低聚木糖对慢性腹泻症状的改善作用

王沁玥，仝艳军，刘登洋，吴顺红，刘二停，舒香玲，杨瑞金,*

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.江南大学附属医院，江苏 无锡 214041；3.河南益常青生物科技有限公司，河南周口 466000）

腹泻是一种常见的消化系统疾病，而腹泻症状持续超过4周或反复发作时即为慢性腹泻[1-2]。慢性腹泻多见于慢性肠炎、腹泻型肠易激综合征、炎症性肠病、肠道恶性肿瘤等肠道疾病，以急性感染性腹泻病未彻底治疗、迁延不愈最为常见。慢性腹泻在老年人群中的发病率约为7%～14%[3]，儿童、免疫力低下患者亦为腹泻的高危人群。粪菌移植（fecal microbiota transplantation，FMT）是将健康宿主粪便中的功能菌群，通过口服、灌肠等方式移植到患病宿主肠道内，从而调节肠道菌群失衡，具备治疗肠内外疾病的应用前景[4]，已被用于难辨梭状芽孢杆菌感染、炎症性肠病、顽固性便秘和代谢病等多种疾病的探索性研究和临床治疗[5-7]。

低聚木糖（xylooligosaccharides，XOS）是一类通过促进肠道有益微生物生长或活动从而维持宿主健康状态的益生元，一般由2～7 个木糖分子通过β-1,4-糖苷键聚合而成[8]。XOS和其他的低聚糖相比，最大的优势是稳定性强、耐酸耐热，进入人体后不影响血糖浓度，适合糖尿病、高血压患者服用[9]。XOS增殖双歧杆菌的效果是低聚异麦芽糖、低聚果糖等益生元的20 倍，可以改善肠道动力[10]。XOS还具有抑制肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）-α、白细胞介素（interleukin，IL）-6等炎症因子的产生、改善肠道健康等作用[11]。畜牧业领域，XOS已经用于动物腹泻症状的改善，如断奶仔猪[12]和牛犊等；临床研究中发现，XOS可以缓解孕妇便秘，改善老年人胃肠功能[8]。因XOS应用于临床慢性腹泻的研究还存在许多空白，本研究拟通过随机双盲平行对照临床试验，对3 组患者分别用麦芽糊精、低剂量XOS、高剂量XOS进行干预。30 d后，分析各组患者各项生化指标的变化，随后用3 组患者的粪菌液灌胃3 组小鼠，分析灌胃24 d后小鼠的相关情况，从而评估XOS对慢性腹泻的效果，为慢性腹泻症状的治疗和预防打开新的思路。

1 材料与方法

1.1 动物、材料与试剂

6周龄雄性SPF级的昆明小鼠（体质量30～35 g）购买于北京斯贝福公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0010。

XOS（纯度为96.95%）、安慰剂 河南益常青生物科技有限公司；实验动物饲料 江苏省协同医药生物工程有限责任公司；无水乙醇、无水乙醚、乙酸（色谱级）、丁酸（色谱级） 国药集团化学试剂有限公司；TNF-α、IL-10、闭锁小带蛋白（zonula occludens-1，ZO-1）、紧密连接蛋白Occludin和D-乳酸（D-lactic acid，D-LA）酶联免疫吸附试验试剂盒 南京森贝佳公司；粪便DNA提取试剂盒 美国Omega Bio-tek公司。

1.2 仪器与设备

JXFSTPRP-L型全自动样品快速研磨仪 上海净信公司；Mastercycle nexus GSX1聚合酶链式反应扩增仪 德国Eppendorf公司；NovaSeq高通量测序仪 美国Illumina公司；AU5800 Clinical Chemistry System全自动生化分析仪美国Beckman Coulter公司；GC-2010PLUS气相色谱仪（配有全自动液体/顶空进样器和氢火焰离子化检测器） 日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 临床试验对象的筛选

1.3.1.1 伦理审查及研究对象

实验依据江南大学食品学院和江南大学附属医院伦理委员会的要求，撰写伦理审查报告，报送至伦理委员会审议通过（伦理审查批号为LS2019030）。以2019年6ü12月在江南大学附属医院消化内科门诊诊断有慢性腹泻症状的患者作为研究对象。

1.3.1.2 纳入标准

1）符合慢性腹泻根据罗马IV的诊断标准[13]：a）病程4周～2.5 年，平均（3.5f2.6）个月；b）有排便急迫感、排便频率每日大于3 次，排便后腹部症状有所缓解；c）粪便性质稀薄（粪便性状主要为Bristol5、6、7型）；d）平均最大腹痛严重程度为≥4。2）就诊前已通过相关检查确定无胃肠道等器官病变。3）慢性腹泻非继发于其他疾病。4）年龄≥18 岁。5）研究前至少一周内没有进行相关治疗以及没有同时参加其他临床研究。6）自愿参加本课题研究，签署知情同意书并获得医学伦理委员会的批准。

1.3.1.3 排除标准

1）检查发现为炎症性肠病患者；2）患有I型或II型糖尿病、甲状腺功能异常、严重抑郁症、自身免疫性疾病、有癌症或胃肠手术史、药物或酒精滥用史、精神疾病史、严重传染病等；3）近3 个月内服用抗生素3 d以上，或长期服用益生菌制品（包括食用酸奶和益生菌饮料）；4）腹泻时有黑便、脂肪便、黏液便或血便，腹泻时伴有发热症状；5）近3 个月内做过胃肠镜或其他肠道手术；6）对研究产品过敏的个体、孕妇、备孕期间的女性或哺乳期女性。

1.3.1.4 研究对象剔除和脱落

研究过程中服用抗生素、益生菌、结肠清洁药物等3 d或以上；依从性差，未能遵循医嘱治疗或在本课题研究期间参了加其他临床研究；中途自行退出本课题研究；因各种原因失访等。以上原因会使得研究对象被剔除。

1.3.2 临床试验对象分组与干预

本研究中慢性腹泻患者随机分为对照组（CK）、低剂量干预组（3X）、高剂量干预组（6X），其中CK组7 人，3X组8 人，6X组7 人，各组患者的基本信息均无明显差异（表1），干预周期为30 d。每位患者入组后，由另外的工作人员（非研究人员）发放XOS或安慰剂。安慰剂主要含有糊精和少量的葡萄糖、麦芽糖。XOS和安慰剂均为白色或微黄色粉末，味微甜，均使用不透明无标识包装袋密封包装。对照组患者每人每天服用3 g安慰剂；低剂量干预组患者每人每天服用3 g XOS；高剂量干预组患者每人每天服用6 g XOS，每日晚餐后服用。每组患者在初入组（干预前）和干预结束时接受粪便和静脉血样采集，采集时询问患者饮食、运动、排便情况，干预过程中跟踪每位患者的动态（是否服用XOS/安慰剂、是否有不良反应、是否摄入抗生素）。入组患者和研究人员在整个干预期间保持双盲状态直到数据分析。

表1 各组患者的基本信息Table 1 Basic information of three groups of patients

1.3.3 临床指标检测

1.3.3.1 问卷调查评分

由患者个人在干预前和干预结束后根据腹痛症状、粪便形状、胃口、排便次数、睡眠、口气6 个方面进行0～3 分的程度评分，评分越高，症状越严重。

1.3.3.2 血清生化指标检测

收集每位患者在干预前和干预后的静脉血于惰性分离胶/促凝管，每管抽取约3～4 mL的血液并充分混匀，采用1 500hg、20 ℃，10 min的程序及时离心，随后将血清分装到0.5 mL离心管中。干预前后临床样本血清中总胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）在全自动生化分析仪上检测。

1.3.3.3 粪便中短链脂肪酸测定

粪便中SCFAs的提取和分析方法参考文献[14]。称取冻干后的50 mg粪便，用500 µL饱和NaCl溶液重悬，加入40 µL 10%（质量分数）H2SO4酸化；加入1 000 µL无水乙醚，振荡混匀，提取脂肪酸，然后12 000 r/min离心15 min；取上层乙醚相，加入0.25 g无水硫酸钠进行干燥；静置15 min后，12 000 r/min离心15 min，取上层乙醚相，装入气相小瓶中。采用气相色谱法进行分析，根据标准品溶液含量通过外标法计算各样品中乙酸和丁酸的含量。

1.3.3.4 粪便中总DNA的提取、扩增、测序

收集每位入组患者干预开始前和干预结束后的粪便样本，冷冻保存在－80 ℃冰箱中，最后放置在干冰中运输至上海宏序生物信息公司（中国）进行DNA提取、扩增、测序。

1.3.3.5 生物信息分析流程

为了提高分析结果的质量，在序列充足的同时，也要保证序列的质量，因此，分析前要先对原始数据进行过滤处理，得到优化序列。然后在去除嵌合体序列后进行操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）聚类分析，对OTU的代表序列作分类学分析。基于OTU聚类分析结果，可以对OTU进行多种多样性指数分析，也可进行一系列群落结构变化的可视性分析。

线性判别分析（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）即LDA Effect Size，是寻找组间存在统计学差异的关键物种的方法。通过对标记出的组间特征物种丰度进行统计学分析，筛选出具有统计学差异的物种，再进行组间分析而得到不同水平的具有显著性差异的物种。

1.3.4 粪菌移植小鼠实验

采集临床试验患者干预30 d后的粪便样品，置于灭菌的粪便采集管中。将每组患者的粪便混合后溶于0.01 mol/L、pH 7.2磷酸盐缓冲液中，制成200 mg/mL的FMT混悬液。剩下的样品冻藏于－80 ℃冰箱。6周龄雄性SPF级的昆明小鼠饲养于江南大学实验动物中心SPF级屏障设施中。小鼠随机分为对照组（F-CK）、低剂量干预组（F-3X）、高剂量干预组（F-6X），每组6只，每只小鼠每日灌胃0.3 mL对应组别患者的FMT混悬液，共灌胃24 d。动物实验伦理审查批号为JN.No20191230k0600630。

1.3.5 小鼠组织样本采集

FMT混悬液共灌胃24 d，实验第25天小鼠禁食12 h，眼眶取血后（室温静置2 h）血液于冷冻离心机中4 ℃、2 000 r/min条件下离心15 min，收集血清并分装。小鼠采用颈椎脱臼法处死后，迅速解剖取出结肠、盲肠。其余组织脏器分装后，保存在－80 ℃冰箱中备用。

1.3.6 小鼠结肠组织匀浆液细胞因子的测定

将小鼠结肠里的内容物清理干净，取0.1 g结肠组织，剪碎后置于2 mL的无酶离心管，加入2 颗氧化锆珠和1 mL的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂），放入组织研磨仪中以65 Hz研磨45 s，研磨3 次至结肠组织呈流状。结肠组织破碎完全后，在4 ℃、2 000 r/min条件下离心30 min。离心完成后取上清液作为待测样本。全程冰浴操作，组织研磨仪的研磨模具需提前放入4 ℃冰箱中预冷。采用相应酶联免疫吸附试验试剂盒检测TNF-α、IL-10、ZO-1、Occludin和D-LA水平，总蛋白含量用考马斯亮蓝法进行测定。

1.4 数据处理与分析

实验结果采用平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析和作图。采用单因素方差分析比较组间差异，采用t检验进行显著性分析，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著，P＜0.001表示差异高度显著。

2 结果与分析

2.1 患者腹泻症状评分变化

最终符合标准的慢性腹泻患者中，CK组随机分入7 人，3X组随机分入8 人，6X组随机分入7 人。在共计4周的干预过程中，3X组有1 人中途退出、6X组有1 人因服用了抗生素而被剔除，最后CK组7 人，3X组7 人，6X组6 人，共计20 人完成干预并计入最终分析。

根据干预前后的腹泻症状评分（图1），发现3X组和6X组在干预后的腹泻症状评分均显著下降（P＜0.05），安慰剂CK组也有下降，但无显著性差异。故初步判断XOS的干预使得腹泻症状有所减轻。

图1 干预前后患者腹泻症状评分的变化Fig. 1 Changes in diarrhea symptom score of patients before and after intervention

2.2 患者血清生化指标变化

脂质代谢紊乱与肠道菌群失调密切相关，这种相关性腹泻可能是因为过量脂肪酸刺激肠道造成的[15]，而TC、TG与脂肪酸的调节密切相关。陈丽雄等[16]等研究发现饲喂黄芪多糖后，繁殖猕猴的腹泻数量下降，血清TC浓度从（2.60f0.88）mmol/L升至（2.91f0.58）mmol/L（P＞0.05）。何萍等[17]采用黄连素治疗伴高脂血症的腹泻患者，干预后患者血清TG含量降低。如图2所示，经过干预，CK组TC和TG浓度变化较小，XOS干预组TC浓度有升高趋势，TG浓度呈下降趋势，干预前后均无显著性差异（P＞0.05），推测XOS有改善慢性腹泻患者脂代谢的效果，但效果不显著（P＞0.05）。

图2 干预前后患者血清TC（A）和TG（B）浓度的变化Fig. 2 Changes in serum total cholesterol (A) and triglycerides (B)levels of patients before and after intervention

2.3 患者粪便短链脂肪酸含量变化

短链脂肪酸作为肠道菌群主要的代谢产物之一，对宿主代谢有重要的调节作用。普遍研究认为短链脂肪酸对宿主代谢的影响利大于弊，但一些特定情况下短链脂肪酸产量过高会危害宿主[18]。对患者干预前后的粪便短链脂肪酸进行分析，如图3所示，XOS进行干预后，粪便中丁酸含量有上升趋势，乙酸含量有下降趋势，但均无显著性差异。作为肠上皮细胞能量来源，丁酸可以满足结肠黏膜上皮细胞的能量供给需要。而干预前患者的乙酸含量高于干预后，可能原因为慢性腹泻患者肠道内发酵异常导致乙酸含量升高[19]。Ringel-Kulka等[20]研究发现肠内气体增加和肠腔内pH值降低可能与腹痛症状产生有关，表明慢性腹泻患者可能存在乙酸吸收障碍。

图3 干预前后患者粪便中乙酸（A）和丁酸（B）含量的变化Fig. 3 The changes in acetic acid (A) and butyric acid (B) contents in feces of the patients before and after intervention

2.4 患者肠道菌群分析结果

2.4.1 肠道菌群的α多样性变化

α多样性通常表征肠道菌群的数量、种类、均匀度及进化关系，常用Shannon指数、Simpson指数进行表征。XOS对慢性腹泻患者肠道菌群α多样性的影响如图4所示。其中Shannon指数越大表明群落多样性和丰度越高。CK组在干预前后两个阶段的结果相近，未发生较大改变，而3X和6X组有较明显变化趋势。慢性腹泻患者在XOS干预之后的肠道菌群多样性增加，说明XOS有抑制腹泻患者肠道菌群进一步失调的可能。

图4 干预前后患者肠道菌群α多样性指数的变化Fig. 4 Change in α diversity index of gut microbiota in patients before and after intervention

2.4.2 患者肠道菌群变化

如图5A所示，在门水平上3 组患者肠道菌群仍以Firmicutes（厚壁菌门）、Bacteroidetes（拟杆菌门）、Actinobacteriota（放线菌门）以及Proteobacteria（变形菌门）为优势菌门，不同个体间的各菌门的相对丰度存在一定差异。经过XOS干预后，3X组和6X组肠道中Firmicutes/Bacteroidetes比例提高，安慰剂干预后CK组反而上升。在对乳糜泻儿童的研究中，将短双歧杆菌作为饮食添加剂3 个月后，宿主体内Firmicutes/Bacteroidetes的比例从减少到恢复，Actinobacteria相对丰度增加，肠道菌群结构相对稳定[21]，与3X组的结果类似。在属水平上，干预后3X组中Blautia、Megamonas、Bifidobacterium、Lachnospiraceae_unclassified相对丰度增加，Subdoligranulum相对丰度减小；干预后6X组中Blautia相对丰度增加，Escherichia-Shigella、Prevotella、Ruminococcus_gnavus_group相对丰度减小。Prevotella是人肠道微生物三大肠型代表菌之一，同时也是人肠道微生物的核心菌属之一。相对研究表明，Blautia具有抗炎作用[22]，Ruminococcus_gnavus_group在炎症性肠病患者肠道中富集[23]，Bifidobacterium作为益生菌可以调节肠内环境，由此可知，XOS可以增加肠道内的有益菌相对丰度，减少致病菌相对丰度，调节肠道微生态。

如图5B、C所示，根据LEfSe结果计算lg LDA值并绘制分布柱状图，LDA值表示差异物种的影响程度，故物种的影响越大，对应直方柱的长度越长。3X组干预前的关键物种有Peptostreptococcaceae，6X组干预前的关键物种为Lachnospira；3X组干预后的关键物种有Actinobacteriota、Solobacterium、Mogibacterium、Saccharimonadales、Patescibacteria、Saccharimonadia、Abiotrophia，共7 个；6X组干预后的关键物种为Romboutsia。相关研究表明，厚壁菌门中Solobacterium显示与结直肠癌风险降低相关[24]，Peptostreptococcaceae是与炎症相关的物种[25]，Actinobacteriota作为产丁酸盐物种可以减轻结肠炎症[26]，Romboutsia与益生菌引起的肠道变化有关，有益生作用，可减轻大鼠的急性胰腺炎症状[27]。综上所述，推测XOS可以通过调节肠道菌群来缓解结肠炎症。

图5 干预前后患者肠道菌群在门、属水平的组成和LEfSe结果Fig. 5 Composition of gut microbiota in patients in different groups at phylum and genus level and LEfSe analysis

2.5 粪菌移植小鼠肠道通透性变化

D-LA是细菌发酵的代谢产物，当肠道屏障功能发生损伤时，肠道通透性增加，肠道黏膜绒毛上皮脱落，肠道细菌产生的大量D-LA通过受损黏膜，导致血清D-LA水平升高。与F-CK组相比，F-6X组血清中D-LA水平极显著降低（图6A）（P＜0.01），肠道通透性和损伤程度相比于F-CK组有所缓解，并且高剂量组干预效果更好。

紧密连接位于上皮细胞顶层及侧边的膜表面，形成细胞旁路密封层，可以调节离子、溶剂的进出，并维持细胞极性。对于维持肠道屏障完整性，细胞间的紧密连接和肠道黏液发挥了重要作用。而肠道屏障完整性缺失导致细菌抗原易位增加，刺激肠道黏膜的炎症反应[28]。FMT小鼠结肠匀浆液中Occludin和ZO-1含量如图6B、C所示。与F-CK组相比，F-3X和F-6X的ZO-1和Occludin含量有所增加，其中F-3X的ZO-1的含量显著上升（P＜0.05），Occludin含量有增加趋势（P＞0.05）。研究表明，肠道屏障功能相关蛋白ZO-1、Occludin的表达增加时会改善肠道屏障[29]。Yin Jie等[30]研究发现仔猪经XOS饲喂后，回肠中ZO-1表达量增加，肠黏膜通透性趋于正常，进一步说明XOS能使肠道黏膜功能和生物屏障趋于稳定状态。

图6 小鼠肠道通透性水平Fig. 6 Intestinal permeability level of mice

2.6 粪菌移植小鼠结肠炎症因子变化

腹泻患者体内的炎症因子水平可以体现出腹泻症状的严重程度，例如可调节肠道炎症及严重程度[31]的TNF-α。IL-10作为抗炎因子，可下调菌群定植介导产生的黏膜炎症因子[32]。血管生成素（angiopoiet，Ang）是一种肠道分泌的抗菌肽，浙江大学一院研究团队发现Ang1可以调节肠道菌群平衡，维持肠道稳态，缓解结肠炎症[33]。故本实验结合3 种细胞因子的水平进行综合分析，判断FMT小鼠的肠道炎症因子水平。

FMT小鼠的结肠炎症因子水平的影响如图7所示。与F-CK组相比，F-3X、F-6X组小鼠的结肠IL-10含量显著增加（P＜0.01、P＜0.05）；Ang1质量浓度从（33.37f11.43）pg/mL分别增加至（71.14f22.91）、（57.03f20.72）pg/mL；TNF-α含量明显下降，F-CK组与F-3X组差异显著（P＜0.05）。由此可知，接受FMT后的小鼠肠道轻度炎症得到缓解，其中F-3X组的改善效果更明显。

图7 小鼠结肠炎症因子水平Fig. 7 Inflammatory factor contents in colon tissue of mice

3 结 论

本研究探讨了XOS对慢性腹泻的干预作用。摄入XOS后，腹泻患者的腹泻症状评分下降，脂代谢水平改善，粪便中丁酸含量增加，肠道菌群多样性增加，有益菌的相对丰度增加，致病菌相对丰度减小。随后将XOS干预后患者的粪菌液灌胃小鼠，发现小鼠的肠道屏障稳态趋于稳定，与F-CK组相比，F-3X、F-6X组小鼠结肠中IL-10和Ang1水平明显增加，TNF-α含量明显下降，轻微炎症症状被缓解，肠道通透性相关指标D-LA质量浓度显著降低（P＜0.05、P＜0.01），紧密连接蛋白ZO-1的表达水平明显上升，Occludin含量有增加趋势（P＞0.05）。上述结果表明，XOS可以维持人体肠道屏障趋于稳定状态，下调结肠炎症水平，患者每天摄入3 g XOS对慢性腹泻的改善效果相对更好。本研究为慢性腹泻症状治疗和预防打开新的思路，然而对具体的代谢产物和通路的确认还需运用代谢组学进行深入研究。