hydroxyhexenal，4-HHE），两者易与视网膜中蛋白质发生非酶羰基化反应，使其发生交联而丧失功能、细胞膜通透性改变、细胞周期阻滞，最终导致视网膜细胞凋亡[52]。DHA为视网膜中含量最丰富的PUFAs，约占感光细胞膜磷脂中总脂肪酸的60%[27]。RPE细胞内DHA的光氧化产物影响溶酶体膜通透性，从而释放溶酶体内积累的A2E，导致RPE细胞功能障碍和AMD[52]。抑制视网膜组织脂质过氧化产物的生成是预防视网膜氧化损伤的有效途径。

2.3 内质网应激对视网膜光损伤的影响

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）在光诱导RPE细胞凋亡过程中具有重要作用[53]。过度光照引起RPE细胞内氧化还原状态改变，产生过量的ROS，导致内质网功能紊乱，引发ERS反应，免疫球蛋白重链结合蛋白（immunoglobulin heavy chain binding protein，BiP）与3种应激因子蛋白激酶RNA样内质网激酶（protein kinase RNA-like ER kinase，PERK）、肌醇需求酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）和活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）解离，激活未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），PERK自磷酸化而激活，诱导真核细胞翻译起始因子2（eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2）α亚基磷酸化，抑制蛋白翻译，IRE1α剪切X-盒结合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1），产生有活性的XBP1s蛋白加速蛋白折叠，从而维持内质网的正常生理功能。但持续过强的ERS存在时，超出UPR维持稳态的能力，则启动ERS相关凋亡途径，激活IRE1α下游丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/c-Jun氨基末端激酶（c-Jun-N-terminal kinase，JNK）和PERK下游CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP），进而引发RPE细胞凋亡[54-55]。研究表明丙酮醛诱导的RPE细胞损伤机制也涉及ERS相关凋亡途径[56]，AGEs与AGE受体（receptor for advanced glycation end product，RAGE）结合，可以激活ERS信号通路[57]。ERS反应导致RPE功能紊乱，调节ERS通路可保护RPE细胞屏障功能[58]。蓝光和A2E诱导的RPE细胞损伤模型中，BiP和XBP1表达量升高，这与视网膜退行性疾病的发病机制有关，抑制ERS可以减少线粒体ROS生成，缓解RPE细胞自噬和凋亡[59-61]。因此，调控ERS以恢复内质网稳态可能成为视网膜保护的重要机制。

3 花色苷对视网膜的保护作用及相关机制

花色苷对视觉的保护作用可追溯于二战英国空军飞行员通过食用越橘提高夜视力，随后被欧洲学者广泛研究并证实花色苷能增强暗视力和视觉灵敏度[11]。近年来，国内外学者利用体外（细胞模型）和体内（动物模型和人群干预）模型研究了花色苷对视网膜的保护作用及相关机制（表1）。Davinelli等基于16 项人群干预研究，系统综述了花色苷在临床试验中具有改善多种眼部疾病的功能[62]。研究表明每日膳食摄入50 mg及以上花色苷具有改善视觉功能及预防眼部疾病的作用[63-65]。膳食补充花色苷等抗氧化剂已成为预防AMD等视网膜疾病的有效途径，花色苷对视网膜细胞具有多种保护途径（图3），包括清除ROS、增强抗氧化系统、抑制炎症和凋亡相关蛋白表达等。通过比较C3G、飞燕草素-3-葡萄糖苷、锦葵花色素-3-葡萄糖苷和天竺葵色素-3-葡萄糖苷对RPE细胞光损伤的干预作用，结果显示B环上具有邻位羟基结构的C3G在清除ROS、抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）过表达和延缓衰老方面具有最强的作用效果[39]。体内研究进一步证实C3G通过激活核因子相关因子2（nuclear-factor-E2-related factor 2，Nrf2）/血红素加氧酶（heme oxygenase，HO-1）抗氧化通路，降低炎症因子水平，调节VEGF表达，缓解视网膜细胞氧化应激和凋亡，保护视网膜结构和功能[35]。

表1 花色苷对视网膜的保护作用及相关机制Table 1 Protective effects and mechanism of anthocyanins on the retina

图3 花色苷对视网膜细胞保护途径Fig. 3 Pathways by which anthocyanins protect retinal cells

3.1 抑制A2E光氧化和光裂解

RPE细胞积累A2E对细胞存活率并无影响，但富集A2E的RPE细胞在蓝光照射后发生显著凋亡。C3G不但可清除RPE细胞内ROS、降低炎症因子和凋亡蛋白表达，还可抑制光氧化型A2E的形成与裂解，降低丙酮醛释放，抑制RAGEmRNA上调，从而有效缓解光氧化诱导的RPE细胞凋亡[79]。体内研究也表明越橘多酚提取物可抑制A2E在细胞内积累，清除ROS，减少氧化型A2E形成，维持视网膜外核层厚度[80]。

3.2 降低4-HNE等脂质过氧化产物毒性

降低脂质过氧化物毒性是预防视网膜氧化损伤途径之一，以脂质过氧化产物4-HNE构建RPE细胞损伤模型，发现C3G可提高RPE细胞存活率，保护机制涉及调控细胞凋亡通路、缓解细胞衰老、抑制VEGF过表达、调节炎症因子表达等方面[81]。同时，C3G可通过调控JNK-c-Jun/AP-1通路抑制4-HHE诱导的RPE细胞NLRP3炎症小体激活[67]。蓝莓花色苷可降低光诱导的不饱和脂肪酸过氧化反应[82]。此外，桑葚花色苷可抑制高胆固醇饮食诱导的仓鼠视网膜脂质沉积，降低眼组织脂质过氧化水平[83]。

3.3 激活Nrf2/HO-1等抗氧化通路

膳食补充花色苷可减轻视网膜细胞氧化应激，锦葵色素-3-葡萄糖苷和天竺葵色素-3-葡萄糖苷具有清除细胞内ROS并提升线粒体还原活性的作用，从而降低蓝光诱导的RPE细胞氧化损伤[84]。Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）-Nrf2/抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）抗氧化应激信号是保护细胞免受炎症和氧化应激的主要调控通路，光氧化引发的AMD涉及RPE细胞Nrf2通路的激活[85]。蓝莓花色苷可激活Nrf2/HO-1通路，干预高糖诱导的大鼠视网膜氧化应激，预防糖尿病眼病[74]。PCA和FA为C3G的一级代谢产物，具有较强的自由基清除能力，可显著上调Nrf2表达，激活抗氧化酶表达，降低视网膜氧化应激，减少DNA损伤和脂质过氧化，对RPE细胞和感光细胞具有保护作用[35]。

3.4 抑制NF-κB等炎症反应通路

胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）为视网膜神经炎症的标志物，GFAP表达上调可阻碍RPE细胞增殖，激活诱导型一氧化氮合酶表达，触发氧化应激和炎症因子分泌，花色苷可下调GFAP的表达，从而缓解视网膜炎症[86]。RPE细胞发生光氧化损伤后，NF-κB信号通路及NLRP3炎症小体被激活，引发炎症级联反应，提高炎症因子单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、IL-6和IL-1β等的表达[87]。蓝莓花色苷调控凋亡相关蛋白沉默信息调节子1（silent information regulator protein 1，SIRT1）-NF-κB通路，下调ICAM-1表达，发挥抗炎作用，抑制高糖诱导的视网膜细胞损伤[70]。越橘花色苷提取物抑制信号传导及转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）和NF-κB激活，下调IL-6的表达，抑制脂多糖诱导的视网膜感光细胞外节缩短及视紫红质减少[88]。

3.5 缓解内质网应激

ERS可能为调控视网膜细胞损伤的重要通路，BiP是机体缓解ERS损伤所激活的UPR中的关键蛋白，越橘花色苷和紫米花色苷可通过调节小鼠视网膜神经节细胞BiP表达水平，改善ERS反应，保护神经节细胞，具有预防和治疗青光眼的潜在功能[71,89]。利用H2O2诱导RPE细胞氧化损伤，发现锦葵色素及其衍生物可抑制RPE细胞ERS并保护内质网结构[90]。因此，ERS可能是今后研究视网膜保护机制的重要靶点。

3.6 调控细胞凋亡通路

体内和体外实验结果表明，花色苷具有提高视网膜细胞抗凋亡能力的作用，抑制Bax、细胞色素c、Caspase-3表达并提升Bcl-2表达[50,75]。MAPK家族蛋白在RPE细胞光损伤中起着重要的作用，UPR支路中IRE1α自身磷酸化后可以激活MAPK家族中JNK和p38，上调促凋亡蛋白的表达，C3G、锦葵色素-3-葡萄糖苷和飞燕草素-3,5-葡萄糖苷可抑制光诱导的视网膜细胞MAPK家族蛋白（JNK、p38）磷酸化和Akt磷酸化，缓解感光细胞和RPE细胞凋亡[66,68,91]。AP-1是光受体凋亡的重要中介，黑米花色苷可抑制AP-1和Caspase-1表达，预防视网膜光化学损伤[73]。紫薯花色苷可促进RPE细胞增殖和维持细胞正常形态[92]。

4 结 语

在快速发展的互联网时代，智能手机、平板电脑等电子设备的广泛使用导致视觉障碍患者人数激增，亟需挖掘保护视力的功能成分，开发具有护眼功能的健康食品。花色苷作为天然抗氧化及抗炎活性物质，长期摄入可降低视网膜疾病的患病风险。本文介绍了花色苷的吸收代谢、视网膜光氧化损伤机理及花色苷在视网膜保护方面的研究现状，系统阐述花色苷保护视网膜细胞的关键作用靶点，为花色苷类功能因子保护视觉健康提供参考依据。

今后可重点从以下几个方面研究花色苷对视网膜保护作用及相关机制：1）花色苷对视网膜细胞的保护作用机制涉及调控氧化应激、炎症反应、ERS和凋亡等通路，但各通路间的联合调控机制尚未明确，还有待进一步证实。2）BRB对于维持视网膜健康具有重要意义，花色苷是否具有保护BRB功能的作用尚不清楚，阐明花色苷保护RPE细胞屏障功能的作用机制十分重要。3）不同结构花色苷及花色苷代谢产物对视网膜细胞保护作用的构效关系仍需深入研究。