鲜食核桃仁抑制褐变与脱色方法及货架期保鲜效应

刘朝斌，李书影，叶 妞，唐 燕，曹永新，马惠玲

（1.西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100）

核桃是我国经济林重点支柱产业之一，近年来得到迅猛发展，在乡村振兴战略中发挥了重要作用。目前我国核桃年产量基本达到480万 t（2021年国家统计局数据），占世界总产量的1/2，成为世界核桃生产第一大国。为了扩大销量，业内都将目光投向新产品开发方面，以拉动消费、提高效益[1]。核桃坚果富含多种营养物质，具有健脑、预防心血管病、抑制癌细胞生长[2-3]等保健功效。鲜食核桃相对于干核桃，更具有口感香甜[4]，营养全面的特色[5]，成为核桃消费的又一主流形式。提前去壳的鲜核桃仁外形精美、食用方便、卫生，是符合现代人美食观念的原生态产品，具有很大的市场潜力。然而，鲜核桃仁含水量高，酶活力强，20 ℃以上室温下贮藏2～3 d内便会因氧化褐变和滋生微生物等发生变色变质，造成营养品质下降[6]，因此，其货架寿命极短，至今尚未成功实现商品化。韩强等[7]采用40 mg/L ClO2处理加真空包装可保持新疆主栽品种‘温185’鲜核桃仁30 d不霉烂，提出了鲜核桃仁保鲜的可行性，但其保鲜工艺仍需改进。

国内外大量研究显示，多种抗氧化剂或物理处理可抑制生鲜植物食材褐变。抗坏血酸（ascorbic acid，AsA）作为一种多羟基化合物，可有效抑制多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活力，研究表明AsA能够抑制番石榴、鲜切苹果和板栗褐变[8-10]；同理，没食子酸丙酯（propyl gallate，PG）是含有3 个羟基的酚类物质，可竞争性结合在PPO活力位点，抑制PPO活力。研究发现PG浸泡成功抑制了龙眼、高新梨的采后褐变[11-12]；加热处理通过抑制生鲜植物产品PPO和过氧化物酶（peroxidase，POD）活力，有效控制了龙眼和大果山楂的酶促褐变[13-14]。葡萄糖氧化酶、木瓜蛋白酶和木聚糖酶复合处理有效降低了新鲜小麦面团的褐变指数[15]。此外，关于生鲜植物食材脱色的技术也取得了实用性的进展。H2O2是食品加工过程中常用的一种漂白剂，具有反应产物无残毒、环境污染小、制作成本低、处理简便等特点，可使萝卜[16]、杏仁[17]和小麦麸皮[18]脱色；AsA为偶合剂，可以将酶促褐变生成的醌双键还原，使其不能再聚合成深色多聚物而对褐变蔗汁脱色[19]。依据上述国内外研究成果，本研究采用不同褐变抑制剂处理新鲜核桃仁，不同脱色措施处理已褐变核桃仁，分别筛选出核桃仁褐变抑制、褐变核桃仁脱色方法，并结合无公害的短波紫外线（ultraviolet radiation C，UVC）杀菌处理和适宜自发气调包装，分析其对鲜核桃仁营养品质及微生物滋生的影响，探究鲜核桃仁的无公害处理和保鲜方法，评价配套工艺对产品低温货架期的影响，为核桃仁成品生产与销售提供理论与技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

选用‘香玲’（Juglance regiacv. Xiangling），2017年9月8日（约核桃雌花盛开后130～135 d）采于陕西省蓝田县核桃良种种植园。2018年9月7日采样，用于补充实验。采摘核桃为未开裂的青皮核桃，核桃大小适中，表皮无明显病虫斑和机械损伤，剪去果柄，2 h内运回实验室，室温下放置12 h散去田间热，再置于（5.0±0.5）℃冷库保存。实验前人工脱去青皮、小心夹除果壳，得到较为完整的核桃仁，用0.01%次氯酸钠浸泡2 min消毒，再用无菌水冲洗，空干水分，备用。

L-AsA、七水合硫酸亚铁（FeSO4g7H2O）、β-巯基乙醇、过氧化氢（H2O2）、次氯酸钠 国药集团化学试剂有限公司；细菌基础培养基（luria-bertani，LB）北京陆桥技术有限责任公司；马铃薯琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基 北京奥博星生物技术有限公司；无水乙醇、石油醚 成都市科隆化学品有限公司；聚乙二醇辛基苯基醚（tritonX-100） 天津市登峰化学试剂厂；交联聚乙烯基吡咯烷酮（cross-linked polyvinylpyrrolidone，PVPP）、愈创木酚、木瓜蛋白酶、没食子酸丙酯（propyl gallate，PG） 北京索莱宝生物科技有限公司；邻苯二酚 上海阿拉丁试剂有限公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetie acid，EDTA） 成都市科龙化工试剂厂；L-苯丙氨酸 郑州科邦生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

聚乙烯（polyethene，PE）30包装袋（即厚度30 μm低密度PE袋） 天津国家保鲜工程中心；TMZ06E-Y20石英紫外线灯管 北京好特光紫外线科技有限公司；UVC-254型紫外线强度计 上海旭常工业设备有限公司；CR-400色差仪 日本柯尼卡美能达公司；UV-3100紫外-可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；TP-114万分之一天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抑制褐变处理

以贮藏期在1 个月内的新鲜核桃仁（L*值接近48）为试材，准备若干份，每份10 个，分别进行以下处理：1）取4 份核桃仁，分别采用质量分数0.5%、1.0%、1.5%、2.0% AsA和0.05%柠檬酸（citric acid，CA）溶液浸泡处理5 min；2）取4 份核桃仁，分别采用质量分数0.05%、0.10%、0.20%、0.30% PG浸泡处理5 min；3）取2 份核桃仁，分别于50 ℃加热1 min和3 min；4）取4 份核桃仁，分别采用质量分数为0.005%、0.010%、0.050%、0.100%的木瓜蛋白酶浸泡处理10 min，温度40 ℃，pH 6.0。

1.3.2 脱色处理

将于（5.0±0.5）℃冷库贮藏1 个月以上的散装青皮核桃分批取出，室温（25 ℃）下放置7～10 d，剥取核桃仁，得到发生了一定程度褐变（L*值小于35）的核桃仁试材，准备若干份，每份10 个，分别进行以下处理：1）取3 份核桃仁，分别在不同温度（20、30、40 ℃）下采用1.0% AsA浸泡1 h；2）取2 份核桃仁，分别采用0.5%、1.0% H2O2浸泡处理5 min。

以上抑制褐变和脱色处理，均以相同温度下去离子水浸泡相同时间为对照组。处理完毕将核桃仁放置于室温（20 ℃）下，并用PE30袋包装但不封口，0、1、2、3、4 d时测定核桃仁的色差值。

1.3.3 保鲜效应观测

1.3.3.1 抑制褐变效果观测

从1.3.1节单因素试验中选取最佳的抑制褐变处理，分别单独和复合1 kJ/m2UVC杀菌，得到抑制褐变后杀菌和不杀菌两个处理组，PE30袋密封包装，模拟低温货架期，于（5.0±0.5）℃下存放。以去离子水浸泡、PE 30袋密封包装为对照组。

1.3.3.2 脱色效果观测

从1.3.2节单因素试验中选取的最佳脱色处理，分别单独和复合1 kJ/m2UVC杀菌，得到脱色后杀菌和不杀菌两种处理组，PE30袋密封包装，置于（5.0±0.5）℃存放。以去离子水浸泡、PE30袋密封包装为对照组。

以上两大组实验中，各处理均分装足够袋数，PE30袋规格为15 cmh19 cm，每袋分装10 个核桃仁。处理完毕后，统一置于（5.0±0.5）℃冷库，模拟低温货架期贮存。在0、7、14、21、28、35 d和56 d时各随机抽取3 袋，每袋每个核桃仁取1/2切为0.5 cmh0.5 cmh0.5 cm碎块，混匀，液氮速冻，保存于－80 ℃，留待测定含油率、酸价、过氧化值（peroxide value，POV）、PPO、POD、PAL活力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）清除率、总抗氧化能力（ferric reducing/antioxidant power，FRAP）。0 d的初始样品和各处理组21、35、56 d另取3 袋用于微生物检测。

以上实验所用到PE30包装袋和1 kJ/m2UVC处理条件均为前期实验[20]筛选所得。

1.3.4 测定指标与方法

1.3.4.1L*值测定

采用CR-400色差仪进行测定。每组样品在分心木处掰开，对最平整的两个内面各测一次，读取亮度（L*）。

1.3.4.2 微生物检测

参考GB 4789.2ü2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[21]方法进行，稍有改动。每重复中随机抽取5 个核桃仁样品，称质量（约40 g），加入100 mL无菌水，充分振荡后取出样品，进行10、100 倍梯度稀释。取每一梯度稀释液1 mL涂布到LB平板培养基，（37±1）℃培养96 h，计录细菌菌落数；另取每一梯度稀释液1 mL涂布到PDA培养基上，在（28±1）℃培养7 d，记录霉菌菌落数。各测定均重复6 个平板培养皿，每处理的细菌和霉菌数量均为6 次重复的平均值。微生物数量用以下公式计算。

1.3.4.3 核桃仁油脂品质指标测定

含油率和酸价参考GB 5009.229ü2016《食品安全国家标准 食品中酸价的测定》[22]方法测定；POV测定参考GB 5009.227ü2016《食品安全国家标准 食品中过氧化值的测定》[23]方法。

1.3.4.4 PPO活力测定

参考Yan Shijie等[24]方法，略有改动。称取0.5 g核桃仁，加0 ℃预冷的提取液（含0.1 mol/L pH 6.8磷酸缓冲液、质量分数1% TritonX-100和4% PVPP），冰浴条件下研磨成匀浆，定容至9 mL，4 ℃ 10 000hg离心30 min。上清液即为酶提取液，5 ℃低温保存备用（当天提取当天使用）。

反应液中加入2 mL磷酸缓冲液、2 mL 50 mmol/L邻苯二酚和0.5 mL酶提取液，410 nm波长处测定吸光度变化。以反应体系每分钟吸光度变化0.1为1 个酶活力单位（U），结果以U/g（鲜质量）表示。

1.3.4.5 POD活力测定

参考Fang Wei等[25]方法，略有改动。酶提取液与上述PPO测定合用，反应体系中加入1 mL 0.1 mol/L pH 6.8磷酸缓冲液、3 mL 50 mmol/L愈创木酚，1 mL酶提取液和1 mL 0.2% H2O2，于470 nm波长处测定吸光度，以反应体系每分种吸光度变化0.01为1 个酶活力单位（U），结果以U/g（鲜质量）表示。

1.3.4.6 PAL活力测定

参考Li Hua等[26]方法，略有改动。称取0.3 g核桃仁，加预冷提取液（含0.1 mol/L pH 8.8硼酸缓冲液、质量分数4%聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）、5 mmol/Lβ-巯基乙醇、2 mmol/L EDTA），冰浴条件下研磨成匀浆，4 ℃、10 000hg离心30 min。收集上清液备用。反应体系中加入2 mL 0.1 mol/L pH 8.8硼酸缓冲液、1 mL 20 mmol/LL-苯丙氨酸和1 mL酶提取液，37 ℃温育1 h。于290 nm波长处测定吸光度，以反应体系每小时吸光度变化0.01为1 个酶活力单位（U），结果以U/g（鲜质量）表示。

1.3.4.7 AsA抑制PPO动力学参数测定

同1.3.4.4节，分别提取鲜核桃种皮和核桃仁的PPO酶液，测定PPO活力。反应体系由2 mL磷酸缓冲提取液、2 mL邻苯二酚底物液（浓度分别为0、0.02、0.04、0.05、0.067、0.08 mol/L和0.1 mol/L）、1 mL AsA溶液（质量分数0、0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）和0.5 mL酶提取液组成，测定420 nm波长处不同浓度邻苯二酚和不同浓度AsA组合反应液的吸光度，计算酶活力。以邻苯二酚浓度的倒数（1/[S]）为横坐标，反应速率的倒数（1/V）为纵坐标，绘制Lineweaver-Burk双倒数图，每条斜线与X轴的交点即为酶与底物的亲合常数的倒数（1/Km），与Y轴的交点即为各组溶液酶促反应的最大速率倒数（1/Vmax），读取两交点值可计算各AsA浓度下PPO反应的Km和Vmax。

1.3.4.8 DPPH自由基清除活性测定

称取0.3 g核桃仁，95%乙醇溶液中冰浴研磨成匀浆，定容至2 mL，4 ℃ 10 000hg离心30 min。收集上清液备用。反应体系中加入100 µL上清液，黑暗处静置30 min，于517 nm波长处测定吸光度，参考闫家凯等[27]方法计算DPPH自由基清除率。

1.3.4.9 总抗氧化活性测定

总抗氧化活性（ferric reducing/antioxidant power，FRAP）测定参考郭长江等[28]的方法，略有改动。称取0.3 g核桃仁，体积分数50%乙醇溶液中冰浴匀浆，定容至2 mL。4 ℃ 10 000hg离心30 min。反应体系中加入0.2 mL提取液和3 mL FRAP工作液，混匀后于37 ℃温育10 min，593 nm波长处测定吸光度。以0.1～1.6 mmol/L FeSO4取代提取液反应测定吸光度，制作标准曲线，根据提取液反应后吸光度所对应的FeSO4物质的量计算样品的FRAP，单位为mmol/g（鲜质量）。

1.4 数据处理与分析

采用Excel 2007软件处理数据、作图，采用SPSS 18.0软件邓肯氏（Duncan）多重比较进行数据差异显著性分析，数据表示为平均值±标准差，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同抑制褐变处理对核桃仁色值的影响

对比了4种方法对鲜核桃仁褐变的抑制作用，如图1A所示，处理后室温下4 d的观测期内，不同质量分数AsA（0.5%～2.0%）＋0.05% CA处理均减缓了种皮亮度（L*）的下降速率，L*值全程高于对照组，且第2天及以后各处理组的观测值均与对照组差异显著（P＜0.05）；4种质量分数条件下，1.0% AsA＋0.05% CA处理在1～4 d均维持了最高水平的L*值，且与1.5% AsA＋0.05%CA处理差异不显著。可见，该处理有效延缓了核桃仁颜色的加深变化，保持了较高的亮度，表现出抑制褐变效应，处理适宜质量分数为1.0%～1.5% AsA，与Goyeneche等[29]在AsA用于鲜切胡萝卜褐变抑制中得到的最适用量范围一致。考虑到药剂用量越少成本越低，选1.0%AsA＋0.05% CA处理为抑制褐变的最佳处理。

图1B显示，0.005%～0.050%的木瓜蛋白酶处理尚可延缓核桃仁亮度下降，在1～4 d期间L*值总体显著大于对照组（P＜0.05），且0.050%木瓜蛋白酶处理效果最佳。质量分数高至0.100%则效应消失。Yang Tianyi等[15]在面团脱色研究中得出木瓜蛋白酶抑制酚氧化的最佳质量分数为0.01%，不同材料的木瓜蛋白酶最佳用量略有差异。

从图1C可知，0.05%～0.30% PG处理较对照组均未能减少核桃仁L*值的下降速度，相反，PG处理均不同程度地促进了亮度的下降，0.10%和0.30% PG组在3、4 d时与对照组差异显著（P＜0.05），0.05%和0.20% PG组则于1、2、3、4 d的4 个观测点下均与对照组差异显著（P＜0.05）。说明PG处理不但不能抑制核桃仁变色，反而加快褐变，与其他水果材料得到的结果[11-12]不一致。

由图1D可见，50 ℃加热1 min的L*值在2 d时显著大于对照组（P＜0.05），在3、4 d时L*值显著小于对照组（P＜0.05），说明50 ℃加热1 min在短期内可以抑制核桃仁变色，但随着贮藏时间延长，抑制效应消失，并加速褐变。50 ℃加热3 min处理的L*值在0～3 d时与对照组无显著差异，在4 d时还显著小于对照组（P＜0.05）。50 ℃短暂加热只有2 d内起到较弱的延缓褐变的作用，2 d后褐变加剧。50 ℃加热3 min便失去抑制褐变作用，由于加热时间再长会造成核桃仁熟化和变味，因此，实验中没有观测更长时间的加热效应。可见，50 ℃热水处理易造成鲜核桃仁热伤害而总体加速褐变。

图1 不同浓度抗坏血酸（A）、木瓜蛋白酶（B）、PG（C）和加热处理（D）对核桃仁亮度（L*）的影响Fig. 1 Effect of different concentrations of ascorbic acid (A), propyl gallate (B) and papain (C) or heating (D) on brightness (L*) of walnut kernels

2.2 不同脱色处理对核桃仁色值的影响

采用已发生明显褐变，L*值低至33.8左右的核桃仁，经不同温度下1.0% AsA溶液浸泡处理，由图2可见，处理后当时的核桃仁褐变便得到不同程度脱除，表现为L*值均显著增大（P＜0.05），并在室温货架期保持至4 d。20 ℃和40 ℃处理较30 ℃的脱色效果更显著，并且40 ℃处理的L*值在货架期持续保持最大（P＜0.05）；20 ℃处理于货架1 d后降为30 ℃同等水平。两种浓度H2O2处理均降低了核桃仁的L*值（P＜0.05），在之后0～1 d内逐渐恢复到对照组水平，3 d时0.5% H2O2处理组显著低于对照组（P＜0.05）。说明H2O2处理暂时增加了核桃仁褐变程度，并以0.5%较1.0% H2O2促进褐变作用更强。总体上，依据L*值的提升和保持能力看出40 ℃ 1.0% AsA处理的脱色和抑制褐变能力最强，可是，在之后4 d货架期中该组核桃仁出现霉变，表明40 ℃下核桃仁受到损伤，自身抗菌能力下降，降低了货架期保鲜能力，因而选择脱色效果仅次于它的20 ℃下1.0% AsA溶液为最佳处理条件。

图2 不同脱色处理的核桃仁色值Fig. 2 Effect of different decolorization treatments on brightness (L*)value of walnut kernels

2.3 抑制褐变及脱色处理对核桃仁低温货架期褐变相关酶活力影响

2.3.1 对鲜核桃仁PPO、POD、PAL活力的影响

如图3A所示，抑制褐变组的各处理核桃仁于低温（5 ℃）货架存放过程中，PPO活力整体呈上升趋势。抑制褐变剂（1.00% AsA＋0.05% CA）单独处理和与UVC的复合处理均对PPO活力升高具一定抑制作用，28 d前单独处理均显著低于对照组（P＜0.05），35 d后复合处理的抑制作用更强，显著低于单独处理，且PPO活力只有对照组的1/2，复合处理表现出较单独处理对PPO活力更持久性抑制效果。

如图3B所示，脱色处理组中，PPO活力整体也呈现上升趋势，7 d后复合处理的PPO活力持续低于对照组（P＜0.05），单独处理在28 d前作用不稳定，并在前期出现暂时促进褐变的现象；因此，脱色处理组亦为复合处理较单独处理的作用更强。

POD也是参与多酚氧化，加促褐变的酶之一，但它需要H2O2作为氧供体，虽然它因消耗H2O2，可以减少活性氧对细胞质膜的破坏[6]。如图3C、D所示，低温货架期，抑制褐变和脱色处理核桃仁的POD活力均呈现起伏式上升趋势，抑制褐变组中脱色单独和复合两处理在28 d前均显著抑制了该酶活力的升高（P＜0.05），末期56 d时，单独处理抑制效果又超过复合处理（图3C）；脱色组中仅单独处理在35 d后对POD活力表现出持续抑制作用，之前两处理的作用均不稳定（图3D）。结果表明，就抑制POD活力而言，无论抑制褐变还是脱色处理效果，均为所选浓度的AsA单独处理作用更强。

由图3E、F可看出，抑制褐变和脱色两组处理中，PAL活力均随货架期的延长而增大。抑制褐变组的单独处理和复合处理在14～21 d其PAL活力均显著高于对照组（P＜0.05）；在脱色组中，单独处理的PAL活力在14～21 d和35 d均显著大于对照组（P＜0.05），复合处理在21 d和35 d显著高于AsA，表明AsA＋CA处理稳定增强了鲜核桃仁货架期PAL活力，UVC有一定的增效作用。

图3 抑制褐变和脱色处理分别对核桃仁低温（5 ℃）货架期PPO（A、B）、POD（C、D）和PAL（E、F）活力的影响Fig. 3 Influence of browning inhibition and decolorization treatments on polyphenol oxidase (A, B), peroxidase (C, D) and phenylalanine ammonia lyase activity (E, F) in walnut kernels during low-temperature (5 ℃) storage

2.3.2 AsA抑制PPO酶动力学分析

如图4所示，种皮和核桃仁的PPO对各浓度底物的氧化反应速率的倒数（1/V）均随AsA浓度的增大而增大，表明V随AsA浓度的增大而递减。各条线相交于第二象限，与X轴的交点随着AsA浓度增大而绝对值减小，意味着1/Km的绝对值减小，Km增大，即PPO对底物的亲合力随AsA浓度增大而减少，同时，各条线与Y轴的交点随AsA浓度增大有微弱增加，AsA在反应液中的出现主要影响PPO对底物的亲和力，对反应最大速率（Vmax）影响较弱，即AsA抑制核桃仁种皮和核桃仁PPO活力的作用类型主要属于竞争性抑制。

图4 不同质量分数抗坏血酸抑制核桃仁种皮（A）和核桃仁（B）PPO活力的Lineweaver-Burk双倒数图Fig. 4 Lineweaver-Burk double reciprocal plots for inhibition of various concentrations of ascorbic acid on PPO activity from walnut seed coat (A) and peeled kernel (B)

2.3.3 对鲜核桃仁DPPH自由基清除率、总抗氧化能力的影响

DPPH自由基清除能力的强弱可以反映果实的抗氧化能力，清除率越大果实的抗氧化能力越强。由图5A、B可见，抑制褐变组和脱色组核桃仁在低温货架期对DPPH自由基清除率均呈波动性变化。抑制褐变实验中，仅单独处理的DPPH自由基清除率于28、56 d显著低于对照组（P＜0.05），复合处理也于14、28 d均显著低于对照组（P＜0.05），其他观测点两处理与对照组没有显差异（P＞0.05）；脱色处理中，复合处理较AsA＋CA单独处理表现出一定的增强DPPH自由基清除能力的作用，在21 d前和35 d保持DPPH自由基清除率最高，且35 d与对照组和单独处理的差异显著（P＜0.05）。图5C、D显示，进入货架期，对照组核桃仁FRAP均表现为前7 d增大之后下降。抑制褐变实验中，AsA＋CA处理降低了FRAP。复合处理对FRAP部分时间会促进FRAP升高，21 d时高于对照组；脱色实验中，复合处理组在货架中期21～35 d其FRAP显著大于对照组（P＜0.05），AsA＋CA单独处理组于14 d时显著低于对照组（P＜0.05）。可见，AsA单独处理对核桃仁总抗氧化能力整体起负作用，复合处理具有局部促进作用，UVC在促进核桃仁抗氧化方面的作用强于AsA。

图5 抑制褐变和脱色处理分别对核桃仁低温（5 ℃）货架期DPPH自由基清除率（A、B）、FPAP值（C、D）的影响Fig. 5 Influence of browning inhibition and decolorization treatments on DPPH scavenging capacity (A and B) and FRAP values (C and D) of walnut kernels during low-temperature (5 ℃) storage

2.3.4 抑制褐变和脱色处理对鲜核桃仁品质变化和微生物生长的影响

表1列出不同处理的核桃仁5 ℃（低温）货架期各品质指标取值和微生物数量的变化，对照组核桃仁的亮度（L*值）随货架期的延长下降明显，抑制褐变组两处理在前21 d几乎没有下降，21～56 d降幅也只有对照组的1/3以下，使处理核桃仁在56 d时仍呈浅黄色，对照组已成为深褐色（图6）；脱色处理组，在处理完毕时L*值提高7.4%，且在货架21 d内继续有所增大，21～56 d内小幅下降，终期56 d时处理核桃仁的L*值远远大于对照组，呈浅黄色，对照组已成为褐黄色（图7）。两组实验中，与对照组相比，UVC复合处理组均减少了56 d时样品酸价的上升幅度，其他时间差异不显著（P＞0.05）；抑制褐变实验中单独处理对酸价的影响与复合处理一致，脱色实验组中单独处理影响不显著（P＞0.05）。表明UVC较AsA在抑制核仁酸败中发挥了更重要的作用。抑制褐变实验中，单独和复合处理总体有促进POV上升的趋势，虽然21 d时处理组与对照组差异均不显著（P＞0.05），35 d时单独与复合处理均显著高于对照组（P＜0.05），56 d时复合处理POV进一步增大，与对照组差异显著（P＜0.05）；脱色实验组的复合处理在56 d时POV显著高于对照组（P＜0.05）。

两组实验中，处理组和对照组核桃仁低温货架56 d均未发生肉眼可见霉变（图6、7）。经微生物检测可知，新剥取的核桃仁自带细菌。无论抑制褐变处理还是脱色处理，两种处理后细菌数均大幅减少或检测不出，说明浸泡处理对核桃仁有清洁作用。货架中期（21 d），两组实验中的处理核桃仁仍然保持着细菌数量显著低于对照组的状态；但贮存至35 d和56 d，AsA＋CA单独处理都较对照组促进了霉菌的滋生，UVC复合处理抵消了这一效应，使处理核桃仁在35 d时霉菌数显著低于对照组（P＜0.05），56 d时差异不显著。60～70 d间对照组和处理组陆续出现可见霉变，不可再存。低温货架21 d时，各组核桃仁风味正常可食，56 d时两组实验中对照组具有轻微的酸苦味，两个处理组仍正常可食。

表1 不同处理的核桃仁低温货架期品质变化的影响Table 1 Effects of different treatments on quality attributes of walnut kernels stored at low temperatures

图6 抑制褐变处理核桃仁低温货架前后状态Fig. 6 Appearance of walnut kernels subjected to browning inhibition before and after low-temperature storage

图7 脱色处理核桃仁低温货架前后状态Fig. 7 Appearance of decolorized walnut kernels before and after lowtemperature storage

3 讨 论

3.1 核桃仁抑制褐变（护色）和脱色方法相似的原因分析

核桃仁种皮的L*值在货架期间逐渐变小，核桃仁色泽逐渐变深，这与徐赛等[30]发现的常温下贮藏荔枝L*值随着贮藏时间的延长而减小，荔枝的亮度逐渐降低的现象一致，属于典型的酶促褐变现象。PG富含酚羟基，食品上推荐用于油脂类产品抗氧化。本研究中0.05%～0.3% PG反而促进了核桃仁颜色的加深，与前人在龙眼[11]和高新梨[12]上取得结果不一致。由于0.01% PG自身产生颜色效应，且GB 2760ü2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》规定其用量不得超过0.1 g/kg[31]，因此推测，供试浓度PG自身的着色效应大于其抑制PPO而产生的减色效应，不适合用于核桃仁此类非呈色产品，更高浓度PG处理将超越国家标准要求，也不必进一步实验；热处理在其他果实上取得抑制褐变的明显效果[13]，本实验取得了类似结果，只是产生了风味和质地的改变，表明核桃仁对热敏感，遇热易于软化和熟化等，不宜采用。蛋白酶可以使催化酶促褐变的酶系失活，其中木瓜蛋白酶是一种使用较普遍的褐变抑制剂[15]。但本研究中其效果不及AsA，可能与该酶最适作用温度为55～65 ℃[32]，而本研究却在20 ℃下应用有关。此外，木瓜蛋白酶处理后的核桃仁因蛋白质受损、仁衣易于碎化、产品外观整齐度降低而效果不理想（资料未显示），表明该酶更适合用于液体或面食等非有形食材的脱色。AsA是一种常见的褐变抑制剂，许彬[33]和连文绮[34]等研究发现其在抑制马铃薯、板栗和鲜切苹果褐变都具有较好的效果；本研究结果表明，0.5%～2.0% AsA附加其强化剂CA处理5 min均可抑制核桃仁褐变，与马铃薯等材料上取得的结果一致。0.5% AsA＋0.05% CA在56 d低温货架期维持了最高水平的L*值，在所有处理中效果最佳。本研究发现，AsA作为PPO的竞争性抑制剂能够降低PPO对多酚氧化反应的活力，故而在抑制褐变实验中，使未发生褐变或轻微褐变的核桃仁的L*值下降延缓。

H2O2作为一种氧化型漂白剂在食品中应用广泛，其作用原理是利用H2O2与生色基团或色素反应，破坏色素基团[18]。H2O2通过氧化破坏木质素，可使纤维素及其产品成功脱色[17-18]。本研究在脱色方法的筛选中，0.5%和1.0% H2O2处理未能使褐变的核桃仁脱色，相反增加了核桃仁L*值，即褐变程度加重，这与H2O2破坏细胞分区隔室，促进酚类氧化反应有关[35]。这一结果也间接说明核桃仁种皮褐色物积累不含有木质素形成因素。AsA作为强还原剂，供给氢质子，使初级褐变产物醌还原为酚而褪色。甘伯中等[36]曾报道0.005% AsA可使枸杞汁脱色，本实验采用1.0% AsA浸泡1 h发现核桃仁L*值显著增大，证实了AsA对固态植物组织也具脱色效应，其后续56 d低温货架期L*值一直显著低于对照组，表明该作用具有持续性。处理温度升高至40 ℃增进了脱色效果，显示AsA将醌还原为酚的反应受加热促进，但又会使核桃仁出现轻微破损而削弱对微生物的抗性，故1.0% AsA于20 ℃下浸泡1 h是核桃仁脱色处理的最佳选择。因此，AsA既被选为最佳的抑制褐变剂，也是有效的脱色剂，是可应用于生产的一种实用处理方法。

3.2 AsA抑制核桃仁氧化酶和促进抗氧化活性作用的差异性

本研究测定发现，核桃仁在低温货架期，其PPO、POD活力持续上升，抑制褐变或脱色处理下该两酶活力全程或部分被抑制，与范灵姣等[37]在柿果实、侯晓婉等[38]在菠萝上得到的结果一致。附加UVC的复合处理对上述两种酶活力抑制作用有加强趋势，表明附加适宜剂量UVC处理也强化了对核桃仁氧化酶的抑制作用，许斌等[39]对黄蘑菇的研究得出，UVC照射增强了植物材料对逆境的适应性，减少活性氧产生，而降低氧化酶活力。其他对植物的研究大多得出AsA含量升高或外源AsA处理促进植物抗氧化活性的结果[40-41]，本研究发现，AsA单独处理或与UVC复合处理均仅在局部阶段提高了DPPH自由基清除率和增强了总抗氧化能力（FRAP），这两种处理在脱色组增强抗氧化能力的作用强于抑制褐变组。由于抑制褐变材料仅轻微褐变（L*值为43.04），自身DPPH自由基清除率高（约80%）；脱色组材料褐变重（L*值为38.72），DPPH自由基清除率有所降低（约65%），可以推断，未褐变或轻微褐变的新鲜核桃仁其抗氧化物质含量接近饱和，外源AsA处理难以再产生增效；贮存后发生了一定程度褐变的核桃仁则可能因自身还原物质的亏缺，对外源AsA响应较为灵敏。且褐变的核桃仁经处理后，除了AsA促进其醌类氧化产物还原为无色化合物外[18]，其抗氧化活性也有所增强，有利于持续抑制氧化反应，从而表现出脱色效应的持久性。

3.3 抑制褐变处理与核桃仁品质保持及微生物控制的关系

PAL对植物的抗病性具有重要作用[6]。AsA处理也显著增强了货架中前期（14～21 d）PAL活力，与Song Mubo等[42]在菱角上得到的结果一致。可是，依据AsA处理促进霉菌滋生的结果，虽然该处理促进了苯丙氨酸途径的合成作用，可能导致总酚含量升高，却不足以达到在抵抗微生物侵染方面的显著作用。因此，在以AsA为主剂的抑褐或脱色处理中，附加无公害的UVC或其他杀/抑菌处理是必要的。

油脂含量是评价核桃仁品质的重要指标，核桃仁中富含人体不能合成的亚麻酸、亚油酸等不饱和脂肪酸，是其营养与保健功效的重要成分[4]。结果表明，既使在低温贮藏条件下，核桃仁油脂也在发生着大幅度的降解，56 d最大降幅为20%（抑制褐变组的对照组），这与Ma Yanping等[43]在脱青皮湿鲜核桃气调贮藏中取得的结果接近，他们测得‘西扶1号’核桃低温（0 ℃）贮藏60 d，油脂含量下降25%。综上，鲜食核桃贮藏期油脂作为呼吸基质消耗较快。本研究中抑制褐变的两种处理和脱色实验的复合处理均减少了油脂酸价的升高量。推测AsA除抑制氧化酶活力外，还作为活性氧清除剂和UVC杀菌作用相叠加，共同发挥了减少活性氧积累的作用，有利于油脂分解和游离脂肪酸降解均衡进行，较对照组的酸败产物积累少。但在货架时间达35 d后，复合处理显著促进了POV的升高，POV表征脂肪酸被氧化后积累的氢过氧化物含量[44]，这种UVC处理促进油脂过氧化物产生，却抑制酸价的正、负效应共存的现象鲜见报道，值得进一步研究。然而，GB 2716ü2018《食品安全国家标准 植物油》中规定，含油食品中油脂的酸价和POV分别不得超过4 mg/g、0.25 g/100 g[45]，本研究中各组样品的酸价和过氧化值均远远低于超标临界值，均不构成对品质影响的风险。

4 结 论

本研究进行了新鲜核桃仁抑制褐变方法和褐变核桃仁脱色方法两大组实验，筛选出1.0% AsA＋0.05% CA浸泡5 min为最佳抑褐处理条件；1.0% AsA 20 ℃浸泡1 h为最佳脱色处理条件。两种最佳处理条件单独、或与1 kJ/m2UVC复合，可在5 ℃低温下将核桃仁保持在浅黄色56 d以上，且脱色组（褐变核桃仁为原料）效果接近抑制褐变组（未褐变）核桃仁的色泽（L*值）。

抑制褐变、脱色单独和复合处理部分抑制了货架期核桃仁的PPO、POD活力，减缓核桃仁褐变，抑制酸价上升，增强总抗氧化能力，抑制细菌的生长。复合处理延迟了霉菌滋生，使鲜核桃仁在56 d时仍风味正常，对照组已经不可食用。本研究确定了长达56 d的鲜核桃仁保质方法，同时也为褐变失鲜核桃仁的复鲜生产提供了理论与技术支撑，可用于延长鲜核桃仁货架期。