超声-咖啡酸联合处理对海鲈鱼冷藏期间品质变化的影响

官 缘，蓝蔚青,2,*，孙雨晴，刘 琳，周大鹏，谢 晶,2,*

（1.上海海洋大学食品学院，上海 201306；2.上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心，食品科学与工程国家级实验教学示范中心（上海海洋大学），上海 201306）

海鲈鱼（Lateolabrax japonicas）又名花鲈、鲈板等，是我国重要的经济鱼类之一，主要分布于黄海、渤海地区，其中日本海及渤海、黄海地区为主产地[1]。鲈鱼肉质紧致、味道鲜美，富含蛋白质、不饱和脂肪酸与微量元素等营养成分，深受消费者喜爱[2]。我国于20世纪60年代开始海鲈鱼养殖，到70年代已实现批量生产，2019年的海水养殖量已达18万 t[1]。然而，水产品在流通过程中受微生物与内源酶影响，易发生腐败变质。因此，保证其质量并延长货架期已成为海鲈鱼等水产品发展的难点问题，极有必要寻求一种简便有效的保鲜方法来保证其新鲜口感和质量安全。

超声（ultrasonic，US）是一种新型加工处理技术，因其绿色简便、安全性高等优点被逐渐用于食品保鲜[3]。其中，Pedrós等[4]用30 kHz超声处理鲭鱼45 min，发现其可显著减少微生物数量，维持鱼肉水分；周大鹏等[5]采用20 kHz、600 W超声处理海鲈鱼10 min，得出其能延缓鲈鱼冷藏期间的pH值，增加其嫩度。咖啡酸（caffeic acid，CA）是人类饮食中天然存在的羟基肉桂酸，其结构简单、代谢迅速，可预防或治疗心血管疾病、癌症或各种炎症[6]。咖啡酸具有较好的还原性，能有效清除体内氧化物[7]；同时，其通过离子键、氢键与细菌多亚基蛋白作用，可实现抗菌功能[7]。唐森等[8]用2.0 g/L的壳聚糖-咖啡酸衍生物对鲈鱼进行涂膜处理，发现其可显著抑制微生物繁殖，延缓鱼肉腐败。咖啡酸除了用于医药领域，其良好的生物活性在食品领域也将成为新的研究热点[7]。现有研究表明，单一超声处理并不能完全抑制鱼体中腐败微生物的繁殖，超声辅助处理可促进保鲜剂向细胞内渗透，延长其货架期[9]。Yu Dawei等[10]研究发现，40 kHz超声辅助1.0 g/L壳寡糖涂层用于鲤鱼片的冷藏保鲜，其抑菌能力比两者单独处理的效果更佳。

目前，鲜有关于超声结合生物保鲜处理的研究，基于此，本实验拟采用超声结合咖啡酸处理海鲈鱼，通过测定微生物指标（菌落总数）、理化指标（pH值、总挥发性盐基氮（total volatile base nitrogen，TVB-N）含量、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）值、质构特性与持水力），结合内源荧光强度分析与感官评价，综合探讨超声结合咖啡酸处理对冷藏鲈鱼的保鲜效果，以期为通过超声与生物保鲜剂联用技术延长水产品保质期提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活海鲈鱼（Lateolabrax japonicas）购自上海市浦东新区临港农工商超市，样品体长（34±2）cm、质量（500±30）g，30 min内运回实验室进行实验。

平板计数琼脂（plate count agar，PCA） 青岛海博生物技术有限公司；轻质氧化镁、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、冰乙酸、三氯甲烷、碘化钾、可溶性淀粉、石油醚、氯化钠、盐酸等（均为分析纯） 上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

KQ-300DE型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；Kjeltec8400型凯氏定氮仪 丹麦FOSS公司；H-2050R型冷冻离心机 湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；FE20型pH/ORP计 上海而立环保科技有限公司；F-7100型荧光分光光度计 日本日立公司；TA.XT Plus型质构仪 英国Stable Micro Systems公司。

1.3 方法

1.3.1 原料处理

将海鲈鱼放入盛满碎冰的泡沫箱中猝死，除去头部与内脏，由中部切分成两片，置于无菌蒸馏水中清洗干净，沥干水分，随机分为5 组：超声处理组（US组）、咖啡酸处理组（CA组）、超声-咖啡酸联合处理组（US＋CA组）、空白组（CK组）、对照组（AA组）。US组利用20 kHz、600 W超声处理10 min；CA组使用2.0 g/L咖啡酸（使用1%（体积分数，下同）乙酸溶解）浸渍10 min，US＋CA组超声（20 kHz、600 W）5 min后，用2.0 g/L咖啡酸（使用1%乙酸溶解）浸渍5 min[11]；CK组和AA组分别以无菌水和1%乙酸浸渍处理10 min。将5 组样品处理后沥干，装入聚乙烯保鲜袋中，置于4 ℃冷藏，每2 d测定相应指标。实验过程中，各指标取样部位保持一致。

1.3.2 菌落总数测定

菌落总数参照GB 4789.2ü2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》[12]进行测定。

1.3.3 pH值测定

参考GB 5009.237ü2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[13]测定样品pH值。将5 g碎鱼肉加至45 mL蒸馏水，均匀静置30 min后过滤，测定滤液的pH值，平行测定3 次。

1.3.4 TVB-N含量测定

根据GB 5009.228ü2016《食品安全国家标准 食品中挥发性盐基氮的测定》[14]，称取5 g鱼肉，利用凯氏定氮仪测定其TVB-N含量，每组平行测定3 次，单位为mg/100 g。

1.3.5 TBA值测定

取碎鱼肉5 g，加入20 g/100 mL三氯乙酸溶液25 mL，加入20 mL蒸馏水，匀浆60 s后静置1 h，8 000 r/min离心10 min后过滤，取上清液定容至50 mL，摇匀后取5 mL液体于试管中，与等体积0.02 mol/L TBA混合摇匀，100 ℃水浴20 min，待冷却到室温后用酶标仪测定其在532 nm波长处的吸光度。平行测定3 次，TBA值以每千克鱼肉中含有的丙二醛质量表示，具体按式（1）计算。

1.3.6 质构特性测定

质构特性测定参照冯豪杰等[15]的方法稍作修改。取海鲈鱼背部肉，横向切块（2.0 cmh2.0 cmh1.5 cm），利用TA.XT Plus型质构仪进行测定，每组样品平行测定3 次。

1.3.7 持水力测定

取3 g样品，记录其初始质量为m1/g，放在吸水滤纸中包裹，8 000 r/min下离心10 min，沥干表面水分称质量（m2/g），重复测定3 次。按式（2）计算持水力。

1.3.8 内源荧光光谱测定

内源荧光光谱测定参考Liu Jiali等[16]的方法稍作修改。用磷酸盐缓冲液将肌原纤维蛋白质量浓度稀释至0.1 mg/mL后利用荧光分光光度计进行测定，设置激发波长295 nm，发射波长300～400 nm。

1.3.9 感官评价

采用质量指标法[17]对鲈鱼片进行感官评定。由2 名长期从事鲈鱼研究的实验人员记录冷藏期间鲈鱼的感官变化，最后，选用色泽、气味和质地作为评价指标。选取6 名感官评定人员对鲈鱼片评分。将不同贮藏时间的鲈鱼片进行3 位随机数字编码并告知评定人员，3 个重复，所有指标评分之和即为感官得分，并对未知样品评分进行验证。当感官得分为0时鱼片品质最佳，感官得分升高则表示样品相应劣变。具体评分标准见表1。

表1 鲈鱼质量指标法感官评价标准Tab 1 Quality index methods (QIM) scheme for sensory evaluation of Lateolabrax japonicas

1.4 数据处理与分析

使用Origin 2018 64Bit软件绘制曲线，由SPSS 19.0统计软件进行数据处理，采用Duncan 新复极差法进行方差分析和多重比较，结果以平均值±标准偏差的形式表示。

2 结果与分析

2.1 海鲈鱼冷藏期间菌落总数的变化

水产品在流通销售过程中，由于微生物的作用，鱼肉中的蛋白质与氨基酸会分解产生腐胺化合物等腐败特征物质[18-19]。因此，微生物数是评价水产品品质的重要指标[20]。

由图1可知，海鲈鱼贮藏前期的菌落总数缓慢增长，在贮藏后期明显升高。其中以CK组样品的菌落总数增幅最快，在贮藏第8天时的菌落总数达（6.69±0.07）（lg（CFU/g）），而此时的AA、US、CA、US＋CA组样品的菌落总数分别为（6.38±0.05）、（6.19±0.06）、（5.91±0.02）（lg（CFU/g））与（5.76±0.08）（lg（CFU/g））。根据GB 10136ü2015《食品安全国家标准 动物性水产制品》可知，菌落总数为6（lg（CFU/g））时，产品即达到腐败限值。因此，CK组在第8天已达到腐败限值；而CA组与US＋CA组于第10天达到腐败限值，在第10天时，CA组与US组样品的菌落总数比CK组分别低18.49%、15.53%，这是由于酚类化合物会通过破坏细菌细胞膜、与细胞酶相互作用达到抑菌效果[21]。在贮藏第14天时，CA与US组样品的菌落总数分别为（7.04±0.04）（lg（CFU/g））与（7.24±0.04）（lg（CFU/g））。由于超声的空化效应能产生较高的局部温度和压力，使生物细胞和酶变性，并通过物理损坏细胞壁或细胞膜而达到灭菌作用[22]；当用超声结合咖啡酸处理时，贮藏末期的菌落总数为（7.03±0.09）（lg（CFU/g）），其抑菌强度较单一处理组更高，可能由于超声结合咖啡酸处理具有协同效应[21]。样品的菌落总数在贮藏第0天时略高于余小亮[23]的实验结果，贮藏过程中菌落总数的上升速度略快于李颖畅等[24]的研究结果，可能由于文献[23-24]中的实验均采取原鱼冷鲜方式，减少了因鱼肉体表损伤而造成的细菌污染。

图1 不同处理方式对海鲈鱼冷藏期间菌落总数变化的影响Fig. 1 Changes in TVC in Lateolabrax japonicas under different treatments during refrigerated storage

2.2 海鲈鱼冷藏期间pH值的变化

pH值是衡量水产品是否新鲜的重要指标之一。鱼死后先后经历僵直、解僵、自溶与腐败等阶段。其在僵直阶段时，体内的糖原经糖酵解生成乳酸、丙酮酸等酸性物质，使pH值降低[25]；贮藏后期，鱼肉蛋白质会在微生物和内源酶的作用下分解成小分子的三甲胺和胺等物质，导致pH值上升[16]。

由图2可知，鱼肉的pH值随着贮藏时间的延长，呈先减后增的“V型”变化趋势，这与Nie Xiaobao等[26]的研究结果一致。在贮藏前期，鱼体正处于僵直阶段，各组样品的pH值均一定程度下降。其中US＋CA组样品的pH值的最小值（6.76±0.04）明显低于其余各组，可能由于咖啡酸呈酸性，含有较多的游离H＋[17]，而超声对pH值的影响机理尚不清楚。从贮藏第2～6天起，各组样品的pH值逐渐上升，其中US组样品的pH值上升明显，可能是鱼体部分肌肉组织细胞被超声破坏，内部碱性基团暴露，酸性基团埋藏[27]。CA组样品pH值升高较缓，可能由于咖啡酸可解离多个H＋，并抑制微生物繁殖，减缓蛋白质氧化分解[7]。US＋CA组样品直至贮藏末期（14 d）其pH值仍在各组中最低，在贮藏第16天，不同处理方式的鱼片样品pH值大小依次为：US组＞CA组＞US＋CA组。说明超声结合咖啡酸前处理可适当延缓鱼肉的腐败进程。

图2 不同处理方式对海鲈鱼冷藏期间pH值变化的影响Fig. 2 Changes in pH in Lateolabrax japonicas under different treatments during refrigerated storage

2.3 海鲈鱼冷藏期间TVB-N含量的变化

海鲈鱼在贮藏过程中易受内源性蛋白酶和微生物的影响，鱼肉蛋白质分解成三甲胺、胺类等挥发性碱类物质，使其TVB-N含量上升。因此，TVB-N含量是反映水产品鲜度的重要指标之一。根据GB 2733ü2015《食品安全国家标准 鲜、冻动物性水产品》[28]规定，产品TVB-N含量高于30 mg/100 g即不可食用。

如图3所示，随着贮藏时间的延长，各组样品的TVB-N含量逐渐上升。其中CK组TVB-N含量在第10天为（33.88±0.56）mg/100 g，已不可食用；此时，US组、CA组与US＋CA组样品的TVB-N含量分别为（20.51±0.49）、（17.95±0.03）mg/100 g与（16.71±0.41）mg/100 g，仍在可食范围。可见，超声的杀菌[29]和咖啡酸的抗氧化[30]作用均有助于延缓鱼肉腐败；AA组样品的TVB-N含量在整个贮藏期间均高于CA组，其在贮藏第6天后差异显著（P＜0.05）；US＋CA组样品的TVB-N含量在贮藏第8天后低于CA组，且CA、US组TVB-N含量于第14天超过可食范围，此时US＋CA组的TVB-N含量仍在可食范围内。表明超声结合咖啡酸处理可进一步延缓海鲈鱼腐败，这与Yu Dawei等[10]的研究结论一致。

图3 不同处理方式对海鲈鱼冷藏期间TVB-N含量变化的影响Fig. 3 Changes in TVB-N content in Lateolabrax japonicas under different treatments during refrigerated storage

2.4 海鲈鱼冷藏期间TBA值的变化

TBA值是反映鱼肉脂质氧化程度的重要指标[31]。由图4可知，新鲜鱼肉的TBA值为（0.033±0.002）mg/kg。随着贮藏时间的延长，各组样品的TBA值呈上升趋势。CK组样品在第10天时的TBA值达到（0.116±0.007） mg/kg，在第14天时，US组、CA组与US＋CA组样品的TBA值分别为（0.098±0.002）、（0.090±0.002）mg/kg与（0.079±0.002）mg/kg，TBA值升高主要与鱼肉脂肪酸氧化的第二阶段有关，在此期间过氧化物分解产生丙二醛等挥发性物质，使鱼片产生哈喇味[32]。CK组样品的TBA值在贮藏6天后迅速增加，此变化趋势与菌落总数一致。可能由于细菌的快速生长加速了鱼肉的脂肪氧化；其中US组的TBA值在第8天后均低于US＋CA组，可能是因为咖啡酸为酚类化合物，可作为单态氧淬灭剂、还原剂和氢供体，具有抗氧化特性，能有效延缓油脂初级产物氧化生成丙二醛，降低鱼肉的TBA值[30]。在整个贮藏期间，AA组样品的TBA值均高于CA组，可能由于酚酸的抗氧化能力强于乙酸，该结果与张霁红等[33]的研究结论一致。

图4 不同处理方式对海鲈鱼冷藏期间TBA值变化的影响Fig. 4 Changes in TBA value in Lateolabrax japonicas under different treatments during refrigerated storage

2.5 海鲈鱼冷藏期间质构特性的变化

如表2所示，各组样品的硬度、咀嚼性均随着贮藏时间的延长先升高后降低。硬度上升的原因可能是鱼体死后进入僵直期。随着贮藏时间的延长，微生物快速繁殖，鱼体进入解僵阶段[34]，肌肉变得柔软，硬度随之下降；与CK组相比，US组样品在0～10 d内的硬度整体上更低，原因在于超声波的空穴效应会使肌肉内部的压力与冲力急剧增加，破坏蛋白质的空间结构与完整性，一定程度上降低肌肉蛋白的机械性能[35]；在整个贮藏期间，CA组与US＋CA组样品的硬度、弹性与咀嚼性均高于CK组，可能由于咖啡酸的抑菌作用能使鱼体自溶过程减慢[33]，延缓其腐败。

2.6 海鲈鱼冷藏期间持水力的变化

持水力是指通过物理方式截留水分而阻止水渗出的能力。鱼肉蛋白中存在一种三维网状结构，水分子镶嵌其中[8]。在鱼肉腐败过程中，蛋白质分解变性，三维网状结构被破坏，水分子被释放出来，表现为持水力降低。

如图5所示，各组样品在整个贮藏期间的持水力均呈下降趋势。新鲜鲈鱼的持水力为（75.57±0.51）%，此时鱼肉能较好锁住水分。在贮藏第14天时，US组、CA组与US＋CA组样品的持水力分别为（60.03±0.87）%、（59.20±1.03）%与（63.66±0.79）%。CK组持水力下降较快，可能由于微生物快速繁殖、鱼肉蛋白分解变性，水分子被释放[36]。与CK组和AA组相比，CA组样品的持水力更高，可能由于酚酸可与蛋白质形成氢键，影响水的状态[31]；US组样品的持水力高于CK组，主要由于超声处理使鲈鱼蛋白的亲水基团暴露，提高了蛋白与水的结合能力[37]；同时，超声的空穴效应能对肌肉纤维进行拉伸，使肌肉组织结构松散，鱼肉的持水力相应提高[38]。US＋CA组样品在整个贮藏过程中的持水力均最高，表明超声结合咖啡酸具有协同提高鱼肉持水力的作用。

表2 不同处理方式对海鲈鱼冷藏期间质构特性的影响Table 2 Changes in TPA parameters of Lateolabrax japonicas under different treatments during refrigerated storage

图5 不同处理方式对海鲈鱼冷藏期间持水力变化的影响Fig. 5 Changes in WHC of Lateolabrax japonicas under different treatments during refrigerated storage

2.7 海鲈鱼冷藏期间内源荧光强度的变化

蛋白质的内源荧光来自其内部的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸3种芳香族氨基酸的残基，其可吸收紫外光并发出荧光。当蛋白质构象改变时，3种残基暴露出来，荧光峰的位置和强度发生相应变化。因此，内源荧光强度被广泛用于测定芳香族氨基酸的暴露程度[39]。色氨酸作为最常用的内源荧光探针存在于肌原纤维的头部和杆部，可通过测定色氨酸的荧光强度来表征蛋白质的展开程度[40]。蛋白质在295 nm处激发波长的固有荧光基本归因于色氨酸，因为295 nm波长处光的照射仅激发色氨酸，并且色氨酸在蛋白质中的位置影响荧光能量[41]。

由图6可知，新鲜鲈鱼（贮藏2 d）的肌原纤维蛋白在336 nm波长处显现出最高的荧光强度，表明此时蛋白质结构完整度较好。随着贮藏时间的延长，各组样品的最高荧光强度均降低。表明鲈鱼在贮藏过程中，其肌原纤维中的色氨酸暴露，蛋白质三级结构发生变化；其中US组样品的最高荧光强度始终高于CK组，可能是超声破坏了蛋白质的疏水区域，使芳香基团暴露，荧光强度增大[42]。随着贮藏时间的延长，蛋白质进一步伸展，色氨酸暴露于溶剂中，产生猝灭作用，荧光强度降低[43]。CA组样品的最高荧光强度低于CK组，可能由于咖啡酸属肉桂酸型衍生物，此结构的酚酸对蛋白具有静态猝灭作用[44]。CA组和US＋CA组荧光峰的位置在贮藏后期发生红移，表明色氨酸从蛋白质内部逐渐暴露于溶剂中。可能是酚酸与蛋白质的结合增强了色氨酸残基微环境的疏水性，使更多色氨酸从蛋白质分子内部的非极性环境中溶出，暴露于溶剂[44]。

图6 不同处理方式对海鲈鱼冷藏期间内源荧光强度变化的影响Fig. 6 Changes in IFI of Lateolabrax japonicas under different treatments during refrigerated storage

2.8 海鲈鱼冷藏期间感官品质的变化

鱼肉的感官品质下降是由细菌引起的一系列生化和氧化反应的结果[45]。由图7可知，随着贮藏时间的延长，各组样品的感官得分逐渐上升，表明鲈鱼品质相应下降。当贮藏至第8天时，CK组样品的色泽暗淡，具有腐臭味，此时各处理组鱼片感官品质明显优于CK组。US组样品的感官得分在整个贮藏期间均低于CK组，可能由于超声处理可延缓鱼肉腐败[43]。其中，US＋CA组样品的感官得分始终低于感官排斥点（10 分），这与Yu Dawei等[10]的研究结果一致。由此可知，超声结合咖啡酸具有协同抗菌作用，能延缓鱼体的腐败变质。与CK组相比，US＋CA处理对鱼肉品质保持效果较好，且可使海鲈鱼的冷藏货架期至少延长4 d。

图7 不同处理方式对海鲈鱼冷藏期间感官品质变化的影响Fig. 7 Changes in sensory score of Lateolabrax japonicas under different treatments during refrigerated storage

3 结 论

与CK组相比，超声、咖啡酸、超声联合咖啡酸处理鲈鱼能抑制微生物的生长，减缓pH值、TVB-N含量与TBA值的升高，保持良好的质构特性。超声处理使鱼肉的保水性明显改善，咖啡酸处理对抑制鱼肉的脂肪氧化有较好效果，其还能使样品的持水力得到较好提升；其中以超声联合咖啡酸处理组样品总体品质最佳。与CK组相比，超声联合咖啡酸处理（超声（20 kHz、600 W）处理5 min结合2.0 g/L咖啡酸浸渍5 min）对鱼肉品质保持效果较好，且可使海鲈鱼的冷藏货架期至少延长4 d。